Questo laboratorio è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research, le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada, e la Multiple Sclerosis Society of Canada (MSSC). GST è stato il destinatario di una borsa di studio di dottorato dal MSSC. Siamo grati al Dott. Joan Boggs (Hospital for Sick Children di Toronto) per molte utili discussioni e commenti su questo manoscritto. Siamo grati a Biotium per il loro generoso dono di ulteriori 488 NucView caspasi-3.

1. Scongelamento e Cellule coltura <ol><li> Ottenere stock di surgelati immortalato N19-oligodendrogliali cellule nei negozi di azoto liquido a lungo termine. </li><li> Immergere fiala contenente cellule a 37 ° C bagnomaria fino a quando la sospensione cellulare è completamente scongelati. </li><li> Aggiungere 7 ml di DMEM (Dulbecco Modified mezzo di Eagle) con alto glucosio supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e 1% penicillina / streptomicina per un piatto di 10 centimetri cultura. </li><li> Aggiungere la cellula-sospensione goccia a goccia alla piastra, e agitare delicatamente e rock la piastra Petri per disperdere le cellule in modo uniforme. </li><li> Celle di coltura a 34 ° C / 5% di CO2 incubatore. </li><li> Dopo 4 ore, i media aspirare dai piatti per rimuovere qualsiasi residuo di DMSO (dimetilsolfossido), che era stato usato come un crioprotettore, e sostituirla con mezzi freschi (7 ml di DMEM ad alto glucosio mezzi di comunicazione integrato con il 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina) . </li></ol> 2. Cellule Passaging <ol><li> Al 70-80%confluenza (4-7 crescita giorni), aspirare i media dalle cellule. </li><li> Aggiungere 1 ml di tripsina 0,25% al ​​piatto. Pipetta tripsina per staccare le cellule (circa 5 minuti). </li><li> Effettuare le diluizioni appropriate per le condizioni sperimentali e il passaggio di ulteriori 10 cm per piatto futuri esperimenti con una densità di cellule non meno di 0,1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol> Nota: Si dovrebbe passare le cellule almeno due volte dopo lo scongelamento prima di usarli per esperimenti. 3. Conteggio e placcatura cellule <ol><li> Alle cellule piastra per live-cell imaging, trypsinize come descritto in precedenza. </li><li> Rimuovere circa 30 ml di cellule e contare con un emocitometro. </li><li> Inserire un coprioggetto di vetro rivestito in un piatto ben 6. Aggiungere celle al pozzo ad una densità di 0,1 x 10 6 cellule / ml in 2 mL fenolo senza DMEM high-glucosio media, supplementato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina, a 34 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Permetterecellule di crescere durante la notte (16-20 ore) a 34 ° C / 5% di CO 2 prima di trasfezione. </li></ol> 4. Trasfezione <ol><li> Combina 100 ul serum-free media, 0,5-4 mg DNA plasmidico purificato, e 4 microlitri FuGENE HD (Roche). Vortex delicatamente per mescolare. </li><li> Vortice di nuovo brevemente e lasciare il DNA al complesso per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere FuGENE miscela DNA HD direttamente alle cellule in coltura. Inclinare delicatamente la piastra per miscelare. </li><li> Coltivare le cellule per ulteriori 48 ore a 34 ° C / 5% CO 2 prima del trattamento o di sperimentazione. </li></ol> 5. Le cellule preparazione per il Live-Cell Imaging (LCI) <ol><li> Accendere il Chamlide LCI live-cell box strumento di controllo per almeno 1 h prima si desidera avviare l&#39;esperimento. La centralina di controllo regola anche la temperatura e l&#39;umidità all&#39;interno del Chamlide LCI, e regola il flusso dei premiscelati 5% di CO 2. </li></ol> Nota: Si consiglia diattivare la casella di controllo fino a 3 ore prima di cominciare gli esperimenti per garantire che l&#39;intera fase raggiunge i 34 ° C. Questo passo sarà ridurre la deriva focale, che è causato da fluxulation e la dilatazione termica del metallo come stadio si riscalda, durante l&#39;imaging. <ol start="2"><li> Lavorare in un flusso cappuccio, spruzzare il Chamlide magnetico di tipo camera di cultura, e pinzette, con il 70% di etanolo e lasciarle asciugare per 5 minuti. </li><li> Rimuovere le cellule da incubatore e confermano che sono sani. Dovrebbero apparire aderente e ben diffuse sul vetrino di vetro con processi a membrana numerosi. Le cellule che sono stressati dalla transfezione non sono adatti per la sperimentazione, e avrà un ridotto numero di estensioni di processo, e spesso hanno un nucleo di forma irregolare. </li><li> Inclinare il 6 pozzetti e rimuovere il vetrino con le pinzette. Rapidamente posizionare il lato cellula coprioggetto su nel piatto fondo della camera di cultura. Non lasciare che il vetrino ad