We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. coltura cellulare (24-48 ore prima della trasfezione) <ol><li> 24-48 hr prima di seme trasfezione quantità sufficiente di cellule HEK293T base al numero di piastre a 96 pozzetti essere trasfettate. NOTA: Per trasfezioni coerenti, cellule piastra ad una densità sufficiente per favorire una rapida divisione, ma non essere a più del 70-90% di confluenza al momento della transfezione. </li><li> Ogni piastra a 96 pozzetti richiede 9 x 10 6 cellule (75.000 cellule per bene, e 120 pozzi per piastra per tenere conto per l&#39;utilizzo di serbatoio e pipetta multicanale). Calcolare il tempo di raddoppio delle cellule HEK293 (tipicamente ~ 20 hr), e sementi il numero appropriato di cellule per ottenere almeno 9 x 10 6 cellule al momento della trasfezione. Una piastra di coltura circolare 145 millimetri è in genere sufficiente per 3 trasfezioni 96 pozzetti, se coltivate al ~ 90% di confluenza, con ~ 10% delle cellule rimanenti per reseed una nuova piastra. </li></ol> 2. Preparazione Prima di Trasfezione _content &quot;&gt; NOTA: La preparazione dei buffer e DNA plasmidico a passo 2.0-2.2 deve essere eseguita nei giorni prima trasfezione poiché la preparazione di questi reagenti può richiedere molto tempo. <ol><li> Cloni 3&#39;UTR umani che sono compatibili con il test 3&#39;LIFE sono disponibili attraverso un archivio plasmide pubblico 30. Purificare DNA plasmidico manualmente o con robot gestione dei liquidi. Utilizzare un kit di mini-prep 96 pozzetti lisi alcalina grado trasfezione e seguire le istruzioni del produttore. Risospendere i vettori purificati a ~ 100 ng / ml per pozzetto. NOTA: Il segnale luciferasi insufficiente risulterà se la concentrazione plasmide scende al di sotto di 40 ng / ml. </li><li> Ottenere il pLIFE-miRNA vettori 30 o clone utilizzando la pipeline in Figura 1B 24. Risospendere i vettori ad una concentrazione di 500 ng / ml per ciascun miRNA e plasmidi controllo in bianco. </li><li> A causa della sensibilità delle condizioni tampone nucleofection, affinchéil volume totale di materiali (comprese le cellule transfettate e plasmidi) non supera il 10% del liquido totale in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti trasfezione. Per raggiungere questo obiettivo, concentrare il plasmide magazzino pLIFE-miRNA ad una concentrazione di almeno 500 ng / ml. </li><li> Preparare 10x lucciola luciferasi reagenti tampone (Tabella 1), e le 1x Renilla luciferasi reagenti tampone (Tabella 2), che possono essere conservati per un massimo di 6 mesi. NOTA: Il DTT nel buffer luciferasi di lucciola deve essere conservato in soluzione a -20 ° C in aliquote uso singoli. </li></ol> 3. Preparare punti seguenti Immediatamente prima Trasfezione <ol><li> Preparare tampone trasfezione contenente PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Preparare questo fresco, anche se può essere conservata fino a 1 mese a 4 ° C senza diminuzioni notevoli in termini di efficienza di trasfezione. Nel formulare i volumi tampone e plasmide DNA, assumere 120 reazioni per ogni piastra a 96 pozzetti a sufficiently tenere conto di errori di pipettaggio e volume perso con serbatoi di liquidi e pipette multicanale. Aliquota 18 microlitri per buffer trasfezione bene (120 pozzi / 96 pozzetti = 2,16 ml per piastra), e mettere da parte. NOTA: Il dispositivo cellulare elettroporazione è estremamente sensibile alle condizioni di buffer utilizzati per trasfettare cellule. Precisione quando i buffer preparazione garantiranno prestazioni costanti dell&#39;apparecchiatura. La cura supplementare deve essere presa quando si esegue il test per evitare l&#39;evaporazione di buffer, in particolare riducendo al minimo il tempo che buffer viene lasciato scoperto in tubi microcentrifuga, piastre a 96 pozzetti, serbatoi, e piastre di elettrodi. </li><li> Riserva quattro pozzi per i seguenti controlli, no pLIFE-3&#39;UTR (per misurare sfondo di test luciferasi), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (controllo di destinazione negativo), controllo positivo per miRNA # 1, controllo positivo per miRNA # 2. ATTENZIONE: Questi vettori sono pubblicamente