Vorremmo ringraziare tutti i membri precedenti del laboratorio Bouchier-Hayes, che hanno contribuito allo sviluppo di questa tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato dal ospedale pediatrico pilota premio Texas bambini a LBH. Ringraziamo la Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) per il permesso di includere i dati pubblicati in collaborazione con la sua squadra. Lo sviluppo dei reagenti descritto è stato sostenuto dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e l'assistenza di Joel M. Sederstrom

1. preparazione delle cellule e piastre di coltura
Nota: Eseguire i passaggi 1-3 in cappa a flusso laminare di coltura del tessuto. Indossare i guanti.
<ol><li>Se utilizza piatti di fondo di vetro, ricoprire il vetro con fibronectina. Andare al passaggio 1.2 se utilizza piatti di plastica.<ol>
<li>Fare una soluzione di 0,1 mg/mL di fibronectina: diluire 1 mL di soluzione di fibronectina 1 mg/mL in 9 mL di 1X PBS.</li>
		<li>Coprire il fondo di vetro di ciascun pozzetto con 0,5-1 mL di fibronectina e incubare per 1-5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta, raccogliere la soluzione di fibronectina e conservare a 4 ° C. Nota: La soluzione di fibronectina può essere riutilizzata più volte.</li>
		<li>Lavare il vetro una volta con 1-2 mL 1 X PBS e aspirare di PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Piastra di 1 x 105 cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 2 mL di terreno di coltura cella appropriata (Vedi tabella 1 per i numeri di cellulare da utilizzare per diverse dimensioni pozzi). Se utilizzando una linea cellulare che esprime stabilmente i caspase BiFC componenti (vedi discussione), 2 x 105 cellule del piatto e procedere con il passaggio di trattamento (passaggio 3).</li>
	<li>Consentire alle cellule di aderire al piatto durante la notte a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto.</li>
</ol>2. transfezione delle celle per introdurre i componenti BiFC caspase
<ol><li>Transfect cellule con il reagente di transfezione appropriato. Nota: Questo protocollo delinea le istruzioni per Lipofectamine 2000, che è stato ottimizzato per tossicità minima. Questo protocollo è stato utilizzato con successo in cellule Hela, cellule MCF7 e cellule LN18. Se si utilizza ulteriori reagenti di transfezione seguono le istruzioni del produttore e ottimizzare come necessario.<ol>
<li>Aggiungere 12 µ l del reagente di transfezione di 750 µ l di media riduttori del siero in una provetta sterile.</li>
		<li>Incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 10 ng di un plasmide del reporter (un plasmide che codifica una proteina fluorescente, per esempio rosso proteina fluorescente [RFP], che verrà assegnata l'etichetta cellule transfected) in una provetta sterile 1,5 mL per ciascun pozzetto per essere transfected.</li>
		<li>Aggiungere 20 ng di ogni plasmide BiFC caspasi (ad es., 20 ng di caspase-2 propeptide [C2 Pro]-VC e 20 ng di C2 Pro-VN) ad ogni provetta (tabella 2).</li>
		<li>Portare ogni tubo fino ad un volume totale di 100 µ l con l'aggiunta di siero riduttore media.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta p200, aggiungere 100 µ l di soluzione di reagente di transfezione dal punto 2.1.2 alla miscela del plasmide in modo goccia a goccia.</li>
		<li>Incubare il mix di reagente di transfezione plasmide per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare i media dalle celle utilizzando una pipetta o con aspirazione e quindi, utilizzando una pipetta p1000, pipettare 800 µ l di media liberi del siero delicatamente verso il basso il lato del bene.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta p200, aggiungere 200 µ l del complesso DNA-lipidico goccia a goccia in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Incubare le cellule in coltura tissutale incubatore a 37 ° C per 3 h.</li>
		<li>Avendo cura di non perturbare il monostrato, rimuovere il supporto gratuito di siero contenente i complessi DNA-lipidico dall'aspirazione mediante aspirazione o con una pipetta.</li>
		<li>Pipettare 2 mL di pre-riscaldata (37 ° C) completa crescita media delicatamente verso il basso il lato di ciascun pozzetto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto per 24-48 h per espressione proteica ottimale.</li>
</ol>3. induzione di attivazione delle caspasi
<ol><li>Trattare con un farmaco o stimolo che induce caspase attivazione circa 24 h dopo la transfezione.<ol>