asciugare. </li><li> Attaccare il principale magneticocorpo della camera di cultura e aggiungere 500 microlitri di media dall&#39;originale 6 pozzetti sulla parte superiore del vetrino coprioggetto. Riutilizzare questo supporto diminuirà la quantità di stress sul posto le cellule causato dai cambiamenti ambientali, e può anche essere utile per valutare i fattori extracellulari secreti. </li><li> Mettere il coperchio di vetro della camera di cultura. </li><li> Utilizzare un KimWipe spruzzato con il 70% di etanolo di togliere qualunque materiale residuo dal fondo del vetrino, che interferirebbe con la microscopia. </li><li> Posizionare la camera di cultura nel 34 ° C / 5% CO 2 incubatore per 30 min. Questa operazione farà sì che la camera stessa si riscalda a 34 ° C per ridurre lo spostamento del vetrino come il metallo si riscalda. </li></ol> 6. Impostazioni microscopio Immagini sono state acquisite qui utilizzando un microscopio Leica DMIRE2 invertito con un obiettivo relè personalizzati ed emissione passaruota filtro per il caricamento delle cartucce delle ruote multiple (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON). <ol><li> Campo chiaro - Lampada impostato a 2,5 V e tempo di esposizione a 240 ms. </li><li> Proteina fluorescente rossa (RFP) - Guadagno fissato a 140 per 200 ms. </li><li> Proteina verde fluorescente (GFP) - Guadagno fissato a 140 per 500 ms. </li><li> Il nostro microscopio ha una lampada dimmerabile piuttosto che un disco rotante per controllare la quantità di luce disponibile per le cellule. Gestiamo i nostri esperimenti con la luce al 90% della massima intensità della lampada. </li></ol> 7. Il trattamento di cellule con induttori apoptosi e NucView 488 Caspasi-3 substrato <ol><li> E &#39;importante preparare grandi scorte di induttori dell&#39;apoptosi in anticipo e congelarli in aliquote, in modo che le concentrazioni saranno coerenti tra esperimenti. </li><li> Il NucView 488 substrato è sensibile alla luce. Preparare aliquote di 15 microlitri per ridurre i tubi di gelo / disgelo, e conservare a -20 ° C coperto di carta stagnola. Lavora con la luce ambiente della stanza più bassa possibile per ridurre l&#39;esposizione del NucVIEW 488 substrato alla luce, prima del suo utilizzo. </li><li> Recuperare la cultura della camera rapidamente dal termostato in modo che le cellule non sono esposti a una riduzione della temperatura. Posizionare la camera di cultura sulla camera ambientale del microscopio, e utilizzare pinze per tenere la camera di cultura di muoversi. A questo punto si dovrebbe anche abbassare le luci della stanza. </li><li> Accendere il 5% premiscelato CO 2 serbatoio con doppio regolatore. </li><li> Utilizzando l&#39;obiettivo 10x, messa a fuoco per trovare le celle sul monitor del computer con campo chiaro microscopia. Nota: si vorrebbe utilizzare la più grande apertura numerica sull&#39;obiettivo con l&#39;ingrandimento desiderato di ridurre il tempo di esposizione. </li><li> Fornire induttori di apoptosi nelle cellule (nel nostro caso 80 mM di potassio, o 100 mM glutammato), uno dei seguenti metodi possono essere utilizzati. Useremo la consegna di 80 mM di potassio come un esempio, utilizzando KCl sciolti come concentrato 10x nei nostri terreni di coltura tipica. <ol><li> Mezzi di scambio by perfusione lenta e locale: - Utilizzare una pompa peristaltica di mezzi di scambio nella camera di cultura con i nuovi media contenente 80 mM di potassio. - Una estremità del tubo consegnerà 10 ml di uno stock di 80 mM di potassio sciolto in fenolo-free DMEM, e l&#39;altra estremità del tubo sarà rimuovere il supporto dalla camera. - Vuoi che almeno uno scambio di supporti 10x per garantire che i media nella camera di sinistra ha la corretta concentrazione di potassio. - Dopo che i media si scambia, aggiungere 3 ml di NucView 488 substrato ai media nella camera. Pipetta per mescolare. </li><li> Aggiunta diretta di 80 mm K + e NucView 488 substrato di media in camera di cultura: - Preparare una soluzione stock di 10x 80 mM di potassio sciolto in fenolo-free DMEM. - Aggiungere 3 ml di substrato NucView 488 a 50 l di 10x 80 mM di potassio. Pipetta per mescolare. Aggiungi a 500 microlitri fenolo senza DMEM in camera di cultura. Nota: questo metodo èpreferito se siete interessati a mantenere o valutare la crescita o altri fattori secreti che possono essere presenti nei media originale. Abbiamo scoperto che la NucView 488 substrato è stabile in coltura cellulare per la sperimentazione della durata fino a 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Live-cell Imaging <ol><li> Clicca sul canale rosso per visualizzare le cellule transfettate. </li><li> Selezionare e salvare intorno