disponibili 30. In alternativa, qualsiasi obiettivo precedentemente convalidatopuò essere utilizzato come controllo positivo. </li><li> Media caldi, tripsina (0,25%) a 37 ° C. </li><li> Per ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti di coltura cellulare, aggiungere 200 ml di DMEM supplementato con 10% FBS, 1% Pen / Strep, e posto in un incubatore a 37 ° per uso seguente trasfezione. </li><li> Accendere tutti i dispositivi di elettroporazione cellule seguiti dal software di supporto. Usa il codice di impulsi FF120 per HEK293T cellule e PBS / HEPES. </li></ol> 4. Preparazione di DNA plasmidico e miscela di cellule NOTA: Il seguente protocollo assume trasfettando tre piastre da 96 pozzetti in un esperimento per uno schermo con due miRNA (miRNA- # 1 e # 2 miRNA-). Ogni piatto sarà conforme a la stessa piastra a 96 pozzetti di plasmidi pLIFE-3&#39;UTR, ed essere trattati per tre volte con pLIFE-miRNA-vuoto, pLIFE-miRNA- # 1, o pLIFE-miRNA- # 2. <ol><li> Preparare 3 scorte di tampone trasfezione pLIFE-miRNA + per ogni miRNA. Questa azione dovrebbe rappresentare il 50% (10 ml) del volume totale di ognibene, moltiplicato per 120 pozzi. Così, ogni azione deve contenere 1,08 ml tampone + 120 microlitri DNA plasmide (pLIFE-miRNA). </li><li> Rimuovere le cellule da 145 mm Piastra cultura eluendo media, lavare delicatamente con PBS, e trattando con 5 ml ~ 0,25% tripsina per 5 min a 37 ° C. Neutralizzare tripsina con un volume uguale di supporto, e le cellule pellet a 300 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere tripsina / media, e risospendere pellet in ~ 5-10 ml supporti (a seconda della densità cellulare e la gamma precisa di contatore di cellule). </li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule. Assicurarsi che le cellule sono&gt; 95% praticabile e nel raggio d&#39;azione preciso di macchine. NOTA: Un numero di celle imprecisa può derivare da concentrazioni cellulari estremamente elevate (&gt; 6.0x 10 6 / ml). Trasfettando troppe cellule in grado di ridurre drasticamente l&#39;efficienza di miRNA mira riducendo plasmide: rapporto cellulare e / o diminuendo l&#39;efficienza di trasfezione. </li><li> Aliquote tre provette contenenti ciascuna 9 x 10 6 cellule, corrispondenti alle celle r, facoltativo per la trasfezione di una piastra a 96 pozzetti. Spin cellule a 300 xg per 3 min. </li><li> Rimuovere il supporto. Assicurarsi di rimuovere il più media come possibile con il minimo disturbo della pellet come supporti in eccesso possono avere un impatto efficienza di trasfezione. </li><li> Risospendere le cellule in 1,2 ml di tampone trasfezione / miscela plasmide miRNA, e mettere da parte. </li><li> Le seguenti fasi riportano risospensione di pLIFE-3&#39;UTR plasmide in tampone trasfezione. Come ciò si verifica in piastre da 96 pozzetti, fare attenzione per evitare l&#39;evaporazione di tampone coprendo piastre in ogni momento. <ol><li> Utilizzando una pipetta multicanale, spostare 32,4 microlitri di buffer trasfezione in ciascun pozzetto di una piastra 96 ​​pozzetti PCR (9 pl [per trasfezione] * [3 piastre] * 1.2 [per tenere conto di errori pipetta]). </li><li> Aggiungere 3,6 microlitri (~ 100 ng / ml) di mini-prepped pLIFE-3&#39;UTR plasmide ad ogni pozzetto e mescolare accuratamente. </li><li> Pipettare 10 ml di questa miscela in ogni pozzetto della piastra trasfezione 96 pozzetti e la copertura. </li></ol></li></ol><ol><li> Spostare 1,2 ml della cellula prima / tampone / miscela plasmide pLIFE-miRNA nel serbatoio. Mescolare bene. </li><li> Aggiungere 10 ml di questa miscela nel primo piatto trasfezione 96 pozzetti già contenente 10 microlitri di buffer trasfezione / pLIFE-3&#39;UTR. Mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte. NOTA: Equal sospensione di cellule nel buffer garantirà ancora e il passaggio completo della corrente elettrica attraverso la cuvetta e massimizzare l&#39;efficienza di trasfezione. </li><li> Mettere 96 pozzetti trasfezione sul dispositivo elettroporazione delle cellule e iniziare trasfezione. </li><li> Una volta transfezione è completa, aggiungere 100 ml di media pre-riscaldato da 96 pozzetti piastra di