Ci sono molti che hanno contribuito a questo lavoro e la maggior parte sono della membrana Biologia Strutturale e Funzionale del Gruppo, sia i membri passati e presenti. A tutti rivolgiamo i nostri più sentiti ringraziamenti e apprezzamento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), il National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e 7 ° PQ CM0902 Azione COST.

1. Preparazione della piastra di cristallizzazione Impostazione di fare un processo di cristallizzazione robot inizia con la preparazione della piastra di base della piastra di cristallizzazione vetro sandwich (Figura 2), descritti in dettaglio in riferimento 2. La piastra di base deve prima essere silanizzata e il perforato doppio bastone distanziatore che crea i pozzetti, deve essere applicata alla piastra. I materiali e le forniture necessarie per questo sono dettagliati in Materiali. <ol><li> Posizionare la piastra su un tovagliolo di carta, applicare alcune gocce di soluzione di silanizzazione e distribuirlo uniformemente su tutta la superficie della piastra con un fazzoletto di carta. </li><li> Togliere l&#39;eccesso di soluzione silanizzazione immergendo la lastra in un bicchiere d&#39;acqua. </li><li> Prendere la piastra di fuori del bicchiere, posarlo su un tovagliolo di carta asciutto, lato silanizzata, e asciugare la superficie esposta strofinando leggermente con un tovagliolo di carta. </li><li> Rimuovere la pellicola protettiva sul forato, doppio bastone distanziatoree applicare il, lato adesivo distanziatore verso il basso, alla superficie asciutta e silanizzata della lastra di vetro. Assicurarsi che il distanziale è posizionata correttamente sulla piastra di base, con l&#39;angolo superiore sinistro e due lati adiacenti del distanziale e la piastra, coincidente. </li><li> Utilizzare un rullo o brayer di appiattire il distanziatore sul basamento e creare una chiusura a tenuta tra loro. </li></ol> Premontati piastre sono disponibili in commercio (HR3-151, Hampton Ricerca; MD11-55-100, dimensioni molecolari e LCP96T-UVP70U, Swissci). Per ragioni di costo, si preferisce montare i piatti stessi seguendo il protocollo sopra. 2. Nel Meso Robot 1 Il primo robot meso essere dimostrata in questo articolo video è quello attualmente in uso nella MS e FB Group (Figura 3). I dettagli completi del robot può essere trovato in Materiali e nella sezione di riferimento 5. I materiali e equipment tenuti a istituire un processo di cristallizzazione uso del robot sono riportati in dettaglio Materiali. <ol><li> Posizionare la piastra di base con distanziale preparato in sezione 1 sul ponte del robot. Essa ha una propria piattaforma contrassegnati con posizioni anche per finalità di base piastra di allineamento. La piastra deve essere etichettati per l&#39;identificazione. </li><li> Fissare il blocco a 96 pozzetti precipitante nella propria piattaforma sul ponte del robot vicino alla piastra cristallizzazione. </li><li> Aprire il blocco con attenzione da staccando il tappo di plastica di chiusura. </li><li> Accendere l&#39;umidificatore e dirigere il flusso di aria umida sopra e attraverso il basamento sul ponte del robot. L&#39;umidificatore è stato dimostrato per ridurre l&#39;evaporazione della soluzione precipitante e migliorare la riproducibilità tra la piastra 5 cristallizzazione. Può essere attivata prima di set-up pre-umidificare l&#39;ambiente zona quando l&#39;umidità relativa è bassa, o in altro modo, poco prima della somministrazione di mesofase inizio. </li><li> Inizializzare il robot seguendo le istruzioni del produttore. Istruzioni specifiche dello strumento non sarà descritto qui in dettaglio, perché le procedure esatte cambiano nel tempo. Essenzialmente, ciò che accade durante l&#39;inizializzazione è che l&#39;erogazione mesofase braccio del robot è dotato di posizioni di riferimento in tre direzioni ortogonali X, Y e Z. </li><li> Fissare la proteina-carico mesofase in una siringa Hamilton, completo di erogazione ago, a braccio 1 del robot (Figura 3). Tutti i dettagli su come preparare il mesofase e come caricarlo nella siringa sono stati descritti in Riferimenti 3,7-10. </li><li> Rimuovere il coperchio di