Name: in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
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Ringraziamo Polan Santos e Darren Obbard per le illustrazioni di Drosophila in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena per l&#39;uso del insectary JHMRI. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio Fondazione Life Science Research (HLT), Comitato Università assegni di Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), e NIH concede NS096677, NS037402 e NS083373 (JMH). Ho Lam Tang è un Shurl e Kay Curci Foundation Fellow della Fondazione Life Sciences Research.

1. Preparazione di mosche CaspaseTracker <ol><li> Per preparare CaspaseTracker (DQVD) vola per esperimenti, eseguire questa croce: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&gt; Arresto&gt; GFP-NLS), trasferendo 7-10 femmina vergine (o maschio) mosche trasportano il substrato caspasi biosensore mCD8-DIAP1-GAL4 guidato dal promotore dell&#39;ubiquitina 35 insieme con lo stesso numero di maschio (o femmina) linea G-TRACE, che hanno la seconda bilanciatore cromosoma cyo per evitare letalità della combinazione omozigote di G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi&gt; Arresto&gt; GFP-NLS) 34. Inserire vola in un flaconcino alimento fresco con pasta di lievito fresco come fonte proteica. </li><li> Incubare i file a 18 ° C per 5 a 7 giorni (massimo 2 settimane) e quindi rimuovere il genitore aria dal flacone per evitare il sovraffollamento con la nuova progenie, e per impostare nuove fiale di allevamento. </li><li> Continuare incubazione a 18 ° C fino a quando progenie vola Eclose. Selezionare la non cyo [non-cURLy ala] progenie della corretta genotipo di CaspaseTracker, che sono transgenici per CaspaseTracker e G-35 oligoelementi. </li><li> Allo stesso tempo, generare controllo parentale mosche W118 non transgenici e caspasi-insensitive (DQVA) vola in parallelo per verificare specifiche RFP CaspaseTracker e GFP fluorescenza. </li><li> Eseguire la PCR genotipizzazione per confermare i file con CaspaseTracker utilizzando i primer: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, producendo un prodotto di 3.897 bp. Per la genotipizzazione loci G-Trace, utilizzare i seguenti primer per GFP (474 ​​bp), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC ATG GCC CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; per RFP (258 bp), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e per Flpase (655 bp), 5&#39;-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TCT TTG CTG TCA C. Per la genotipizzazione GAL4 nel vettore pUWR (554 bp), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto, colorazione e montaggio <ol><li> Per dissezioni mosca, evitare tessuti dissezionati di attaccarsi alle punte di plastica per pipette e provette da centrifuga, consigli cappotto e tubi con albumina 1% di siero bovino (BSA) disciolti in acqua. </li><li> Dissect vola su un cuscinetto di silicone con pinze. <ol><li> Per evitare di danneggiare le punte delle pinze su una superficie dura quando si esegue la dissezione, eseguire la dissezione su una superficie di silicio. Per la realizzazione di lastre di dissezione silicone, sciogliere il silicio nel kit commerciale secondo le istruzioni del produttore (Materials List). Dopo la fusione il silicone, aggiungere 3 a 4 mL di un tessuto di diametro piatto di coltura 60mm. piatti di silicio possono essere riutilizzati. </li><li> Anestetizzare una mosca con CO 2, e trasferirlo ad una piastra in silicone con 1 ml di PBS freddo. Introdurre la CO 2 ad un flacone contenente il volo usando una cerbottana, e quindi trasferire al volo t anestetizzatoOA Pad che ha una fornitura di CO 2. </li><li> Utilizzare un paio di pinze per tenere la testa mosca, ed una seconda coppia di pinze per tirare torace nella direzione opposta per scollegare la testa mosca dal corpo di rivestimento senza danneggiare la connessione tra la testa e foregut. </li><li> Usare 2 paia di pinze per rimuovere le ali e le gambe dal torace. </li><li> Utilizzare un paio di pinze per tenere il torace, e un altro paio di pinze per tirare l&#39;addome per separarlo dal torace di nuovo senza danneggiare la connessione tra il foregut e midgut. </li><li> Sezionare organi interni compreso il cervello, intestino, tubuli malpighiani e le ovaie, come precedentemente dimostrato. 