We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

In vivo l&#39;imaging viene eseguito in strutture esenti da organismi patogeni utilizzando protocolli approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso l&#39;Università dello Utah. NOTA: Questo protocollo di imaging viene utilizzato per topi reporter in cui microglia retina e infiltranti monociti / macrofagi esprimono verde fluorescente proteina (GFP) sotto il controllo del locus recettore fractalkine (CX3CR1). 1. In Vivo Imaging di retina GFP + Microglia da confocale a scansione laser oftalmoscopia (cSLO) <ol><li> Accendere il sistema di riscaldamento controllato di acqua, set per stabilizzare la temperatura del mouse tra 35-37 ° C durante la procedura, e collegare due rilievi di riscaldamento. <ol><li> Avviare il sistema oftalmoscopio confocale a scansione laser (cSLO) (Figura 2A). Aprire il programma cSLO, inserire le informazioni che identificherà l&#39;individuo del mouse e impostare una curvatura corneale di 2 mm (menu Dati paziente). </li></ol></li><li> Prepararsi per imaGing. Trovare e montare un pulito 55º grande campo obiettivo sul suo socket. Preparare la piattaforma di imaging oftalmoscopio assicurando una piastra elettrica coperta di carta pulito. Utilizzare clip per appiattire il pad e carta e tenerli da bloccare il movimento della lente obiettivo. </li><li> Anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di 1,3% 2,2,2-tribromoethanol e 0,8% di alcol tert-amil (250 mg / kg di peso corporeo; 0,5 ml / 25 g di peso corporeo) usando un ago 30½ G montato un monouso 1 ml siringa. Ritorna il mouse alla sua gabbia, mantenuto su una piastra elettrica. NOTA: La consegna del anestetico per iniezione contro l&#39;inalazione permette un più facile posizionamento del mouse per l&#39;imaging e l&#39;accesso senza ostacoli agli occhi, senza coni d&#39;ogiva e tubi. </li><li> Una volta che l&#39;animale si ferma e non risponde alla coda pizzico, indurre la dilatazione della pupilla con Tropicamide e fenilefrina (0,5% ciascuno), posizionando l&#39;animale prona e copre entrambi gli occhi con le gocce per 7 min. </li><li> Dopo 5 min, pmerletti il ​​mouse prono sul centro della piattaforma oftalmoscopio, e le lenti a contatto in forma su entrambi gli occhi, applicando una pressione minima. NOTA: Le lenti a contatto sono piccole e fragili, ma possono essere maneggiati con cura con le dita, anche se pinze possono essere utilizzati al posto di 40. L&#39;uso di lenti a contatto è facoltativo, ma raccomandato in quanto minimizza secchezza oculare e conserva trasparenza corneale durante l&#39;imaging. </li><li> Dopo 7 min, orientare il mouse con l&#39;occhio destro verso la lente obiettivo e l&#39;orbita parallela alla lente obiettivo, mantenendo l&#39;animale non frenato vicino al bordo della piattaforma (Figura 2B). Per raccogliere le immagini di saturazione e orientamento comparabili, mantenere costante la distanza dall&#39;occhio alla lente obiettivo, nonché l&#39;allineamento dell&#39;occhio al percorso di luce durante sessioni di imaging. Clip lunghi baffi che interferiscono con l&#39;osservazione dell&#39;occhio. NOTA: Per il prossimo 8-10 minuti, il mouse non si muove o lampeggia, e sarà il respiro con movimento dolcementi, che sono monitorati dal cSLO eye-tracking ART modalità (automatica in tempo reale), che regola la posizione della testa di scansione basato su punti di riferimento del fondo oculare ad alto contrasto. Passato quel tempo, i topi cominciano ansimando e lampeggiante, rendendo l&#39;imaging impraticabile. </li><li> Se l&#39;imaging viene eseguito senza l&#39;utilizzo di lenti a contatto, applicare PBS gocce in entrambi gli occhi ogni 2-3 min per impedire loro di essiccazione. </li><li> Raccogliere una immagine fundus del sistema vascolare della retina e del nervo ottico, si è concentrata sulla retina interna. <ol><li> Selezionare la modalità a infrarossi (IR) e regolare le impostazioni di 820 nm di eccitazione, potenza laser 100%, 40-60% di sensibilità (Figura 