coltura in ciascun pozzetto della piastra trasfezione 96 pozzetti e mescolare bene. Spostare 100 microlitri da ogni pozzetto nella piastra di coltura a 96 pozzetti. </li><li> Mescolare cellule in piastra di coltura con pipetta posizionato verticalmente al centro del pozzo, come cellule tenderanno ad aggregarsi sui lati del well meno mescolati correttamente. </li><li> Ripetere 5,1-5,5 per i restanti due piastre. </li><li> Pulizia piatto trasfezione 96 pozzetti <ol><li> Le piastre di transfezione 96 pozzetti possono essere riciclati da lavaggio con EtOH 70% per garantire l&#39;assenza riporto degli acidi nucleici tra esperimenti. Eseguire due 70% EtOH lavaggi utilizzando uno spray di riempire completamente ciascun pozzetto, quindi asciugare giù eccesso EtOH sulle strisce elettrodi (lato inferiore) e consentendo le piastre di transfezione a completamente asciutto nel cofano cultura. NOTA: Abbiamo testato per riporto contaminazione del DNA trasfettando 12 pozzi con 2 mg pmaxGFP plasmide ciascuno in cellule HEK293T, seguito da un singolo lavaggio con il 70% EtOH, e una seconda trasfezione senza DNA plasmidico. Con questa concentrazione estremamente elevata plasmide, giornalista estremamente luminoso, ed un lavaggio singolo, non vi era alcuna fluorescenza osservabile in uno qualsiasi dei 12 trasfezioni replicati. </li></ol></li><li> Cellule di coltura per 48-72 ore a 37 ° C, seguita dalla duplice lucifcancellare test. </li></ol> 6. Preparazione del lisato per Luciferasi Assay <ol><li> Diluire tampone di lisi con 4 parti di acqua, 1 parte 5x tampone di lisi passive in un serbatoio. Calcolare 26 microlitri / bene, aggiungendo ~ 20 volumi in più per tenere conto di perdite nel serbatoio. NOTA: Il buffer è conservato a -20 ° C e può essere estremamente viscoso, quindi prima di consentire il buffer 5x per avvicinarsi temperatura ambiente migliorerà l&#39;accuratezza di pipettaggio. </li><li> Analizzare ogni bene per l&#39;efficienza di trasfezione usando la microscopia a fluorescenza. Prendere nota di eventuali incoerenze nei pozzi che non transfect efficiente (&gt; 90% di efficienza di trasfezione), o stanno esprimendo bassi livelli di richiesta di offerta indicativa di sovraffollamento o supporto esaurimento. Rimuovere questi pozzi dall&#39;analisi. </li><li> Rimuovere completamente il supporto da parte delle cellule, facendo attenzione a non eluire troppo in fretta che indurre le cellule a staccare. NOTA: i media rimanenti saranno diluire le fluttuazioni lisato e causare dei valori attraverso experimenti. </li><li> Aggiungere 26 ml di tampone di lisi per ogni bene, e posto su un piatto agitatore / rocker a bassa velocità / moderato per ~ 20-30 minuti. Utilizzare questo tempo per preparare il buffer luciferasi, lavare e adescare la luminometro (s), e trasferire lisato di piastre di misura opache. </li></ol> 7. Doppio Luciferase Assay NOTA: Se più piastre vengono misurati in sequenza su un luminometro, creare buffer di Master Mix con tutto tranne ATP e substrati, aggiungendo questi reagenti seguita da regolazione del pH al momento dell&#39;uso con ogni piatto. ATP e substrati possono degradare nel tempo; coerenza nel tempo questi reagenti sono nel buffer migliorerà coerenza tra più piastre. <ol><li> Preparare buffer luciferasi 1x (Tabella 1): <ol><li> Avvolgere due tubi (tipicamente 15/50 ml provette centrifuga) contenente la lucciola e buffer Renilla con un foglio di alluminio, come substrati possono essere sensibile alla luce. </li><li>Preparare 1x tampone luciferasi Firefly. Aggiungere 1 ml di ciascuno dei cinque 10x reagenti lucciola luciferasi, aggiungendo EGTA scorso, a 5 ml H 2 0 ad una concentrazione finale 1x. <ol><li> Aggiungere 0,025 g ATP a 10 ml 1x tampone lucciola. Mescolare capovolgendo più volte. Tenere ATP su ghiaccio in ogni momento. ATP si degradano, quindi se la misura più di una sequenza piatto, buffer deve essere fatto all&#39;inizio fresca in questa fase per ogni targhetta supplementare. </li><li> Aggiungere 100 ml di 100 scarabeo luciferina (substrato) (Tabella 1) Buffer deve modificare per colore giallastro in base a pH. </li></ol></li><li> 1x Renilla tampone luciferasi