39-41 </li><li> Rimuovere tutti i pezzi della cuticola e gli organi di grasso con una pinza da questi tessuti producono forti autofluorescenza. La pazienza e la pratica sono tenuti a preparare un sistema di organi completo come mostrato. </li></ol></li><li> Trasferimento tessuti sezionati a 1,5 ml provette da centrifuga, e fissare i tessuti with 0,5 mL di 4% paraformaldeide in PBS (tampone fosfato salino) a temperatura ambiente per 20 a 30 minuti con rotazione al buio per evitare sbiancamento RFP e GFP nei tessuti. Evitare la fissazione prolungata che può compromettere le successive risultati di colorazione. </li><li> Rimuovere la paraformaldeide delicatamente pipettando e lavare 3 volte con 0,5 mL di PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) a RT. </li><li> Permeabilize i tessuti con 0,5 ml PBST a 4 ° C per una notte con un leggero scuotimento. incubazione più brevi possono causare permeabilizzazione e il compromesso di colorazione risultati incompleti. <ol><li> Se è necessario ridurre la colorazione di fondo, non incubando tessuti in 0,5 mL PBST con 1% BSA, invece di PBS. </li></ol></li><li> Lavare i tessuti 3 volte con 0,5 mL PBST. </li><li> Per macchiare nuclei e filamentosa actina (F-actina), si applicano 0,5 ml PBST con 10 mg / mL di Hoechst 33342 blu colorante nucleare e 0,3 micron Alexa Fluor 633 falloidina F-actina macchia e incubare simultaneamente con i tessuti per 1 ora a RT with leggera rotazione nel buio. Evitare colorazione prolungata in quanto ciò aumenterà lo sfondo. <ol><li> Per immunocolorazione, incubare fisso e permeabilizzate tessuti con 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml di PBS notte a 4 ° C, macchia con diluizione 1: 100 di anticorpi anti-ELAV o con diluizione 1: 200 di anticorpi anti-caspasi-3 notte a 4 ° C (300 mL). Seguire dal corrispondente anticorpo secondario diluito 1: 100 e incubare per 1 a 3 ore a RT. Vedere Materiali Lista per specifiche informazioni di anticorpi. </li></ol></li><li> Lavare i tessuti 3 volte, ognuna per 5 min in 0,5 mL PBST con rotazione dolce. </li><li> Con una pipetta, rimuovere tutti PBST, e poi aggiungere 200 microlitri anti-candeggina agente di montaggio (vedi materiali) per coprire completamente i tessuti per 1-3 ore a temperatura ambiente, o 4 ° C durante la notte. tessuti ottimali che hanno completamente assorbito l&#39;agente di montaggio si depositano sul fondo della provetta. </li><li> Pre-pulire il vetrino con acqua o etanolo al 70% e trasferire i tessuti con l&#39;agente di montaggio per i glass slitta. </li><li> Posizionare con cura un vetrino di vetro sopra i tessuti. Applicare vaselina per il vetrino e la polizza di copertura per evitare di distruggere il tessuto da sovracompressione. Rimuovere l&#39;agente di fissaggio in più con la carta velina. </li><li> Sigillare la polizza di copertura mediante l&#39;applicazione di smalto lungo i bordi del vetrino per evitare la fuoriuscita di agenti di montaggio dai tessuti. </li></ol> 3. Microscopia confocale <ol><li> Utilizzare un confocale epi-microscopio a fluorescenza invertito. Tuttavia, microscopi up-destra possono anche essere utilizzati. Per i tessuti di immagine utilizzando piastrelle, mantenere la temperatura ambiente stabile per evitare la deriva di messa a fuoco e spostamento del piano xy a causa della dilatazione termica e la contrazione dei componenti. sistemi di controllo ambientale e sistemi di compensazione attenzione deriva aiutano ad evitare questo problema a causa di perdita di termo-equilibrio del sistema microscopio. </li><li> Posizionare il vetrino sul palco del microscopio. Prendete un paio di immagini di prova con bassa risoluzione (125 x 125 pixel) unad determinare il numero appropriato di piastrelle necessarie per coprire l&#39;intera regione di interesse (ROI). </li><li> Impostare il sistema di scansione microscopio per catturare immagini con risoluzione di scansione ad esempio 500 x 500 pixel. Selezionare l&#39;obiettivo come un 20X NA 0.8 o un obiettivo Plan-Apochromat 63X NA 1.4 per analizzare i tessuti attraverso vetrino, in modo che ciascuna delle immagini (piastrelle) sovrapposizioni del 20% su tutti i lati. </li><li> Impostare la sequenza di immagini da più lungo al più breve lunghezze d&#39;onda di eccitazione, come la luce di lunghezza d&#39;onda lunga provoca inferiore fotometabolismo. La sequenza dalla più lunga alla più corta lunghezza d&#39;onda di eccitazione è: (i) 633 nm per falloidina F-actina e per gli anticorpi caspasi attivate, (ii) 561 nm per RFP, (iii) 488 nm per GFP, e (iv) 405 nm per Hoechst macchia nucleare. </li><li> Durante l&#39;imaging, minimizzare l&#39;esposizione delle cellule alla eccitazione laser fluorescente durante il processo di imaging per evitare fotometabolismo riducendo l&#39;intensità del laser per ottenere immagini di alta qualità di tessuti. </li><li> Dopo iomaghi sono raccolti, l&#39;unione delle immagini utilizzando il software microscopio. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui illustriamo la costruzione e funzionamento interno di CaspaseTracker che facilitano il rilevamento di una diffusa attività di caspasi basale nei tessuti sani. I passaggi critici per rilevare l&#39;attività della caspasi non apoptotica in vivo sono: 1) la generazione di mosche con il transgene biosensore, 2) verificare la funzione giornalista specifiche caspasi con opportuni controlli, 3) praticando tecniche di dissezione di osservare tutti i sistemi di organi interni di adulti Drosophila, e 4) at...