2C). </li><li> Lavorare in modalità ad alta velocità (12,6 frame / sec), individuare l&#39;occhio utilizzando il joystick per guidare l&#39;oftalmoscopio. A basso ingrandimento, controllare la cornea e la lente di lesioni o l&#39;opacità, ed escludere dagli occhi di studio con difetti o lesioni che interesseranno l&#39;imaging della retina (Figura 3A). </li><li> Individuare la zona disco ottico (la superficie ditesta del nervo ottico, ONH) portando l&#39;obiettivo più vicino all&#39;occhio, poi centrare l&#39;immagine su di esso e bloccare tale posizione avvitando il joystick. Questo allineamento degli occhi al oftalmoscopio è la chiave per ottenere una buona messa a fuoco e le emissioni attraverso l&#39;immagine. </li><li> Visualizzare i piani interni della retina, così come l&#39;ONH, utilizzando i principali vasi sanguigni situati sulla superficie vitreale della retina come un piano di riferimento focale (59 e 60 D), o più in profondità (55 D) in occhi mostrando ottica scavata dischi. La messa a fuoco ottimale dovrebbe risolvere circolanti globuli entro vasi sanguigni principali, con il loro lume e le pareti nettamente distinte. </li><li> Ottimizzare la saturazione dell&#39;immagine regolando la manopola sul pannello di controllo touch screen, fino a quando un alone bianco di illuminazione uniforme si estende in gran parte del campo 55º fondo attorno al disco ottico (con una leggera sovraesposizione). Successivamente, abbassare la saturazione per ottimizzare il contrasto fino a quando le cellule del sangue che si spostano lungo le principali vasi possono essere chiaramente risolti. Se scuro focalearee persistono, non a causa di danni alla retina, riallineare l&#39;occhio alla telecamera fino a quando l&#39;immagine uniformemente luminoso si ottiene. Questa regolazione è fondamentale per catturare insiemi riproducibili di immagini in posizione e qualità. </li><li> Raccogliere un&#39;immagine IR ad alta risoluzione della retina centrale (1.4-1.7 mm di diametro, a seconda dell&#39;età), con una media di 30 fotogrammi in tempo reale (4,7 fotogrammi / sec; normalizzato), per migliorare il rapporto segnale-rumore (Figura 2D ). </li></ol></li><li> Immediatamente, acquisire una immagine di fluorescenza di GFP + microglia e / o monociti infiltranti localizzate ai piani interni della retina e il TNO. NOTA: Ottimizzazione dell&#39;immagine fundus IR della retina determina la risoluzione dell&#39;immagine di fluorescenza di cellule GFP +, nonché l&#39;estensione della retina interna attraversato. La mancata messa a fuoco piani interiori della retina, che può essere rilevato da una cattiva risoluzione del sistema vascolare, si tradurrà in vista GFP + cellule soffuse (Figura 3B). Mancato adeguamento IR saturazione corretta e uniforme colpisce l&#39;immagine di fluorescenza (FA), introducendo variazioni artefatti in GFP + intensità delle cellule e la dimensione (Figura 3C). <ol><li> Swich a fluorescenza modalità di imaging (FA) sul pannello touch screen, usando blu, di eccitazione 488 nm laser (460-490 nm set di filtri di barriera), e le impostazioni di acquisizione (sensibilità potenza del laser e 100-125% al ​​100%), che sono mantenute costante per tutti i topi (figura 2E). </li><li> Raccogliere un singolo xy-punto, l&#39;immagine di fluorescenza bidimensionale della retina, e cattura immediatamente l&#39;immagine del fondo oculare in posizione identica (100x media scansione; 55º angolo di scansione per entrambe le immagini; Figura 2F). </li><li> Acquisire un&#39;immagine multipunto selezionando &quot;composito&quot; nel pannello di controllo (Figura 2G) e lo spostamento a destra ea sinistra oftalmoscopio, panning la retina attraverso l&#39;asse nasale-temporale (Figura 2H). NOTA: Dopo la scansione di una singola immagine xy-point (100x spuò media), il software automaticamente medie nuove scansioni degli stessi e delle nuove aree (circoscritte con un cerchio verde durante la scansione ottimale, o rosso quando la scansione è irrealizzabile), e punti