protezione superiore dal distanziale sulla cristallizzazione basamento e allineare i pozzetti sulla piastra con fiducial sulla piastra base piattaforma. Nota, ai fini di questo video, il coperchio di protezione è stato lasciato sul posto per aiutare il visualizzatore durante la fase di allineamento. </li><li> Allineare la punta dell&#39;ago della syring erogazionee con il fondo del pozzo alto nell&#39;angolo sinistro della piastra di cristallizzazione (Well A1). Questo viene fatto occhio regolare l&#39;altezza o coordinata Z del braccio di erogazione mentre si guarda come chiudere la punta dell&#39;ago viene al fondo del pozzo. Che la punta si sfiora il fondo del pozzo può essere giudicato spostando la piastra da lato a lato sulla piattaforma pur sempre leggermente regolare l&#39;altezza del braccio di erogazione. </li><li> Inserire nel computer la coordinata Z del braccio di distribuzione in cui i contatti punta il piatto. Erogazione è programmata per avvenire con la punta dell&#39;ago 80 micrometri da questo riferimento Z-posizione che corrisponde alla superficie della piastra di base. </li><li> Posizione dell&#39;occhio la punta dell&#39;ago al centro del Well A1. Conservare nel computer di controllo del riferimento X, coordinata Y del braccio di erogazione in cui è centrata la punta. Questo coordinate viene utilizzato per definire il centro rimanenti pozzetti sulla piastra. </li><li> Prime la siringa con il comando appropriato nel computer robot affinché mesofase fresca riempie l&#39;ago di erogazione e che i pozzetti prima e le successive ricevono il loro complemento completo di mesofase. Pulire mesofase estruso sulla punta dell&#39;ago con un fazzoletto. </li><li> Avviare il Run Robot (X-AP) programma di avviare un ciclo di lavaggio passaggi in cui vengono lavati i suggerimenti precipitanti di erogazione sul braccio 2 del robot e sono pronti per aspirare le soluzioni dal blocco precipitante. </li><li> Attivare la funzione di distribuzione del robot per mettere in moto il caricamento sequenziale di pozzi con proteina-mesofase carico (di solito 50 nl) prima, una colonna di otto pozzi alla volta, seguita da soluzioni precipitanti (generalmente 800 nl). Tra colonne di carico, i rendimenti erogazione braccio mesofase ad una posizione di parcheggio dove si trova l&#39;estremità dell&#39;ago in una spugnetta umida per impedire mesofase sulla punta si secchi. Il processo di erogazione mesofase e precipitante viene ripetuto11 volte attraverso la piastra finché la piastra viene riempito. Il caricamento di una piastra a 96 pozzetti con mesofase e precipitante prende 5 minuti per completare. </li><li> Non appena la piastra viene riempito e le braccia del robot sono ritornati nelle loro posizioni parco, rimuovere la piastra dal ponte del robot e posizionarlo su una superficie piana solida. </li><li> Immediatamente, sigillare la piastra con un coperchio di vetro per ridurre il tempo-dipendenti cambiamenti nella composizione ben. È importante garantire che tutti i 96 pozzetti sono integralmente coperti, che il coperchio di vetro è allineato quadrata con la piastra di base e che nessuno dei coprioggetti estende oltre l&#39;ingombro del basamento. Un rullo o brayer viene utilizzato per creare una tenuta e una tenuta uniforme tra il coperchio di vetro e il distanziale. </li><li> Controllare la piastra per essere sicuri che il set up è andato come dovrebbe. Ciò che si è alla ricerca di un &#39;uovo fritto in padella&#39; aspetto in ogni pozzetto. Il tuorlo di uovo fritto corrisponde al mesofase. Il bianco dell&#39;uovo è la soluzione molto precipitantee sul bordo della padella è il perimetro della cristallizzazione bene. Idealmente, i tre sono concentrici. </li><li> Porre la piastra in una temperatura controllata deposito per la crescita di cristalli. </li><li> Se non ci sono più le piastre da istituire, rimuovere il blocco precipitato dal ponte del robot, che sigilla ermeticamente e rimetterlo in deposito. </li><li> Rimuovere la siringa contenente il mesofase dal braccio di erogazione del robot, smontare e lavare le sue parti compresi dell&#39;ago erogatore e boccola, accuratamente con metanolo ed asciutto in