ricostituzione: Per piastra a 96 pozzetti, un&#39;aliquota di 10 ml di 1 &quot;tampone Renilla&quot;. <ol><li> Aggiungere 100 ml di BSA (44 mg / ml di brodo). </li><li> Se lo screening più di una piastra, master mix separata in 10 ml aliquote. </li><li> Aggiungere 100 ml di coelenterazine di buffer (in precedenza aliquotare e conservare a 100x conc.) </li></ol></li> &lt;li&gt; Regolare il pH del tampone 1x lucciola a 8,0, seguita dalla 1x tampone Renilla a 5,0 usando NaOH e HCl. NOTA: L&#39;attività di ogni buffer, e la capacità del buffer Renilla per estinguere l&#39;attività della luciferasi della lucciola è fortemente dipendente dal pH. Per risultati coerenti essere estremamente accurate in questa fase. </li><li> Portare il volume di ciascun buffer (corrispondente alla piastra 1 a 96 pozzetti) a 10,5 ml di ospitare per luminometro priming. </li></ol></li><li> Trasferimento lisato piastre bianco opaco: A questo punto le cellule devono essere in tampone di lisi per ~ 20 min. Prendere 25 microlitri di ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale, assicurarsi di pipettare su e giù a fondo per rompere i grumi di cellule e omogeneizzare il lisato. </li><li> Preparare il luminometro. Accendere il luminometro e selezionare il protocollo nella cartella DLR, denominata &quot;DLR con due iniezioni&quot;. Altri formati non sono compatibili con il processo di analisi dei dati (qui di seguito). <ol><li> Selezionare i pozzi di essere tressati (tutti i pozzetti è l&#39;impostazione predefinita). </li><li> Estendere il &#39;Ritardo prima della misura&#39; impostazione a 5 secondi, con un tempo di misura di 10 sec (vedi 29 per la spiegazione). </li><li> Capillare lavaggio passi: 3x acqua, EtOH 3x, 3x acqua, 3x asciutto. Buffer Prime volta nei rifiuti, e poi serata una seconda volta indietro nelle provette tampone per garantire la miscelazione. Iniettare il buffer lucciola prima e primo nel capillare sinistra, seguito dal Renilla nel capillare destra. </li></ol></li><li> Avviare il saggio luciferasi. Ogni piatto dovrebbe prendere ~ 48 minuti per leggere. Dopo il completamento salvare il file, e poi ripetere la procedura di lavaggio e spegnere il luminometro. NOTA: piastre multipli possono essere letti e dati memorizzati sullo stesso file excel, tuttavia problemi possono essere riscontrati con piastra più letture in cui il programma andrà in crash luminometro. Assicurarsi di salvare tutti i dati tra le misurazioni e prendere screenshot se il programma va in crash prima è possibile salvare. <ol><li> Sostituire vecchi tamponicon il nuovo, assicurandosi di primo almeno due volte con nuovi buffer prima di iniziare la nuova piastra. </li></ol></li></ol> Analisi 8. Dati <ol><li> Utilizzare le tabelle excel &quot;3&#39;LIFE - analisi piatto unico&quot; e &quot;3&#39;LIFE - analisi multidisco&quot; disponibile da <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> . Copiare i dati grezzi per lucciola e Renilla luciferasi misurazioni da file di output luminometer in posizioni corrispondenti alla condizione negativa, miRNA # 1 e # 2 miRNA nel &quot;3&#39;LIFE - analisi piatto unico&quot; foglio di calcolo. </li><li> Il foglio di calcolo calcolerà automaticamente lucciola / rapporto Renilla e normalizzare ogni miRNA al controllo negativo appropriato e normalizzare i valori di repressione su ogni piatto. NOTA: Questo foglio di calcolo identificherà automaticamente pozzi con segnale a basso luciferasi, evidenziare pozzi significativamente repressi, e prevedere misure di repressisu tutta l&#39;intera piastra. Vedere 24 per una spiegazione dettagliata di analisi statistica. <ol><li> Copiare i valori dalla casella &quot;normalizzato RI Index&quot;, in celle corrispondenti nel - foglio &quot;3&#39;LIFE analisi multidisco&quot; nella posizione corrispondente a replicare # 1 per ogni miRNA testata. Ripetere l&#39;operazione per tutte le repliche biologiche effettuate in giorni diversi. </li></ol></li><li> Se lo si desidera, inserire i nomi dei geni e lo stato di previsione bersaglio nelle colonne B e D, rispettivamente. <ol><li> Lasciare che il foglio di calcolo per calcolare automaticamente la media di tutto piatto. Osservare i dati in formato 96 ed una mappa di calore (figura 2). Il file organizza anche i dati in formato elenco (Figura 2). NOTA: L&#39;indice di repressione è la misura utilizzata per identificare bersagli putativi miRNA. Diversi parametri stringenza possono utilizzare, in base a preferenze individuali. In media si considera probabili colpi sotto indice repressione di 0.8 e statisticamente significativa con il test t (p -value &lt;0,05). Come mostrato in Figura 3 potenziali obiettivi sulla base di questi criteri saranno evidenziati in rosso. </li></ol></li></ol>