tutti xy posizioni in tempo reale. L&#39;immagine composita risultante estende 1,5-1,7 mm sull&#39;asse orizzontale x 3-4 mm sull&#39;asse verticale (55 ° x 120-124º angolo di scansione). </li></ol></li><li> L&#39;imaging completa di ogni mouse entro 15 minuti dopo l&#39;induzione dell&#39;anestesia, prima di lampeggiare e la ripresa del moto. </li><li> Rimuovere le lenti a contatto, occhi idrato con PBS e rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia riscaldato, controllando il comportamento fino al completo recupero della motilità. </li><li> Per gli studi longitudinali utilizzando sessioni cSLO imaging intermittenti nel mouse stesso individuo, ripetere l&#39;imaging non meno di 3 giorni di distanza per evitare la tossicità cumulativa di anestesia, così come irritazione corneale. </li></ol> 2. live Image Processing and Analysis <ol><li> Allineamento dell&#39;immagine sequenziale: <ol><li> Allinearele immagini fundus per una serie temporale dello stesso occhio con il sistema vascolare e disco ottico come punti di riferimento. Aprire tutte le immagini in un programma di presentazione slide-show commerciale, trascinando ogni immagine il precedente finché i loro dischi ottici allineano sul piano xy (l&#39;immagine in alto appare semi-trasparente mentre viene trascinato), quindi ruotare l&#39;immagine in alto fino alla sua grandi vasi sanguigni si sovrappongono con il sistema vascolare sull&#39;immagine qui sotto (messa a fuoco su navi più lontano dal disco ottico). Registrare l&#39;angolo di rotazione per ogni immagine e salvare questa serie tempo per riferimenti futuri, tenere traccia di mouse e occhi identità. </li><li> Allineare la corrispondente serie di immagini di fluorescenza xy-point singoli applicando l&#39;angolo registrato per correggere la rotazione xy ad ogni tempo, utilizzando un programma di raster editor grafico. Inoltre, regolare la risoluzione a 300 dpi (senza ridimensionamento) e lo sfondo (in modalità RGB, selezionare Livelli e assaggiare il lume di un vaso sanguigno come il nero). Salvare queste immaginicome file TIF, aggiungendo &quot;allineato&quot; ai loro nomi. </li></ol></li><li> Segmentazione cellule microgliali: <ol><li> Per identificare GFP + cellule della retina centrale, aperta nel FluoRender il &quot;allineato&quot; di file TIF corrispondente al primo punto di tempo / età. Ingrandisci l&#39;immagine per adattarla allo schermo, quindi definire la vista Render (composita, ortogonali, interpolati) e le sue proprietà (0.58 gamma, 255 punto di saturazione, luminosità 255, 195 alfa e 1,00 ombreggiatura), selezionando entrambi i canali RG come visibile (nascondi canale B con un doppio clic su di esso nel frame di lavoro; la figura 4A). </li><li> Per selezionare singole celle, soglia canale rosso (deve essere evidenziato sul telaio di lavoro), aumentando la soglia bassa fino la maggioranza delle cellule sono mascherati (bianco) con processi sovrapposizione minima e cellulari (ciano), mantenendo la soglia alta costante (255). Il valore di soglia bassa varia tra 100 e 170, a seconda dell&#39;intensità di fluorescenza (Figura 4B &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Salva questo punto di vista con il canale rosso visibile solo (comando Cattura) come un nuovo file TIF, aggiungendo &quot;cellsegm&quot; al suo nome originale (Figura 4C). Utilizzando un raster generico software editor grafico, invertire la sua scala di grigi e regolare la risoluzione a 300 dpi di cui sopra, e salvare di nuovo come RGB (Figura 4D). NOTA: Eliminare le cartelle (progetti) creati automaticamente da FluoRender, e salvare il limite applicato per riferimento futuro. </li></ol></li><li> Segmentazione soma microglia e morfometria: <ol><li> Per identificare GFP + somata cella per l&#39;area di quantificazione, di utilizzare l&#39;immagine software di analisi con le misurazioni automatiche di intensità e capacità di soglia, così come basato su soglie conteggio oggetti e misurazione. Aprire il file TIF &quot;cellsegm&quot;, e