preparazione per l&#39;uso successivo. </li></ol> 3. Nel Meso Robot 2. Mosquito LCP Il Mosquito LCP robot (Figura 4) comprende un distributore mesofase simile a quello utilizzato dal robot 1. In contrasto con Robot 1, eroga precipitante per mezzo di puntali monouso. Software di programmazione viene utilizzato per impostare lo strumento per lavorare con piatti particolari e cristallizzazione precipitblocchi di formica, e di dispensare volumi definiti dall&#39;utente di mesofase e precipitante in una sequenza specificata. Tali dettagli sono forniti dal produttore e non verrà qui descritto. <ol><li> Preparare una siringa Hamilton, completo di ago e riempito con proteina-carico mesofase, come descritto sopra in Robot 1 e all&#39;articolo JoVE 1712 1. </li><li> Fissare la siringa in posizione sul braccio del robot di erogazione. </li><li> Utilizzare la piattaforma ha montato sensore laser per stabilire le coordinate X e Y del dell&#39;ago sulla siringa di erogazione. Questo è un importante passo necessario per assicurare che la mesofase viene erogato con precisione al centro di ciascun pozzetto della piastra. </li><li> Con il tocco di un pulsante sul pannello di controllo, adescare la siringa per espellere mesofase dall&#39;ago. Rimuovere mesofase estruso dalla punta dell&#39;ago con un tessuto in preparazione per l&#39;utilizzo del robot per caricare pozzi. </li><li> Prima di posizionare la piastra di cristallizzazione sul ponte del umida roboten la superficie della piattaforma con qualche goccia d&#39;acqua per aiutare a tenere la piastra in posizione per capillarità. </li><li> Togliere il coperchio di protezione dal distanziale sul vetro piastra di base e metterlo sulla sua piattaforma con decisione per garantire una buona aderenza. Utilizzare i tre fiducial sulla piattaforma per allineare i tre pozzetti angolari assicurando così il corretto posizionamento dei pozzetti sulla piastra rispetto alla punta dell&#39;ago erogatore. Lo strumento è comandato per immettere un ciclo di erogazione. </li><li> Il ciclo inizia con una fase di caricamento, secondo cui viene erogata mesofase su una piastra di vetro immediatamente prima di passare a caricare pozzetti con mesofase fresca. I carichi primo robot con mesofase una colonna verticale di 8 pozzetti sulla piastra e poi usa le punte monouso per erogare la soluzione precipitante in cima al bolo mesofase. Il processo viene ripetuto 11 volte lungo la lunghezza della piastra finché tutti i pozzetti vengono riempiti. L&#39;intero processo dura circa 5 minuti per essere completato. </li><li> Rimuoverela piastra riempito dalla piattaforma del robot e sigillarlo con un coperchio di vetro come descritto sopra in Robot 1. </li><li> Posizionare la piastra, etichettati, in un ambiente a temperatura controllata per la crescita di cristalli. </li></ol> 4. Nel Meso Robot 3. Gryphon LCP Il Gryphon LCP robot (Figura 5) incorpora un sistema simile mesofase erogazione a quello sopra descritto per robot 1 e 2. Ciò che distingue dalle altre due è che tutte le soluzioni precipitanti 96 vengono dispensate simultaneamente. <ol><li> Preparare la proteina-carico mesofase e caricarlo nella siringa di erogazione, come descritto sopra, sotto Robots 1 e 2, e all&#39;articolo JoVE 1712 1. </li><li> Fissare la siringa in posizione sul braccio del robot di erogazione. </li><li> Posizionare il blocco di soluzione precipitante e piastra cristallizzazione sul ponte del robot. </li><li> Caricare il 96-punta head con soluzioni precipitanti. Definito dall&#39;utente tempo di ritardo è prevista per facilitare l&#39;aspirazione precipitanti viscosi. </li><li> Comandare lo strumento per immettere un ciclo di erogazione. Il ciclo inizia con la mesofase erogato sequenzialmente nei 96 pozzetti in un processo che richiede circa 1 minuto per completare. Il 96-tip testa eroga quindi tutti 96 soluzioni precipitanti immediatamente sopra i boli mesofase nei pozzetti di cristallizzazione. L&#39;intero processo di caricamento delle lastre è finito in 2 min. </li><li> Rimuovere la piastra riempito dalla piattaforma del robot e sigillarlo con un coperchio di vetro come descritto sopra in Robot 1. </li><li> Posizionare la piastra, etichettati, in un ambiente a temperatura controllata per la crescita di cristalli. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Lo scopo di questo articolo il video è quello di dimostrare come impostare automaticamente le prove di cristallizzazione con un viscoso, proteine ​​di membrana-carico mesofase in vetro sandwich 96 pozzetti cristallizzazione piastre. L&#39;enfasi è sulla automazione attraverso l&#39;uso di robot specializzati che richiedono un minimo intervento manuale. Riproducibilità e precisione, in termini di volumi di mesofase e precipitante erogato e il posizionamento all&#39;interno del pozzo, è previsto quando viene utilizzato un robot. Questi sono importanti dal punto di vista di screening efficace delle condizioni che supportano crystallogenesis. Sono anche critico per il passo successivo nella pipeline di analisi che è di valutare la crescita di cristalli spesso fatto con apparecchiature di imaging. Destinazione finale o bolo è la chiave per il processo di imaging, e la disposizione irregolare e improprio del bolo nel pozzo di solito richiede l&#39;intervento dell&#39;utente per correggere e richiede tempo. Per scopi di illustrazione, esempi di lastre adeguatamente e correttamente caricati sono mostrati in Figura 6. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <html> Figura 1. Il diagramma di flusso sintetizza i passaggi necessari per la raccolta di produzione, e la crio-raffreddamento in cristalli membrana meso-coltivate proteine. Passi circondato dalla linea tratteggiata rossa sono al centro di questo articolo JoVE. I robot sono stati utilizzati per erogare soluzioni mesofase e precipitante nei passaggi 29-32. Da riferimento 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A pieno carico e sigillato a 96 pozzetti a piastra di vetro cristallizzazione. Ogni pozzetto contiene 50 fase cubica nl e 1 ul di soluzione precipitante. Per chiarezza, la fase cubica è stato macchiato con il Sudan rosso e la soluzione precipitante include blu di metilene. Da riferimento 5. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. La meso in robot (Robot 1). Il robot è dotato di due braccia. Braccio 1 dispensa la proteina carica di mesofase lipidico. Braccio 2 eroga soluzioni precipitanti. Durante il riempimento, la piastra a 96 pozzetti rimane fissato in posizione sul ponte del robot che si è stazionario. Le due braccia si muovono per fornire soluzioni mesofase e precipitante. Da riferimento 3. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La zanzara LCP robot (Robot 2). In contrasto Robot 1, il ponte del LCP Mosquito, su cui siede la piastra a 96 pozzetti e il blocco di soluzione precipitante, si sposta orizzontalmente durante il riempimento. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Il Gryphon LCP robot (Robot 3). Durante unaistituito, il distributore lipidico fase cubica si sposta per fornire proteine ​​carico mesofase sulla piastra a 96 pozzetti. Il ponte si traduce poi in orizzontale per posizionare la piastra sotto la testa precipitante punta soluzione. Tutte le soluzioni precipitanti 96 vengono dispensate simultaneamente. Immagine proveniente dal produttore ( <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) ed etichettati. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. A pieno carico e sigillato piastra a 96 pozzetti a sandwich di vetro (A) e pozzetti correttamente (B) e impropriamente (C, D) riempito con il meso in robot (Robot 1). L&#39;etichetta del codice a barre sulla piastra in A viene utilizzato per tenere traccia la piastra del dispositivo piastra incubatore / immagini. In pannelli BD, soluzione precipitante e mesofase sono contrassegnati P ed M, rispettivamente. L&#39;atteso &#39;uovo fritto su un piatto&#39;aspetto del bene in B è caratteristica di un correttamente e sigillato bene. In C, il precipitante è stato erogato nel pozzo impropriamente in una posizione decentrata ed è entrato in contatto con il distanziatore. In C, sembrerebbe anche che il volume della mesofase è meno di quanto dovrebbe essere. Un esempio di carico incompleta con soluzione precipitante è mostrato in D. Per scala, il diametro di tutti i pozzetti è di 6 mm.