ad una decina di frame in cui ci sono parecchie cellule transfettate e salvare questi &quot;punti tappa XY&quot;. A seconda della quantità di memoria del computer, si può essere limitato al numero di punti tappa che si sarà in grado di acquisire. </li><li> Hanno la immagini al microscopio di cattura (in campo chiaro, canale rosso e il canale verde) in questi stadio salvato punti ogni 6 minuti. </li><li> Qualsiasi colorazione verde che si vede durante le prime fasi degli esperimenti indicano probabile cellule che sono già in fase di apoptosi, di solito a causa di trasfezione e / o di stress ambientale. ApoptOsis a causa di trattamenti sperimentali verrà rilevato in un timepoint dopo l&#39;esperimento. </li></ol> 9. Analisi Statistica <ol><li> Per ogni esperimento, si programma il microscopio per acquisire punti XY più di raccogliere un set di dati di grandi dimensioni in modo efficiente. Ogni esperimento è eseguito in doppio o triplo, ed i dati sono compilati da esperimenti separati eseguiti in giorni diversi. Da ogni set di dati, analizziamo fino a 15 campi di visualizzare e confrontare il rapporto della caspasi-negativo alle cellule di caspasi-cellule positive (numero totale di celle nel campo di vista / numero totale di caspasi-cellule positive). </li><li> Le misurazioni registrate da ciascun set di dati sono raggruppati in un set campione più ampio, e sono quindi confrontati tra loro utilizzando una tabella ANOVA (p = 0,05). Mostriamo gli errori standard della media (SEM) di ogni esperimento, e quindi confrontare la differenza di mezzi con l&#39;esecuzione di un test di Tukey mezzo di confronto (p = 0,05) per determinare which trattamenti sono significativamente diverse l&#39;una dall&#39;altra. </li></ol> 10. Rappresentante Risultati Abbiamo descritto un esperimento per illustrare come il NucView 488 substrato può indicare un aumento del tasso di apoptosi di N19-Corte di Appello di colture cellulari a seguito di un trattamento con un&#39;alta concentrazione di potassio extracellulare. L&#39;N19-cellule sono state trasfettate con richiesta di offerta, e sono stati trattati con 3 ml NucView 488 substrato (controllo), o 3 ml NucView 488 substrato e 80 mm [K +] (trattamento). Le cellule sono state monitorate e le immagini sono state acquisite nel corso di un corso di 12 ore di tempo, che è adeguata per gli studi che coinvolgono insulti neurologici (Figura 1A). In condizioni di controllo, non abbiamo osservato una notevole quantità di apoptosi rispetto al 80 mm [K +] colture trattate (box hash), che ha mostrato circa il 45% delle cellule morte dopo 12 ore (Figura 1B). Il segnale verde sfondo osservanod nelle condizioni di controllo indica le cellule che sono in fase di apoptosi senza l&#39;aggiunta di potassio extracellulare. Praticamente nessuna delle celle nella apoptosi mostra esperimento di controllo dal punto 12 h di tempo, anche se in altre situazioni gli esperimenti può essere richiesto di eseguire più a lungo. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10x. Bar = 100 micron. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="Figura 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> Figura 1. (A) A 12 esperimento tempo h corso di N19 culture Corte di Appello di 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde). Le culture sono stati trattati con una concentrazione finale di 80 mM [K +] (pannelli a sinistra), o nessun trattamento come controllo (pannelli di destra). Le immagini sono state acquisite a intervalli di 6 minuti, e l&#39;attivazione significativa di spaccati caspasi-3 (segnale verde) si può osservared in colture trattate con 80 mM [K +] all&#39;interno del nucleo cellulare (scatola hash) rispetto al esperimento di controllo. (B) Percentuale di spaccati caspasi-3 celle (calcolato dividendo il numero totale delle cellule nel campo visivo di il numero totale di caspasi-cellule positive). Rispetto alle condizioni di controllo, abbiamo osservato circa la morte delle cellule del 45% a seguito K +-trattamento di 12 h. SVideo 1. Un h 12 corso esperimento tempo di N19-Corte di Appello di culture 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde), insieme con vivaci immagini a campo e una a tre vie immagine risultante dalla fusione, in seguito al trattamento con 80 mM [K +]. SVideo 2. Un corso di 12 ore il tempo di sperimentare N19-Corte di Appello di culture 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde), con campo chiaro images e un tre vie immagine fusa. Nessun trattamento è stato applicato alle culture e N19-OLGs può essere visto migrazione attraverso il campo microscopio in contrasto con colture di cellule trattate con 80 mM [K +] (confrontare con SVideo 1).