selezionare il metodo di modifica della scala (spline) e il canale rosso (fare clic sulla scheda rossa in RGB). Migliorare la visualizzazione deselezionando &quot;canale vista a colori&quot; (fare clic con il rosso RGScheda B), e selezionando &quot;complemento colori&quot; (Immagine / Regola immagine) di invertire la scala di grigi e vedere le celle in grigio / nero su sfondo bianco (figura 4E). </li><li> Calibrare l&#39;immagine di 1,4-1,7 mm a seconda dell&#39;età, tracciando una linea orizzontale attraverso l&#39;intera immagine (Calibrazione, Calibrazione rapida). </li><li> Segmento somata singola cella applicando thresholding intensità (Figura 4B). Per questo, il lavoro sul canale RGB rosso e aprire la funzione di soglia Intensità (Conte Object, selezionando il comando &quot;update count&quot;), al fine di monitorare i parametri bidimensionali per ogni regione thresholded di interesse (ROI) in rappresentanza somata individuale. </li><li> Definire la soglia di intensità nell&#39;istogramma intensità, selezionando il più basso 50-60% dei livelli 255, e raffinare il valore di soglia finale valutando visivamente la sovrapposizione fra la maschera colore soglia (blu) e il perimetro soma cellulare (grigio) in singole cellule (FIGURA 4E). </li><li> Stimare l&#39;esattezza delle maschere soma cella per rappresentare le dimensioni Somal misurando l&#39;area prima e dopo la segmentazione in 10 celle e accettare la gamma soglia selezionata se le misure differiscono meno del 10% (utilizzare la barra degli strumenti Binary e misure annotati). </li><li> Individuare manualmente ROI Somal che includono più celle e separano questi elementi (eliminare o ROI separati utilizzando i controlli binario della barra degli strumenti, o il catalogo di oggetti), mentre commutazione on / off del binario di visualizzare direttamente le cellule (Figura 4F). </li><li> Classificare cellule microgliali come ROI con aree Somal più grande e più piccolo di 50-60 micron 2 a discriminare somata cella corrispondente al microglia attivata e disattivata microglia, rispettivamente, utilizzando area soggetta a restrizioni. NOTA: Ogni sottoinsieme Somal cella è identificata con un diverso livello binario pseudocolored, e può essere ulteriormente caratterizzata per altri parametri morfologici (perimeter, circolarità, ecc), così come quantificato in settori retinici discreti (Figura 4G). Salvare l&#39;immagine analizzata come file ND2. </li><li> Verificare che il processo e la complessità ramificazione in singole cellule microgliali attivate, sovrapponendo la maschera Somal e l&#39;immagine -point singolo xy (contrasto aumentato del 50%; la figura 4H). Contare manualmente i processi che si estendono direttamente dal soma cellulare o misurare il diametro del poligono che comprende il pergolato (utilizzare la barra degli strumenti Binary e misure annotati). NOTA: Attivato cellule mancano di processi o portano pochi (&lt;4) e corto (&lt;2x diametro Somal) quelli, in contrasto con i processi non attivati ​​cellulari, che comprendono un pergolato ramificata ed estesa (&gt; 3-10x diametro Somal) relativamente circonda il loro piccolo soma. </li><li> Individuare manualmente le cellule con l&#39;espressione somata inferiori a &lt;20 micron 2 e / o GFP sotto del limite di rilevazione, che sono quindi inosservato da intensity soglia. Utilizzare il comando Tassonomia di annotazioni per contare gli elementi identificati manualmente. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Monitoraggio in tempo reale del numero di cellule microgliali e l&#39;attivazione morfologica durante una malattia neurodegenerativa richiede l&#39;uso di metodi di imaging non invasive che consentono la visualizzazione dettagliata delle funzioni cellulari. Dopo l&#39;imaging, le cellule microgliali devono essere isolati (segmentato) per l&#39;analisi morfometrica utilizzando più passaggi di soglia per valutare le dimensioni Somal e / o la complessità di processo come letture per l&#39;attivazione della microglia. In ...