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	<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501 (2011).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallization.">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li><li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II:+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping.">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li><li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution.">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li><li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis.">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography.">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001 (2012).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo video che abbiamo dimostrato come utilizzare un robot per impostare automaticamente in prove di cristallizzazione meso in lastre di vetro da 96 pozzetti a sandwich con una proteina-mesofase carico lipidico. I robot utilizzati in questo lavoro sono stati progettati per includere una siringa di vetro spostamento positivo per la consegna accurata e riproducibile di volumi di nanolitri mesofase viscoso e appiccicoso, come originariamente descritto 7. Accuratezza e precisione sono le caratteristiche importanti di un robot. Tuttavia, queste caratteristiche sono solo buono come il grado di regolarità e di cui viene valutato le prestazioni del robot e taratura. Inutile dire che le prestazioni del robot deve essere valutato quando singole piastre vengono costituiti. Non è corretto pensare che il robot funzionerà senza problemi e di lasciare il robot per l&#39;esecuzione automatica. L&#39;operatore attento e attento dovrebbe essere in position notare da un suono o un aspetto quando qualcosa non funziona correttamente e di correggere immediatamente. Inoltre, ogni piastra deve essere attentamente controllata da occhio per uniformità di contenuto e non appena la piastra è sigillata e prima di essere messo fuori per prove di cristallizzazione. Questo richiede solo pochi secondi per eseguire e può essere eseguita mentre la piastra successiva viene caricata. Notare, per esempio, che i pozzetti particolari non sono adeguatamente riempiti può evidenziare il fatto che una certa punta di erogazione precipitante viene malfunzionamento. Se la consegna di mesofase essere visto per essere irregolare, il relativo elemento difettoso avrebbe bisogno di essere corretti immediatamente. Da notare questi problemi e fare le relative rettifiche durante il set up farà risparmiare tempo e materiali, tra cui lipidi prezioso e proteina di membrana. Se un imager viene utilizzato per monitorare la crescita dei cristalli, l&#39;accuratezza e la precisione possono essere monitorati durante l&#39;esposizione. Ad esempio, problemi sistematici con goccia o boloposizione dalla termocamera indicano che qualcosa non è giusto e che le azioni correttive da qualche parte a monte del protocollo è necessario. Per motivi di prestazioni affidabili, pertanto il robot deve essere calibrato a intervalli regolari e, se necessario. Calibrazioni dovrebbe includere il volume di precipitante e mesofase pronunciata quanto posizionamento bolo e precipitato nel pozzo. Ovviamente, per quanto possibile, la taratura deve essere effettuata utilizzando i volumi e materiali simili a quelli che verranno utilizzati in studi condotti nel periodo di riferimento l&#39;esercizio di controllo della qualità. Importante come calibrazione è così anche sta avendo in magazzino una quantità adeguata di parti del robot e forniture. Guasti catastrofici e inaspettati, blocchi e crash possono e si verificano. In tal caso, avendo a disposizione una punta di erogazione precipitante sostituzione, per esempio, potrebbe significare che un prezioso preparazione proteina di membrana viene utilizzata come dovrebbe enon è sprecato. Alcuni dei vantaggi di un robot includono il fatto che funzionerà sostanzialmente continuo e che non soffre di o &#39;lamentare&#39; affaticamento. Un robot può essere utilizzato anche in condizioni che non sono considerati human-friendly, come al buio, in condizioni di illuminazione