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S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. 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This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

Il test 3&#39;LIFE identifica obiettivi funzionali miRNA in 3&#39;UTRs a high-throughput. Questo test è utile per i ricercatori che desiderano identificare sperimentalmente un gran numero di bersagli putativi per la loro miRNA di interesse. Il saggio 3&#39;LIFE è un approccio potente per eseguire query per 3&#39;UTR regolazione guidata, in quanto il test fornisce una misura funzionale di miRNA targeting e la sperimentazione binario di un singolo giornalista :: 3&#39;UTR contro un singolo miRNA può tranquillamente aff...

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di individuare e mappare con precisione microRNA target (miRNA) in high-throughput. MiRNA sono endogeni RNA non codificanti ~ 22 nucleotidi di lunghezza. In seguito la trascrizione e la lavorazione, miRNA maturi sono incorporati in un complesso proteico chiamato RNA induced silencing complex (RISC). Ogni miRNA guida il RISC ad elementi situati principalmente nelle regioni 3&#39;untranslated (3&#39;UTRs) di RNA messaggeri (mRNA) di destinazione, con conseguente sia repressione traduzione o mRNA cleavage 1. Mirna riconoscere siti di destinazione basate su standard di Watson-Crick e G: U Wobble appaiamento delle basi, e sono degenerati in natura, contenente più paia di basi non corrispondenti e le regioni si gonfiarono. Molti miRNA sono ampiamente conservati dalle piante all&#39;uomo 2,3, dove giocano una vasta gamma di ruoli biologici. In metazoi miRNA possono influenzare molteplici processi biologici, tra cui le decisioni destino cellulare 4, i tempi di sviluppo 5 </sup&gt;, E spesso mostrano tessuti specifici modelli di espressione 6,7. Mirna misexpression può anche provocare regolazione genica aberranti, che può avere notevole influenza sul comportamento cellulare basato esclusivamente sulla funzione dei geni bersaglio. Come tale, miRNA sono collegati ad una vasta gamma di malattie, compreso neurodegenerazione 8,9, diabete e cancro 10 11. Bioinformatica e gli approcci bagnato banco suggeriscono che ogni miRNA può essere in grado di colpire centinaia di migliaia di mRNA distinte 12-14, indicando che gli approcci a livello di high-throughput o del genoma sono tenuti a sondare questa grande piscina di potenziali interazioni. Identificare geni bersaglio è una componente critica di meccanicamente definire funzione miRNA, e per farlo i ricercatori deve essere in grado di rivelare gli obiettivi su larga scala. Diversi approcci sono stati sviluppati per identificare bersagli miRNA, tra cui algoritmi di predizione bioinformatica, high-throughput sequencingmRNA di mirati e giornalista saggi basa. Ognuno di questi approcci ha punti di forza e di debolezza intrinseci. Dato che il targeting miRNA è guidata dalla specificità di sequenza, in particolare di 2-6 nucleotidi del miRNA (definita regione di seme), diversi algoritmi sono stati sviluppati per prevedere bersagli miRNA nel genoma di molti organismi. Questi algoritmi sono addestrati con i motivi osservati base-accoppiamento di obiettivi miRNA validati, e spesso utilizzano parametri quali l&#39;associazione rigorosa seme, la conservazione del sito, e / o la stabilità termodinamica 15. Mentre questi filtri perfezionare il gran numero di bersagli putativi con complementarità sufficiente per obiettivi solo un&#39;elevata fiducia, essi possono escludere determinate specie