<ol>
	<li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening.">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li><li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEVD-NucView488:+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells.">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li><li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles.">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li><li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+pathways,+neuronal+apoptosis,+and+CNS+injury.">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li><li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation.">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li><li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+L-type+Ca(++)+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins.">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li><li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination.">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li><li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptors,+neurotoxicity+and+neurodegeneration.">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li><li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo.">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li><li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells.">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li><li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+Huntington's+disease.">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li><li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes.">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , (2011).</li><li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells,+in+contrast+to+golli+isoforms.">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li><li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li><li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus.">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li><li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis.">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Anche se questo non è l&#39;unico prodotto disponibile per il rilevamento fluorogenici apoptosi, ci sono diversi vantaggi significativi a utilizzare il NucView 488 substrato. Uno dei vantaggi principali è la capacità di seguire l&#39;apoptosi in cellule vive in tempo reale, mentre la maggior parte prodotti alternativi o richiedono la lisi cellulare o hanno scarsa permeabilità delle cellule. Altri benefici includono ad alta sensibilità per il riconoscimento della caspasi-3, la permeabilità delle cellule di alta, bassa citotossicità, e nessuna interferenza con la progressione della apoptosi. Il substrato è anche bassa fluorescenza di fondo fino a quando non viene scissa e entra nel nucleo, che elimina fluorescenza di fondo. La sequenza della caspasi-3 riconoscimento contiene 3 cariche negative e il legame al DNA colorante ha una carica positiva 2. Il DEVD-NucView 488 molecola ha quindi una carica netta negativa, che impedisce l&#39;attivazione e vincolante del colorante al DNA nelle cellule in cui caspasi non è attivo. Maintaining coerenza tra gli esperimenti è necessario per essere in grado di tracciare confronti significativi tra le repliche. Uno dei parametri principali per mantenere costante è la densità delle cellule, in quanto influenza il tasso di trasfezione. Ottenere elevati tassi di trasfezione in immortalato N19-Corte di Appello di colture cellulari è più difficile che con le altre linee cellulari comuni come HeLa o HEK293, ed è fortemente dipendente dalla densità, nella nostra esperienza di 12, 13. La nostra migliore efficienza di trasfezione per le cellule sono state ottenute con Fugene HD (Roche) e sono normalmente circa il 15%, ma può raggiungere oltre il 30%, a seconda del costrutto. Conteggio delle cellule attento aiuterà ad ottenere tassi di trasfezione coerente. E &#39;anche importante per esporre le cellule dai trattamenti diversi per lo stesso grado di stress ambientale, in particolare quando si misurano i tassi di apoptosi. In particolare, la durata del tempo durante il quale sono esposte le cellule ai reagenti di trasfezione, o la quantità di esposizione alla luce, sono importanti variabili ambientaliAbles di prendere in considerazione, e deve rimanere costante attraverso esperimenti. Per le nostre applicazioni, abbiamo scoperto che raccogliendo un gran numero di campi-di-vista fornisce un campione sufficientemente ampio per fare confronti statisticamente significative [ibidem].