e di condizioni ambientali controllate, ed a temperature estreme. I robot hanno dimostrato in questo articolo sono stati tutti utilizzati in condizioni ambientali a ~ 20 ° C. Tuttavia, ci sono proteine ​​e progetti che richiedono temperature non ambientali, luce controllata 11,12 e un ossidante o un ambiente riducente 13. Tutti questi possono essere soddisfatti, con relativa facilità, quando un robot cristallizzazione viene utilizzato. In un articolo precedente video JoVE abbiamo dimostrato come prove di cristallizzazione per il metodo in meso sono impostati manualmente 1. Il volume minimo di mesofase che può essere erogato affidabile a mano è limitata by manualità la acutezza visiva e costante della persona che l&#39;impostazione dei processi. Nella nostra esperienza, i volumi di mesofase a partire da 100 nl sono facilmente gestite. Sappiamo di un laboratorio in cui il volume predefinito erogato manualmente è di circa 40 nl. Tuttavia, volumi notevolmente più piccoli sono possibili usando un robot. Separatamente, abbiamo dimostrato che i volumi mesofase a partire da 550 picolitri può fare a meno robot 14. Da quel lavoro era chiaro che miniaturizzazione dal robot è possibile che, se attuato, porterebbe ad una notevole riduzione della quantità di proteina di membrana valore necessario per effettuare un processo di cristallizzazione. In questo articolo video, tre robot disponibili in commercio sono stati utilizzati per dimostrare high-throughput cristallizzazione della proteina di membrana con mesofasi lipidiche. Il primo di questi è stato sviluppato nel gruppo MS &amp; FB basata sulla nostra esperienza impostare manualmente prove, come descritto in JoVE 1712 1. Questo è lo strumentomento abbiamo più familiarità con e la maggior parte dell&#39;attuale articolo è dedicato al suo utilizzo. Gli altri due robot erano in dimostrazione nel MS &amp; Gruppo FB al momento è stato scritto l&#39;articolo e il filmato in questione è incluso qui nell&#39;interesse di completezza. Tutti e tre i robot utilizzano molto lo stesso sistema mesofase di erogazione, la caratteristica essenziale di che è un positivo siringa di vetro spostamento 5,7. Essi differiscono significativamente più rispetto alla consegna precipitante. Robot 1 e 2 può erogare contemporaneamente precipitante in 8 pozzetti, una singola colonna su una piastra cristallizzazione alla volta. Al contrario, Robot 3 dispensa tutti i 96 soluzioni precipitanti in una singola azione. Robot 2 è l&#39;unico strumento con puntali precipitanti di erogazione. Ci sono vantaggi e svantaggi associati con i diversi strumenti che dipendono dalla particolare applicazione, questi non saranno elaborati qui. Basti dire che tutti e tre di lavoro e hanno prodotto cristalli di meproteine ​​mbrane dal metodo in meso. I passi successivi nel processo generale di determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare sono di raccogliere e di crio-cool cristalli piatti installati come descritto in questo articolo video e di registrare e di processo diffrazione di raggi X da loro. Questi argomenti sono trattati in articoli separati Giove in questa serie 1,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Componenti </td></tr><tr><td> Brayer (rullo) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Siringhe a tenuta di gas </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Vetro coprioggetti </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Lastre di vetro </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Art Robbins </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> In meso robot </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Vario </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Mosquito LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Forata a doppio bastone distanziatore nastro </td><td> Saunders Corporation (foro perforata) </td><td> su misura </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Soluzioni precipitante </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Acqua depurata </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Rain-X </td><td> Shell Car Care </td><td> 80199200 </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Siringa consigli </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (calibro 22) </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Tessuti </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Borraccia </td><td> vario </td><td> NA </td><td> Reagente </td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