Caspasi sono proteasi cisteina che mediano la morte cellulare per apoptosi, con l&#39;adesione molte proteine ​​intracellulari dopo residui di aspartato chiave. Ad esempio, caspasi iniziatrici attivano le caspasi effettrici, nucleasi DNA derepress, componenti del citoscheletro Cleave e alterano la composizione lipidica delle membrane cellulari di smantellare rapidamente le cellule e stimolare il loro riconoscimento e engulfment da parte delle cellule che smaltiscono i cadaveri cellula vicina. 1-4 Si stima che miliardi di cellule muoiono al giorno nel corpo umano, e l&#39;apoptosi è un importante meccanismo di morte delle cellule tumorali indotta da chemioterapia. 5 un diverso insieme di caspasi può causare la morte cellulare da processi non apoptotici distinte per stimolare l&#39;immunità innata. 6 Perciò, maggior parte della ricerca sulle caspasi è concentrata sulla loro funzioni pro-morte. È interessante notare che le prove nelle prime fasi del campo ha rivelato che gli stessi caspasi responsabili della promozione della morte cellulare hanno anche non-morte funzioni. Studi pionieristici hanno dimostrato che caspasi sono coinvolte in diverse funzioni cellulari in cellule sane, tra cui la regolazione della proliferazione cellulare e la migrazione durante l&#39;embriogenesi. 7-9 Caspases sono necessari per l&#39;individualizzazione spermatid in Drosophila 10,11, per bloccare un percorso di morte cellulare necroptotic alternativa nei topi 12,13, e per l&#39;elaborazione microRNA in C. elegans. 14,15 In forse la più lunga vissuto cellule, i neuroni, caspasi e altri macchinari apoptotica sono implicati nella regolazione dell&#39;attività neuronale da potatura terminazioni sinaptiche, un processo che si ritiene essere essenziale per rafforzare altri sinapsi per l&#39;apprendimento e la memoria 16. 18 E &#39;possibile che caspasi facilitare la potatura sinaptica da un tipo di mini-apoptosi di minuscole proiezioni neuronali senza morte cellulare intero. 19 Tuttavia, caspasi possono avere funzioni alternative non correlati ad eventi apoptosi-like. 20,21 duplice ruolos nella vita e la morte non sono riservate caspasi; BCL-2 proteine della famiglia e citocromo c hanno ruoli in energetica cellulari in cellule sane, ma sono anche parte del nucleo via apoptotica che viene attivato da molti tipi di stress cellulare. 22-25 Anche se non è provato, sembra logico che l&#39;evoluzione ha legato giorno : i processi di morte-posti di lavoro all&#39;interno delle stesse molecole per garantire la tempestiva eliminazione delle cellule inadatti o indesiderabili. Allo stato attuale, i meccanismi molecolari di attività caspasi non-apoptotica non sono comprese, e la misura dell&#39;attività di caspasi non apoptotica durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti non è noto. Una sfida importante è la difficoltà nel distinguere giornaliere di posti di lavoro da death-lavori di caspasi. In contrasto con l&#39;apoptosi e pyroptosis, quando l&#39;attività delle caspasi è amplificato da una cascata proteolitica, si prevede che i giorno-lavori di caspasi che si verifichi a livelli molto più bassi di attività enzimatica, probabilmente al di sotto di rilevamento da molti Techn disponibileologies. Prima del lavoro qui presentato, altri svilupparono una varietà di biosensori caspasi per scopi diversi. I biosensori SCAT (ad esempio, ECFP-DEVD-Venere) individuare rapidamente l&#39;attività della caspasi in tempo reale in cellule in coltura e tessuti animali utilizzando FRET. 26,27 Al caspasi scissione, la frazione GFP nucleare mirato di Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subisce rilocalizzazione subcellulare in pochi minuti quando la sua membrana plasmatica-tether viene scisso dalla caspasi. 