Microglia sono cellule neuroimmune che risiedono esclusivamente nel sistema nervoso centrale (SNC) dall&#39;inizio dello sviluppo embrionale e per tutta l&#39;età adulta. Dotato di un repertorio complesso di recettori, l&#39;attività della microglia e l&#39;eterogeneità regionale sono regolate dalla loro interazione bidirezionale con i neuroni vicini, glia, barriera emato-encefalica e infiltranti cellule neuroinfiammatori 1,2. Funzioni microgliali basali contribuiscono alla manutenzione e riparazione fisiologica, in quanto campione del loro territorio per perturbazioni nella omeostasi 3,4. Durante lesioni del SNC o malattia, microglia sono i primi soccorritori a segnali neuronali che poi scatenano la loro transizione verso un fenotipo reattiva, denominate &quot;microglia 2,5-7 attivato. Attivazione Microglia comporta un ciclo complicato di espressione genica e di proteine, che sono accoppiati a soma cellulare e processo di ridimensionamento e ristrutturazione 6-9. Attivazione microglia, nonché ridistribuzione cellulare eclustering, può essere accompagnato l&#39;aumento complessivo locale nel numero di cellule (microgliosis definito). Ciò può derivare da proliferazione cellulare e di auto-rinnovamento, con o senza assunzione di emoderivati ​​monociti 3,4,7,10-14. In una vasta gamma di età-dipendente, malattie croniche del sistema nervoso centrale, sostenuta microgliosis e malattie parallela attivazione della microglia progressione 15-19. Come microglia neurodegenerazione impatto rimane poco chiaro, soprattutto perché giocano entrambi i ruoli neuroprotettive e deleteri che possono avere diversi contributi per l&#39;insorgenza della malattia e la progressione. Studi di imaging dal vivo volti a comprendere la malattia cronica del sistema nervoso centrale hanno monitorato il comportamento microglia nel sistema nervoso centrale danneggiata di modelli animali e umani, e ha dimostrato che le alterazioni microgliali sono all&#39;inizio rilevabili nelle fasi precoci della malattia 15-17,19,20. Pertanto, è fondamentale per sviluppare approcci per rilevare e monitorare l&#39;attivazione della microglia in vivo. Dete non invasivaction delle variazioni regionali in attivazione della microglia cerebrale è stato stabilito come un importante indicatore di vivo di progressione della malattia neurodegenerativa, utilizzando l&#39;imaging molecolare o bioluminescenza e la tomografia ad emissione di positroni o la risonanza magnetica 18,21,22. Questi metodi di imaging molecolare e nucleare altamente quantitativi e non invasivi rilevano gliosi con delibera regionale. In alternativa, a due fotoni di imaging confocale in CX3CR1 GFP / + topo ha permesso l&#39;osservazione della microglia cerebrali con una risoluzione cellulare 3,4,9,20,23-28. Tuttavia, questo approccio limita a lungo termine e l&#39;osservazione ripetuta di alterazioni microgliali croniche, dato il potenziale rischio di disturbare il loro comportamento anche minimamente invasive procedure di imaging cerebrale 29. In alternativa, la retina offre condizioni ottimali per diretto, nella visualizzazione vivo e il monitoraggio ripetuto di microglia nella loro nicchia CNS intatto durante l&#39;invecchiamento, a seguito di lesione acuta, epotenzialmente durante malattie neurodegenerative croniche. Così, studi recenti hanno dimostrato la fattibilità di imaging ad alta risoluzione della microglia retiniche esprimono GFP adattando il ophthalmoscopy confocale a scansione laser (cSLO) per immagini live CX3CR1 GFP / + topi. Questo è stato utilizzato per tenere traccia delle modifiche settimanali in numeri GFP + cellule nei topi individuale fino a 10 settimane dopo un trauma acuto indotto o ipertensione oculare 30-36. Abbiamo esteso questo approccio per eseguire l&#39;imaging a lungo termine per diversi mesi, e quantitativamente tenere traccia delle modifiche in attivazione della microglia in base alle dimensioni soma mediante analisi morfometrica. Dimensioni Somal è stata definita come una metrica utile di attivazione della microglia in studi di imaging dal vivo utilizzando due fotoni microscopia confocale a fette corticali di eseguire imaging in vivo di CX3CR1-GFP + microglia 9. Questi ed altri studi hanno anche dimostrato la correlazione tra le dimensioni Somal ei livelli di espressione della proteina Iba1, which aumenta anche con l&#39;attivazione 9,37. Così, microglia attivato può essere identificato in topi vivi, e il loro numero e la distribuzione controllata nel tempo durante CNS salute e di malattia. Questo protocollo descrive i metodi per l&#39;acquisizione di immagini cSLO vivo e analisi per monitorare il numero di cellule microgliali, la distribuzione e l&#39;attivazione morfologica durante cellule gangliari della retina (RGC) degenerazione (Figura 1). Così, questo studio utilizza: 1) un modello di topo di glaucoma ereditaria (DBA / 2J) che subisce età-dipendente del nervo ottico e neurodegenerazione della retina e mostra una notevole variabilità nella progressione della malattia tra i 5 ei 10 mesi di età 38,39, 2) mensile cSLO imaging in vivo per la visualizzazione a lungo termine delle cellule GFP + nella retina e del nervo ottico amieliniche di eterozigoti CX3CR1 GFP + / DBA / 2J topi di età compresa tra 3-5 mesi, 3) analisi delle immagini dal vivo di segmentazione e soglia per isolare somata cellulare e misura ilzona ir. Queste strategie sono applicati per valutare la cinetica di retina stati di attivazione della microglia durante le prime fasi del glaucoma cronico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

Microglia, che sono le cellule del sistema nervoso centrale neuroimmune residenti, trasformano la loro morfologia e le dimensioni in risposta al danno del sistema nervoso centrale, il passaggio ad uno stato attivato con funzioni distinte e profili di espressione genica. I ruoli di attivazione della microglia in salute, infortuni e malattie rimangono completamente sconosciuto a causa della loro regolazione dinamica e complessa, in risposta ai cambiamenti nel loro microambiente. Pertanto, è fondamentale per monitorare in modo non invasivo e analizzare i cambiamenti nella attivazione della microglia nel tempo nell&#39;organismo intatto. Studi in vivo di attivazione della microglia sono stati ritardati da limitazioni tecniche per rilevare il comportamento del microglia senza alterare l&#39;ambiente del sistema nervoso centrale. Questo è stato particolarmente impegnativo durante la neurodegenerazione cronica, in cui i cambiamenti a lungo termine devono essere monitorati. La retina, un organo CNS suscettibili di non invasivo immagini dal vivo, offre un potente sistema di visualizzare e caratterizzare le dinamiche di attivazione della microglia durante disturbi cronici. in vivo della microglia retina, con l&#39;oftalmoscopia confocale (cSLO) e CX3CR1 GFP topi / + giornalista, di visualizzare microglia con risoluzione di cellulare. Inoltre, si descrivono i metodi per quantificare variazioni mensili attivazione delle cellule e la densità in grandi sottopopolazioni di cellule (200-300 cellule per retina). Confermiamo l&#39;uso della superficie Somal come metrica utile per il monitoraggio in tempo reale di attivazione della microglia nella retina applicando automatizzato basato soglia analisi morfometrica delle immagini in vivo. Usiamo questi acquisizione delle immagini in tempo reale e analisi strategie per monitorare i cambiamenti dinamici nella attivazione della microglia e microgliosis durante le prime fasi di neurodegenerazione retinica in un modello murino di glaucoma cronico. Questo approccio dovrebbe essere utile per indagare i contributi di microglia al declino neuronale e assonale nei disturbi cronici del sistema nervoso centrale che colpiscono la retina e del nervo ottico.

I nostri recenti studi in vivo utilizzati questi metodi di acquisizione di immagini e di analisi in tempo reale di visualizzare e monitorare la cinetica e modelli di ONH e cambiamenti microgliali retina durante le prime fasi di glaucoma cronico e il loro rapporto alla fine di neurodegenerazione 59. Qui illustriamo un protocollo di acquisizione delle immagini cSLO per visualizzare cellule microgliali in una vasta area della retina centrale di singoli giovani eterozigoti CX3CR1-GFP DBA / 2J retina <str...

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In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all&#39;età.

In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

10.5K Views.  University of Utah.  Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età. 

Video: In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

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Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In vivo imaging dell&#39;angiogenesi tumorale mediante fluorescenza confocale Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria intrauterina misurare mouse contrattile Pressione<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Etichettatura fluorescente colorante di eritrociti e leucociti per studiare la dinamica del flusso nella circolazione retinica del mouse

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...