Studi struttura-funzione di proteine ​​di membrana grande beneficio da avere disponibili ad alta risoluzione strutture 3-D del tipo dotato macromolecolare tramite cristallografia a raggi X (MX). Un ingrediente essenziale di MX è un rifornimento costante di diffrazione idealmente qualità cristalli. Il meso o in fase lipidica cubica (LCP) metodo per cristallizzare proteine ​​di membrana è uno dei diversi metodi disponibili per cristallizzare proteine ​​di membrana. Si fa uso di una mesofase bicontinue in cui crescere cristalli. Come metodo, ha avuto alcuni successi spettacolari in ritardo e ha attirato molta attenzione con i gruppi di ricerca ormai da molti interessati ad utilizzarlo. Una delle sfide connesse con il metodo è che il mesofase hosting è estremamente viscoso e appiccicoso, che ricorda un dentifricio di spessore. Quindi, erogazione manualmente in modo riproducibile in piccoli volumi in pozzi di cristallizzazione richiede abilità, pazienza e una mano ferma. Un protocollo per fare just che è stato sviluppato nel Membrane Strutturale e Funzionale Biologia (MS &amp; FB) Gruppo 1-3. Video Articoli Giove che descrivono il metodo sono disponibili 1,4. L&#39;approccio manuale a creare in meso studi presenta evidenti vantaggi con applicazioni speciali, quali l&#39;ottimizzazione cristallo e derivatizzazione. Ha, tuttavia soffre di essere un metodo con bassa produttività. Qui, dimostriamo un protocollo per l&#39;esecuzione di prove di cristallizzazione in meso robot. Un robot offre i vantaggi di velocità, accuratezza, precisione, miniaturizzazione e la possibilità di lavorare in continuo per lunghi periodi in quello che potrebbe essere considerato come condizioni ostili come al buio, in una atmosfera riducente o a temperature basse o alte. Un robot in meso, se usato correttamente, può migliorare notevolmente la produttività della struttura della membrana proteica e funzione di ricerca facilitando cristallizzazione, che è uno dei passi lenti nellacomplessiva struttura a pipeline determinazione. In questo articolo video, viene illustrato l&#39;utilizzo di tre robot disponibili in commercio in grado di dispensare la mesofase viscoso e appiccicoso integrale al crystallogenesis meso. Il primo robot è stato sviluppato in MS e FB Group 5,6. Gli altri due sono stati recentemente resi disponibili e sono inclusi per completezza. Una panoramica del protocollo in questo articolo è presentato in figura 1. Tutte le operazioni sono state effettuate a temperatura ambiente (~ 20 ° C) in condizioni ambiente.

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Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Qui è descritto un approccio robotico per alta produttività cristallizzazione di proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici destinati determinazione della struttura macromolecolare usando cristallografia a raggi X. Tre robot capaci di gestire la viscoso e appiccicoso proteina-carico mesofase solidale al metodo vengono introdotti.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.4K Views.  Trinity College Dublin. Qui è descritto un approccio robotico per alta produttività cristallizzazione di proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici destinati determinazione della struttura macromolecolare usando cristallografia a raggi X. Tre robot capaci di gestire la viscoso e appiccicoso proteina-carico mesofase solidale al metodo vengono introdotti.

Video: Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Ricerca

Biologia

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristallizzazione delle proteine ​​per la cristallografia a raggi X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

L'utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

L'utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine di membrana in mesofasi lipidici