<li>Aggiungere la concentrazione del farmaco per pre-riscaldati (37 ° C) avviabile (media di crescita completa completati con Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] e 2-mercaptoetanolo [55 µM]) e mescolare delicatamente (tabella 3).</li>
		<li>Aspirare i media dalle celle utilizzando una pipetta o con aspirazione e quindi, utilizzando una pipetta, pipettare 2 mL della soluzione da 3.1.1 inclinate leggermente il bordo del pozzo.</li>
		<li>Aggiungere avviabile senza la droga in un pozzetto come controllo non trattato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le cellule in coltura tissutale incubatore a 37 ° C o procedere a passo 4.3 per un esperimento di time-lapse.</li>
</ol>4. Acquisizione dati di Caspase BiFC
<ol><li>
Caspase BiFC per acquisizione di punto singolo tempo
	<ol>
<li>Accendere il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Trovare le celle sotto al filtro RFP e concentrarsi sulla fluorescenza del gene reporter.</li>
		<li>Utilizzando un contatore di mano-tally, contare tutte le celle di RFP-positivi nel campo visivo. Il numero di record.</li>
		<li>Pur mantenendo il campo visivo stesso, passare al filtro GFP (o filtro YFP se disponibile) e, utilizzando un contatore di mano-tally, contare il numero di globuli rossi che sono anche verde (Venus-positivo). Passare avanti e indietro tra i due filtri per garantire che solo gli eritrociti vengono valutati per Venus-positività. Registrare il numero (Figura 3).</li>
		<li>Contare almeno 100 cellule RFP-positive da ciascuna delle tre aree individuali della piastra.</li>
		<li>In ogni area, calcolare la percentuale di cellule Venus-positive trasfettate (cioè globuli rossi che sono anche verdi). Media le percentuali risultanti per ottenere la deviazione standard.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formazione immagine tridimensionale di caspase BiFC
	<ol>
<li>Accendere il microscopio seguendo le istruzioni del produttore e lanciare il software di acquisizione.</li>
		<li>Selezionare la x 60 o 63 x olio obiettivo e mettere una goccia di olio sull'obiettivo</li>
		<li>Posizionare la piastra di coltura sullo stage microscopio utilizzando il porta targa corretta.</li>
		<li>Utilizzando una sorgente di luce di epifluorescenza e l'oculare del microscopio o i laser confocale e lo schermo del computer, passare a un campo di interesse.</li>
		<li>Concentrarsi sulla fluorescenza reporter utilizzando il laser RFP o filtro.</li>
		<li>Se epifluorescenza è stato utilizzato fino a questo punto, passare alla sorgente di luce laser confocale e visualizzare l'immagine dal vivo delle cellule come acquisita dalla fotocamera e visualizzate dal software di acquisizione sullo schermo del computer.</li>
		<li>Utilizzando il joystick e la ghiera di messa a fuoco, mettere a punto la messa a fuoco e la posizione delle cellule così che le cellule sono al centro del mirino. Selezionare le celle che sono separate gli uni dagli altri e non si sovrappongano.</li>
		<li>Ingresso della potenza del laser di percentuale al 50% e il tempo di esposizione a 100 ms per Venus e RFP come punto di partenza per determinare le impostazioni ottimali da utilizzare per l'esperimento.</li>
		<li>Accendere l'acquisizione live e controllare l'immagine risultante e l'accompagnamento visualizzazione istogrammi per entrambi i canali.</li>
		<li>Se il segnale è basso e l'immagine è difficile da fare fuori, aumentare il tempo di alimentazione e/o l'esposizione di laser delle percentuale con incrementi fino a quando il segnale dell'immagine sembra buono.</li>
		<li>Assicurarsi che il segnale non raggiunge la saturazione. Ispezionare la visualizzazione istogramma per assicurarsi che un picco distinto è visibile per ogni fluor. Se il picco comprende la visualizzazione dell'istogramma intero, ingresso inferiore impostazioni di alimentazione e l'esposizione di laser (Figura 2).</li>
		<li>Visualizzare le cellule di controllo (non trattata o non trasfettate) alle stesse condizioni per garantire che il segnale è specifico. Nota: Singolo colore trasfettanti utilizzabile anche al controllo di crossover, ma se i segnali sono spazialmente distinte (per esempio mitocondriale contro citosolica) questo non è necessario.</li>
		<li>Selezionare o aprire il modulo dello stack Z nel software microscopio.</li>
		<li>Utilizzando la manopola di messa a fuoco, approssimativa della posizione focale corrispondente al centro della cella.</li>
		<li>Regolare il fuoco in una direzione fino a quando la cella non è visibile, selezionare questa come la posizione superiore.</li>