e non canonici siti bersaglio miRNA, che recenti evidenze suggerisce sono diffusi 16-24. Inoltre, queste previsioni non tengono conto dei meccanismi di trasformazione mRNA che escludono siti bersaglio miRNA, come poliadenilazione alternativa25, RNA editing 26, RNA metilazione 27, e cooperativo vincolante. In quanto tale, gli alti tassi di falsi positivi e falsi negativi sono stati riportati per molti algoritmi 22,24,28. Mentre questi algoritmi sono utili per identificare candidati bersagli miRNA per la successiva validazione sperimentale, questi tassi di errore elevati limitano l&#39;efficacia di approcci bioinformatici per la rilevazione sistematica bersaglio miRNA. Per sondare sistematicamente per le interazioni tra un dato miRNA e 3&#39;UTRs potenzialmente mirate abbiamo sviluppato un saggio ad alta prestazione denominato luminescente Identificazione di elementi funzionali in 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24. Questo saggio misura interazioni dirette e repressione di traslazione del 3&#39;UTR di prova da una query miRNA utilizzando un sistema duale giornalista luciferasi. In questo sistema, il 3&#39;UTR di un gene di interesse viene clonato a valle della luciferasi (fluc) giornalista telaio lettura lucciola. I contro giornalistatruct è cotransfected con una query miRNA nelle cellule HEK293T. Mirna Il targeting è determinata misurando la variazione relativa tra il fluc prova :: giornalista 3&#39;UTR e un secondo non specifico giornalista Renilla luciferasi. È importante sottolineare che, saggi luciferasi rilevano funzionali interazioni miRNA / mRNA che influenzano l&#39;uscita di traslazione del giornalista. Questo è un vantaggio fondamentale rispetto ai metodi tradizionali per individuare regolamentazione miRNA, come la RT-qPCR e macchie occidentali, che questo ignora le differenze di degradazione mRNA e di repressione traslazionale, così come i cambiamenti nelle proteine ​​abbondanza indipendente di regolamentazione basata 3&#39;UTR. Saggi luciferasi sono ampiamente utilizzati per convalidare bersagli diretti miRNA a causa della loro relativa semplicità e sensibilità, ma il loro uso in schermi high-throughput è limitato dai costi elevati associati con reagenti consumabili, la mancanza di librerie 3&#39;UTR da fonti pubbliche, e l&#39;assenza di standard luciferasi protocols, con conseguenti difficoltà nel confrontare repressione funzionale tra più insiemi di dati. Per facilitare l&#39;uso del test 3&#39;LIFE, abbiamo posto l&#39;accento sulla semplificazione del disegno sperimentale, l&#39;utilizzo di trasfezione 24 e luciferasi reagenti non commerciali 29, la creazione di una biblioteca 3&#39;UTR che viene regolarmente aggiornato e ampliato, ed è disponibile attraverso un repository plasmide pubblico 30. La scalabilità del saggio 3&#39;LIFE permette proiezione di una grande biblioteca 3&#39;UTR per il targeting per un dato miRNA, senza falsare la schermata verso geni bioinformatically identificati. Oltre a testare le interazioni canoniche e previste, questo approccio sistematico permette l&#39;identificazione di nuovi bersagli azionati tramite interazioni non canonici e / o specie-specifici. È importante sottolineare che l&#39;effetto di miRNA targeting produzione di proteine ​​è generalmente inteso a provocare modesto repressione traslazionale 15,31 &lt;/ Sup&gt;, suggerendo che un ruolo primario della regolamentazione miRNA è quello di mettere a punto l&#39;uscita di proteine, la protezione contro i livelli aberranti di espressione genica, e dare maggiore solidità alla cella programmi specifici 32,33. La sensibilità del saggio luciferasi combinato con il intrinsecamente gran numero di interazioni negative miRNA / mRNA nella schermata 3&#39;LIFE permette la rilevazione di effetti sottili di miRNA mira su un gran numero di geni, e l&#39;identificazione di componenti multipli di reti geniche che sono regolati da un dato miRNA 24. Qui si descrive il protocollo 3&#39;LIFE, e dimostrare che è fattibilità per lo screening due miRNA ben caratterizzati, miR-10b e let-7c contro un gruppo di 275 3&#39;UTRs umani (Figura 