28 allo stesso modo, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) rilocalizza dal citoplasma al nucleo su caspasi scissione. 29,30 Altro di recente, il cromoforo in iCasper è stato abilmente progettato per fluorescenza quando spaccati dalla caspasi, permettendo la rilevazione di attività biosensore in tempo reale nei neuroni di embrioni di Drosophila, ma soprattutto in associazione con la morte delle cellule di sviluppo. morte 31 caspasi-dipendente dei neuroni olfattivi durante l&#39;invecchiamento, è stato demonstvotata da immuno-rilevamento della forma caspasi-spaccati di biosensori CPV (ad esempio, mCD8-PARP-Venere). 32,33 È importante sottolineare che la forma attiva della caspasi-3 è stato rilevato in assenza di morte cellulare da immunostain sensibile a spine di neuroni in coltura, e nel soma utilizzando la fluorescenza caspasi-dipendente del colorante CellEvent giornalista nucleare, ma sono stati riscontrati a causa di foto-tossicità difficoltà, anche se la morte cellulare è stata ritardata fino a dopo l&#39;eliminazione della colonna vertebrale. 19 Pertanto, sono necessari nuovi biosensori caspasi per rilevare e tenere traccia delle cellule con l&#39;attività delle caspasi basale in vivo. Per superare queste difficoltà, abbiamo generato un romanzo a due biosensore colore caspasi, designato CaspaseTracker. Questa strategia combina una versione modificata del Drosophila caspasi-sensitive Apoliner biosensore 28 con la Drosophila G-TRACE sistema FRT ricombinasi 34 per etichettare definitivamente e monitorare le cellule in vivo. &lt;sup&gt; 35 Il sistema G-TRACE GAL4-attivato permette di livelli molto bassi di caspasi per attivare CaspaseTracker, con conseguente espressione RFP nel citoplasma e l&#39;espressione GFP nucleare mirata permanente in una cella che ha mai sperimentato l&#39;attività delle caspasi. 35 Questo sistema può etichettare cellule per tutta la vita in animali interi utilizzando Drosophila melanogaster, un sistema modello trattabili e ampiamente utilizzati per lo studio delle caspasi e morte cellulare. 36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Consumables and Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Glass slides</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA stain</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A22284</td><td>Actin stain</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Antibody Registry ID:&amp;nbsp; AB_528218&amp;nbsp;</td><td>Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Stain for active fragment of caspase-3</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>to preserve fluorophores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>to preserve fluorophores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>Product code: 0001023934</td><td>for dissection plates</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LSM780 confocal microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; dissection</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150&amp;nbsp;W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

in vivo biosensor tracks non-apoptotic caspase activity in drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Ci sono due componenti fondamentali che permettono CaspaseTracker per rilevare l&#39;attività delle caspasi nelle cellule sane normali (Figura 1A). Il primo di questi è un 146 aminoacidi polipeptide caspasi-cleavable modello della caspasi biosensore Apoliner (Figura 1b). 28 Questo polipeptide è derivato da DIAP1 (Drosophila inibitore di apoptosi) contenente un singolo sito caspasi naturale che è scisso durante l&#39;apoptosi tipic...

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In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Per rilevare le cellule sane in animali interi che contengono bassi livelli di attività delle caspasi, il biosensore altamente sensibile designato CaspaseTracker è stato generato per Drosophila. attività biosensore caspasi-dipendente viene rilevato in cellule sane lunga durata durante gli organi interni di animali adulti allevati in condizioni ottimizzate in assenza di stimoli morte.

In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

9.0K Views.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health.  Per rilevare le cellule sane in animali interi che contengono bassi livelli di attività delle caspasi, il biosensore altamente sensibile designato CaspaseTracker è stato generato per Drosophila. attività biosensore caspasi-dipendente viene rilevato in cellule sane lunga durata durante gli organi interni di animali adulti allevati in condizioni ottimizzate in assenza di stimoli morte. 

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first to be activated in these pathways. This group includes caspase-2, -8, and -9, as well as the inflammatory caspases, caspase-1, -4, and -5. The initiator caspases are all activated by dimerization following recruitment to specific multiprotein complexes called activation platforms. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an imaging-based approach where split fluorescent proteins fused to initiator caspases are used to visualize the recruitment of initiator caspases to their activation platforms and the resulting induced proximity. This fluorescence provides a readout of one of the earliest steps required for initiator caspase activation. Using a number of different microscopy-based approaches, this technique can provide quantitative data on the efficiency of caspase activation on a population level as well as the kinetics of caspase activation and the size and number of caspase activating complexes on a per cell basis.

This protocol describes caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC); an imaging-based method that can be used to visualize induced proximity of initiator caspases, which is the first step in their activation.

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Ricerca

Biochimica

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Immunologia e infezioni

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicina

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neuroscienze

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Biologia

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis has been very well defined and many apoptotic proteolytic substrates of caspases have been identified and characterized, the role of caspases for non-apoptotic processes is not well understood. In particular, few non-apoptotic substrates of caspases have been identified thus far. Here, in order to facilitate the identification and characterization of potential caspase substrates, a protocol that allows the testing of candidate substrates in caspase cleavage assays in vitro is described. This protocol includes the production and purification of recombinant caspase proteins, the production of the candidate substrates either recombinantly or in a cell-free expression system, and the actual in vitro cleavage reaction followed by SDS-PAGE and immunoblotting. This protocol is tailored for the Drosophila caspases Dronc and Drice but can easily be adapted for caspases from other organisms, including mammals.

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Here we present a protocol to express and purify recombinant Drosophila caspases Dronc and Drice, and their use in in vitro cleavage assays.

In vitro Saggi di cleavage utilizzando Drosophila caspasi ricombinanti purificate per lo screening del substrato

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...

Bioingegneria

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Riepilogo

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