		<li>Regolare il fuoco in direzione opposta fino a quando la cella non è ancora visibile e selezionare questa opzione come posizione più bassa.</li>
		<li>Scegliere la dimensione ottimale passaggio (solitamente circa 20 µm) e avviare l'acquisizione per indicare alla fotocamera di scattare automaticamente una singola immagine in ogni canale a ciascuno dei 20 µm passi tra le posizioni superiore e inferiore.</li>
		<li>Utilizzare software di rendering 3D per ricostruire l'immagine 3D (Figura 4Movie 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Time-lapse imaging di caspase BiFC
	<ol>
<li>Almeno 1 h prima dell'esperimento, accendere il microscopio e impostare la temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Selezionare la x 40, 60 x o obiettivo di olio x 63 e mettere una goccia di olio sull'obiettivo.</li>
		<li>Posizionare la piastra di coltura sullo stage microscopio utilizzando il porta targa corretta.</li>
		<li>Se una fonte di CO2 è disponibile, è possibile collocare il dispositivo di consegna di CO2 (solitamente un coperchio di plexiglass attaccato al tubo che trasporta la CO2) sopra il portatarga. Impostare la CO2 livello al 5% e accendere il CO2 controller all'interno del software. Se non è disponibile una fonte di CO2 , includono 20 mM Hepes memorizzare nel buffer i media.</li>
		<li>Passare a un campo di cellule trasfettate e visualizzare l'immagine dal vivo delle cellule come acquisita dalla fotocamera e visualizzate dal software di acquisizione sullo schermo del computer usando il laser RFP.</li>
		<li>A seguito di passaggi 4.2.8-4.2.12, input le impostazioni per percentuale laser potenza e tempo di esposizione per il laser RFP. Mantenere questi valori più bassi possibili, pur essendo in grado di rilevare il segnale fluorescente.</li>
		<li>Utilizzo di un controllo positivo del campione (Vedi tabella 3 per esempi), seguire passaggi 4.2.8-4.2.12 per immettere le impostazioni per percentuale laser potenza e tempo di esposizione per la luce di laser YFP. Mantenere questi valori più bassi possibili, pur essendo in grado di rilevare il segnale di Venus.</li>
		<li>Per ciascun pozzetto della piastra, scegliere un numero di posizioni diverse che contengono una o più cellule che esprimono il reporter.</li>
		<li>Immettere l'intervallo di tempo tra ogni fotogramma del time-lapse e totale il numero di fotogrammi da adottare. Assicurare che non c'è tempo per acquisire tutte le posizioni selezionate prima il fotogramma successivo è quello di essere preso.</li>
		<li>Ri-visitare ogni posizione, correggere e aggiornare lo stato attivo in base alle necessità.</li>
		<li>Per correggere la deriva focale che può derivare da cambiamenti di temperatura o vibrazioni esterne, attivare il sistema di correzione del drift di messa a fuoco (se disponibile).</li>
		<li>Iniziare il time-lapse e salvare i dati.</li>
		<li>Analizzare i dati utilizzando il software di imaging disponibili (Figura 5film 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation.">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+domains+of+death:+evolution+of+the+apoptosis+machinery.">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li><li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation:+the+induced-proximity+model.">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li><li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation.">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li><li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apoptosome:+signalling+platform+of+cell+death.">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation.">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2.">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus.">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).</li><li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+road+map+for+those+who+don't+know+JAK-STAT.">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li><li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation.">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li><li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo di proteine fluorescenti di Spalato per misurare caspasi indotta prossimità. Venus di Spalato è stato scelto per questa tecnica perché è molto luminoso, altamente fotostabili e il ripiegamento è veloce 13. Così, l'analisi di Venere ripiegamento su caspasi indotta prossimità può fornire vicino le valutazioni in tempo reale delle dinamiche di interazione della proteina caspasi. Venus è diviso in due frammenti leggermente sovrapposti, il capoline...