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycylglycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1127-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kx PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">FLAAS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4282</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luciferin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E0399</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K H2 P O4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1551139</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coelenterazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS/HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5546</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pennicilin/Streptomicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">T2600000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiPrep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A2392</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well miniprep plate</td>
			<td style="width:71px;">Pall</td>
			<td>8032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well shuttle plates</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">V4SP-2096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5x Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td>E1941&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instruments</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well GloMax Plate Reader</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E9032</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biomech FX Liquid Handler Robot</td>
			<td style="width:71px;">Beckmann</td>
			<td style="width:119px;">A31842</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4D-Nucleofector Core Unit</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAF-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well Shuttle System</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAM-1001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Counter Countess</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

Luminescente Identificazione di elementi funzionali a 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) permette la rapida identificazione di bersagli di miRNA specifici all&#39;interno di un array di centinaia di 3&#39;UTRs interrogati. Identificazione di destinazione è basato sul dosaggio dual-luciferasi, che rileva vincolante a livello di mRNA misurando uscita traslazionale, dando una lettura funzionale miRNA targeting. 3&#39;LIFE utilizza i buffer non proprietari e reagenti, e biblioteche giornalista pubblicamente disponibili, rendendo gli schermi genome-wide fattibile e conveniente. 3&#39;LIFE può essere eseguita in un ambiente di laboratorio standard o scalato utilizzando robot gestione dei liquidi e altra strumentazione high-throughput. Illustriamo l&#39;approccio con un set di dati di 3&#39;UTRs umani clonati in piastre a 96 pozzetti e due miRNA test, lasciamo-7c e miR-10b. Dimostriamo come eseguire preparazione del DNA, trasfezione, coltura cellulare e saggi di luciferasi in formato 96-bene, e di fornire gli strumenti per i datianalisi. In conclusione 3&#39;LIFE è altamente riproducibile, veloce, sistematico, e individua gli obiettivi alti di fiducia.

Il file di output luminometro contiene misure prime per entrambe le proteine ​​luciferasi lucciola e Renilla. Questo formato raw è compatibile con il &quot;3&#39;LIFE - analisi piatto unico&quot; e &quot;3&#39;LIFE - analisi multidisco&quot; fogli di calcolo disponibile sul sito web laboratorio Mangone ( <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). Il singolo analisi piatto foglio elettronico calcola automaticamente lucciola / rapporto Renilla, normalizza ogni miRNA al controllo n...

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

10.0K Views.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Video: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-throughput per l&#39;analisi Saccarificazione materiali lignocellulosici

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ricerca

Biologia

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...