Tabella di reagenti e attrezzature specifiche <table border="1"><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> NucView 488 Kit Caspasi-3 Saggio di cellule vive </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD reagenti di trasfezione </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco modificato Aquila Media </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0,25% tripsina </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1,5-25 mm vetro coprioggetto </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnetico camera di coltura per 25 millimetri coprioggetto </td&gt; <td> Quorum Technologies </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart coltura tissutale 10 piatti centimetri </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-bene di coltura tissutale piatti </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

Il sistema nervoso centrale possono sperimentare una serie di sollecitazioni e insulti neurologici, che possono avere numerosi effetti negativi che alla fine portano ad una riduzione della popolazione neuronale e la funzione. Assoni danneggiati possono rilasciare molecole tra cui potassio o eccitatorio glutammato nella matrice extracellulare, che a loro volta, possono produrre ulteriori insulti e lesioni alle cellule gliali di supporto tra cui astrociti e oligodendrociti 8, 16. Se l&#39;insulto persiste, le cellule saranno sottoposti a morte cellulare programmata (apoptosi), che è regolamentato e attivato da una serie di cascate di segnale ben consolidata trasduzione 14. Apoptosi e necrosi dei tessuti può verificarsi dopo trauma cranico, ischemia cerebrale, e convulsioni. Un esempio classico di regolazione apoptotica è la famiglia di cisteina-dipendente aspartato-diretto proteasi, o caspasi. Proteasi caspasi attivate tra cui sono stati implicati nella morte delle cellule in risposta alla neuro cronicamalattie degenerative tra cui l&#39;Alzheimer, la corea di Huntington e Sclerosi Multipla 4, 14, 3, 11, 7. In questo protocollo viene descritto l&#39;uso del NucView 488 caspasi-3 substrato per misurare la velocità della caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti (OLG) colture cellulari 15, 5, a seguito di esposizione a diverse sollecitazioni extracellulare, come alte concentrazioni di potassio o glutammato. Il condizionale-immortalata N19-Corte di Appello di linea cellulare (che rappresenta il capostipite O2A) è stato ottenuto dal Dott. Antonio Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, ed è stato precedentemente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari di espressione genica mielina e trasduzione del segnale che porta OLG di differenziazione (ad esempio 6, 10). Abbiamo trovato questa linea cellulare per essere robusto rispetto alla trasfezione con esogeni proteina basica della mielina (MBP) costruisce fusi a uno RFP o GFP (rosso o proteina verde fluorescente) 13,12. Qui, il colture cellulari N19-Corte di Appello sono stati trattati con 80 mM di cloruro di potassio o 100 mM glutammato di sodio per imitare perdita assonale nella matrice extracellulare di indurre apoptosi 9. Abbiamo usato un bi-funzionale della caspasi-3 contenente un substrato (Asp-Glu-Val-Asp) DEVD caspasi-3 subunità riconoscimento e un DNA-binding dye 2. Il substrato entra rapidamente nel citoplasma dove viene scissa dalla intracellulare caspasi-3. Il colorante, NucView 488 è rilasciato e entra nel nucleo della cellula dove si lega il DNA e fluorescente verde a 488 nm, segnalando l&#39;apoptosi. L&#39;utilizzo del NucView 488 caspasi-3 substrato permette di vivere a cellule di imaging in tempo reale 1, 10. In questo video, ci descrivono anche la coltura e trasfezione delle cellule immortalato N19-Corte di Appello, così come dal vivo di cellule tecniche di imaging.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell imaging di caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti colture cellulari usando il<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspasi-3 substrato. Questa tecnica è applicabile per le analisi programmate morte cellulare in tempo reale in una varietà di tipi di cellule e tessuti.

Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.8K Views.  University of Guelph. Live-cell imaging di caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti colture cellulari usando il NucView 488 caspasi-3 substrato. Questa tecnica è applicabile per le analisi programmate morte cellulare in tempo reale in una varietà di tipi di cellule e tessuti.

Video: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Ricerca

Neuroscienze

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspasi-3 L&#39;attività nel ratto amigdala Misurato da Spettrofluorimetria dopo infarto miocardico

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analizzando l'attività neurale e connettività utilizzando dati EEG intracranico con SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

Depolarizzazione selettiva assistita da microfluidica dei mitocondri assonali

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Svelare l'ultrastruttura mitocondriale nei neuroni utilizzando la microscopia STED

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

Autore in primo piano: Decodificare l'invecchiamento mitocondriale 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Utilizzo dell'imaging STED su cellule vive per visualizzare l'ultrastruttura della membrana interna mitocondriale in modelli di cellule neuronali

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...