La famiglia di proteasi caspasi è noti per i loro ruoli critici nell'apoptosi e immunita ' 1. A causa della loro importanza, determinare quando, dove e quanto efficientemente caspases specifici vengono attivati può fornire le comprensioni cruciale nei meccanismi della caspasi vie di attivazione. Il protocollo base imaging qui descritto consente la visualizzazione dei primi passi nella cascata di attivazione di caspasi. Questa tecnica sfrutta le interazioni dinamiche della proteina: l'attivazione di caspase che in auto.
I caspases possono essere divisi in due gruppi: i caspases iniziatore (caspasi-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e i caspases boia (caspase-3, -6 e -7). I caspases boia sono presenti nella cellula come dimeri preformati e vengono attivati tramite fenditura tra le grandi e piccole subunità 2. Quando attivato, essi fendere numerose proteine strutturali e regolatorie conseguente apoptosi 3. I caspases iniziatore sono i caspases primi di essere attivato in un percorso e attivano l'attivazione delle caspasi boia. A differenza di caspases boia, initiator caspases sono attivati da dimerizzazione 4,5. La dimerizzazione è facilitata dal reclutamento di monomeri inattivi per specifiche grande peso molecolare complessi noti come piattaforme di attivazione. Montaggio di piattaforme di attivazione è regolato da una serie di interazioni specifiche: proteina. Questi sono mediati dai motivi di interazione della proteina conservata presente nel proform di caspase l'iniziatore e includere il dominio di morte (DD), dominio effector di morte (DED) e caspase recruitment domain (CARD) 6 (Figura 1A). Piattaforme di attivazione in genere comprendono una proteina recettore e una proteina dell'adattatore. Il recettore è solitamente attivato al momento di legame di un ligando, che induce un cambiamento conformazionale che permette per l'oligomerizzazione di numerose molecole. Il recettore quindi neanche reclute il caspase direttamente o molecole di adattatore che a sua volta portano il caspase al complesso. Così, numerose molecole di caspase mai avvicinare permettendo la dimerizzazione. Questo è noto come la prossimità indotta modello 7. Una volta dimerized, le caspasi subisce autoprocessing, che serve a stabilizzare l'enzima attivo 4,8. Ad esempio, Assemblea dell'apoptosoma Apaf1 viene attivato dal citocromo c dopo il suo rilascio dai mitocondri in un processo chiamato permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale (MOMP). Apaf1 reclute a sua volta caspase-9 attraverso un'interazione che è mediata da una carta presente in sia proteine 9. Risultato di interazioni proteina simile all'Assemblea della CD95 morte inducendo complessi di segnalazione (disco) che conduce all'attivazione di caspasi-8; il PIDDosome, che può attivare le caspasi-2; e vari complessi inflammasome che avviano l'attivazione di caspasi-1 10,11,12. Così, initiator caspases sono reclutati per piattaforme di attivazione specifico da un meccanismo comune conseguente indotto vicinanza e dimerizzazione, senza la quale non si verificherà l'attivazione.
Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un test basato su formazione immagine che è stato sviluppato per misurare questo primo passo nell'attivazione delle caspasi iniziatore, che permette la visualizzazione diretta di caspasi indotta prossimità seguendo piattaforma di attivazione Assemblea. Questo metodo sfrutta le proprietà della proteina fluorescente Spalato Venus. Venus è un più luminoso e più fotostabile versione di proteina fluorescente gialla (YFP) che possa essere divisi in due frammenti non fluorescenti e leggermente sovrapposti: N-terminale di Venus (Venus N o VN) e C-terminale di Venus (Venus C o VC). Questi frammenti mantengono la capacità di ripiegare e diventa fluorescente quando nella prossimità vicina 13. Ogni frammento di Venus è fuso il propeptide della caspasi, che è la parte minima della caspasi che si lega alla piattaforma di attivazione. Questo assicura che i caspases non mantengono l'attività enzimatica e pertanto sono possibile analisi simultanea degli eventi a valle associati agli eventi endogeni. Il Venus frammenti ripiegare quando il prodomains di caspasi sono reclutati per la piattaforma di attivazione e sottoposti a prossimità indotta. (Figura 1B). La fluorescenza di Venus risultante utilizzabile con precisione e in particolare monitorare la localizzazione subcellulare, la cinetica e l'efficienza dell'Assemblea delle piattaforme di attivazione di caspase iniziatore in singole cellule. Dati di imaging possono essere acquistati mediante microscopia confocale o mediante microscopia a fluorescenza standard e può essere adattato a una serie di approcci di microscopia diversi tra cui: Time-lapse di imaging per monitorare l'attivazione di caspase in tempo reale; formazione immagine ad alta risoluzione per la determinazione precise della localizzazione subcellulare; e la quantificazione di punto finale dell'efficienza dell'attivazione.
Questa tecnica in primo luogo è stata sviluppata per studiare l'attivazione di caspase-214. Mentre la piattaforma di attivazione di caspase-2 è pensata per essere il PIDDosome, che consiste del recettore PIDD (proteina p53-indotta con un dominio di morte) e l'adattatore RAIDD (proteina omologa di RIP-collegata ICH-1/CAD-3 con un dominio di morte), L'attivazione di caspase-2 PIDDosome-indipendente è stata segnalata. Ciò suggerisce che l'attivazione di ulteriori piattaforme per caspase-2 esista 15,16. Pur non sapendo i componenti completo della piattaforma attivazione di caspase-2, la caspasi BiFC tecnica ha permesso per l'interrogatorio di successo delle vie di segnalazione di caspase-2 al livello molecolare 14,17. Abbiamo adattato con successo anche questo protocollo per i caspases infiammatori (caspasi-1, -4, -5 e -12) 18 e, in linea di principio, lo stesso approccio dovrebbe essere sufficiente allo stesso modo analizzare ciascuno dei rimanenti initiator caspases. Questo protocollo allo stesso modo potrebbe essere adattato per studiare altre vie erano dimerizzazione è un importante segnale d'attivazione. Ad esempio, le proteine STAT sono attivati da dimerizzazione dopo fosforilazione da Janus chinasi (JAK) 19. Così, il sistema di BiFC potrebbe essere utilizzato per visualizzare per attivazione STAT così come molte altre vie regolamentati da interazioni proteina dinamico. Il seguente protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'introduzione dei reporter nelle cellule nonché metodologie di analisi e acquisizione delle immagini.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

La famiglia di caspase di proteasi svolgono un ruolo essenziale nell'apoptosi e l'immunità innata. Tra questi, un sottogruppo conosciuto come initiator caspases sono il primo a essere attivato in queste vie. Questo gruppo include il caspase-2, -8 e -9, come pure i caspases infiammatori, caspasi-1, -4 e -5. I caspases iniziatore sono tutti attivati di dimerizzazione successivo all'assunzione di specifici complessi multiproteici chiamati piattaforme di attivazione. Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un approccio basato su formazione immagine dove dividere le proteine fluorescenti fuse initiator caspases sono utilizzati per visualizzare il reclutamento delle caspasi iniziatore a loro piattaforme di attivazione e la conseguente prossimità di indotto. Questa fluorescenza consente una lettura di uno dei primi passaggi richiesti per l'attivazione di caspase iniziatore. Utilizzando un numero di differenti approcci basati su microscopia, questa tecnica è in grado di fornire dati quantitativi sull'efficienza dell'attivazione di caspase a livello di popolazione, nonché la cinetica di attivazione delle caspasi e la dimensione e il numero di attivazione di caspase complessi su base per cella.

Nella Figura 3è riportato un esempio di caspase-2 BiFC indotta da danno del DNA. Camptotecine, una topoisomerasi io inibitore, è stato usato per indurre il danno del DNA, attivazione di caspase-2. La mCherry proteina fluorescente rosso è stato utilizzato come reporter per mostrare che le cellule esprimono la sonda BiFC e per aiutare a visualizzare il numero totale di cellule. Fluorescenza di Venus è mostrato in verde e la grande puncta rappresentano caspa...

Watch this Scientific Journal Video about Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K Views.  Baylor College of Medicine. Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Video: Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

L&#39;uso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Ricerca

Neuroscienze

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biochimica

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimolecolari complementazione fluorescenza

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Biologia

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicina

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Immunologia e infezioni

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., <a href="https://app.jove.com/v/63162">Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualizzazione dell'attivazione della caspasi nei macrofagi umani derivati da monociti

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. 
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Immune Modulation

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Saggio di Western Blot chemiluminescente per la lavorazione delle proteine

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

Riepilogo

Esplora Altri Video

L'uso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica