Ringraziamo gli altri membri della squadra di INSA-ENS iGEM Lione (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Ly Goki, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon e Valérie Desjardin), i nostri sponsor per il loro sostegno finanziario (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lione e il Dipartimento di Bioscienze INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé per la lettura critica di questo manoscritto e il dottor Sze CC per il regalo ceppo. Drogue B. riceve un dottorato di ricerca borsa di studio Région Rhône-Alpes.

1. Biobrick Progettazione e Sintesi del Operon curli <ol><li> Determinare l&#39;organizzazione genetica e localizzare i segnali endogeni trascrizionale e traduzionale dei geni curli. Queste informazioni sono raccolte in banche dati specializzate come RegulonDB a o b EcoGene e completato da una lettura attenta delle pubblicazioni pertinenti. Gestione dei dati e in silico preanalysis sono state effettuate con il software c Clone Manager. </li><li> Selezionare le sequenze codificanti pertinenti. Un insieme di cinque geni assolutamente necessari per curli sintesi (CSGB e csgA monomeri fibra di codifica) e l&#39;esportazione (csgE csgF e csgG, che codifica il complesso secrezione Curlin) sono stati selezionati per costruire l&#39;operone sintetico. Estrarre le sequenze scelte dalla base dati in formato FASTA. Come cluster csgGFE è antisenso in E. coli genoma, convertire questa sequenza nel suo counterp complemento inversoarte utilizzando gli strumenti di Gestione dei Cloni Operations&gt; molecola di processo&gt; Inverti molecola. Incollare la sequenza csgEFG dietro csgBA utilizzando la funzione di &quot;legare&quot; (Clone&gt; legare). </li><li> Aggiungere il promotore appropriato. Ponendo le cinque geni selezionati curli sotto il controllo del promotore RCN P, curli si prevede essere sovra-prodotta in presenza di cobalto e nichel. Il locus RCN codifica una pompa di efflusso responsabile per la disintossicazione Ni e Co (rcnA) e la sua affine metallo-regolatore (rcnR). RcnR controlla l&#39;espressione del gene e la sua rcnA proprio in risposta a Ni e Co 19. La sequenza RCN comprendente CDS rcnR, l&#39;intera regione intergenica RCN più i 41 nucleotidi del primo rcnA era placedin anteriore della sequenza csgBAEFG chimerica (figura 1, la sequenza del intero costrutto viene fornito come dati supplementari). </li><li> Ottimizzare la trascrizionalesegnali. Un perfetto sito di legame ribosomiale (o perfetta RBS = AAGGAGGTATATA) è stato aggiunto davanti al primo ATG della sequenza di DNA csgBA. Un secondo RBS perfetto stato aggiunto davanti alla sequenza csgEFG. RBS endogena per la CSGB e geni csgF e csgG sono stati conservati. </li><li> Per il montaggio standard iGEM, il dispositivo deve essere affiancato da un prefisso standard BioBrick e suffisso, contenenti siti di restrizione per Eco RI, Pst I (prefisso) e Spe I e Xba I (suffisso). Incollare le sequenze corrispondenti a ciascuna estremità del dispositivo d. </li><li> Eliminare eventuali Eco RI, Pst I, Spe I e Xba sito di riconoscimento ho nel dispositivo. Per facilitare il processo di ulteriore montaggio, la parte BioBrick stessa non può contenere uno di questi siti di restrizione. In analisi di restrizione in silico del dispositivo rivelato un Pst I sito nella sequenza csgA, un Pst sito che ho nella sequenza rcnRe un sito Eco RI nel gene csgE. Questi siti sono rispettivamente situati in posizione 80 (Mut1), 1340 (Mut2) e 1830 (Mut3) della sequenza dispositivo (dati complementari) e sono stati modificati come segue da mutazioni silenti. Mut1 Pst sito ho CTGCAG cambiato CGTCTG Mut2 Pst sito ho CTGCAG cambiato CAGCAG Mut3 Eco sito GAATTC RI cambiato GAATT </li><li> Corri attraverso la simulazione di traduzione utilizzando il software di gestione Clone (Funzionamento&gt; molecole di processo&gt; molecole Translate). Utilizzare l&#39;allineamento BLAST sequenza di programma per verificare la perfetta omologia tra la proteina wild type curli e le proteine ​​codificate dal operone sintetico. </li><li> Ordinare il operone sintetico. Servizi commerciali di sintesi del gene sono disponibili presso numerose aziende di tutto il mondo, il nostro partner è stato Genecust (Lussemburgo). 4 microgrammi dell&#39;operone artificiale (3165 bp) sono stati ricevuti qualche settimana dopo e inserite in pUC57 (pIG2). </li></ol>2. Visualizzare e quantificare i batteri aderenti sul polistirolo <ol><li> Riempire ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in polistirene con 2 ml di terreno minimo M63 (glucosio 0,2%) e inoculare ogni pozzetto con 106 cellule di una coltura durante la notte. Crescere i batteri a 30 ° C per 18-48 ore senza agitare. Ogni colonna (4 pozzetti) rappresenta una modalità. Aggiungere la giusta quantità di cobalto (25 a 100 mm) e antibiotici (ampicillina 100 μg.L -1) quando necessario. Le prime tre righe della 24-pozzetti vengono utilizzati per quantificare i batteri aderenti facendo la media delle tre ripetizioni, l&#39;ultima fila di sinistra è utilizzato per visualizzare il biofilm. </li><li> Per le 3 prime file a 24 pozzetti: per ogni bene, recuperare il surnatante contenente le cellule planctoniche. </li><li> Sciacquare accuratamente ogni pozzetto con 1 ml di M63 e la piscina il 1 lavaggio ml con il supernatante iniziale ottenuto in 2.2). Questa piscina è denominato cellule nuoto (= S). </li><li> Recuperare il biofilm in 1 ml of M63 raschiando e pipettando su e giù (= B). Vortex 15 sec. Stimare il numero di batteri in superficie allegate e bagno alla densità ottica a 600 nm (OD600) per dare la percentuale aderenza corrispondente a ciascuna modalità. </li><li> La percentuale di adesione è calcolata utilizzando la formula: BX100 / (3xs + B). </li><li> Solo per l&#39;ultima riga dei 24 pozzetti: eliminare le cellule planctoniche. </li><li> Risciacquo con 1 ml di M63 del biofilm che aveva sviluppato sul fondo della piastra. </li><li> Essiccare la piastra aperta per 1 ora a 80 ° C. </li><li> Aggiungere 100 ml di cristalvioletto 20% per 2 min in ciascun pozzetto seguito da lavaggi con acqua estese per visualizzare le superficie-attached batteri. Tre saggi indipendenti (piastre) devono essere eseguite per garantire la riproducibilità. </li></ol> 3. Visualizza batteri aderenti su vetro di Microscopia <ol><li> Prendi un telaio fluorescente. La E. coli SCC1 ceppo e che constitutively esprime la proteina fluorescente verde (GFP), con nessuna differenza osservabile dal ceppo MG1655 20 è un ospite adatto per il cuscinetto plasmide sintetico curli operone. </li><li> Trasformare SCC1 con il plasmide pIG2 (= sintetico curli operone inserita alla Eco RI / Pst I sito del plasmide pUC57) per ottenere il ceppo S23. Trasformare SCC1 con un plasmide di controllo (pUC18) per ottenere il ceppo di controllo S24 21. </li><li> Crescere precultures overnight della S23 e del controllo (S24) ceppi a 30 ° C in terreno M63 integrato con glucosio (0,2%) e ampicillina (100 μg.L -1). </li><li> Inoculare 15 ml dello stesso terreno in piastre di Petri con 100 microlitri della precultures. Aggiungere la giusta concentrazione di cobalto (cioè 25 pM) e non dimenticare il controllo negativo senza cobalto. Introdurre 3 coprioggetto rettangolare in vetro in ogni piastra di Petri. Incubare per una notte a 30 ° C senza agitazione. </li><li> Rimuovere il coprioggetto from la piastra di Petri e con attenzione lo scarico. Pulire accuratamente la faccia inferiore con una roba di cotone piccolo impregnato con etanolo al 70 ° con l&#39;annientamento di sconto su ogni residuo batterica. Per l&#39;osservazione confocale, pulire entrambe le estremità superiori di qualche millimetro per consentire la fissazione ulteriore coprioggetto. </li><li> Batteri aderenti possono essere visualizzati direttamente ma rapidamente sotto microscopio a fluorescenza, ma accuratamente evitare l&#39;essiccazione del campione. </li><li> Per l&#39;osservazione confocale, depositare il coprioggetto su un vetrino di vetro con la faccia superiore ricoperta dal biofilm disposta a faccia. Il biofilm viene poi coperto con un vetrino coprioggetto più grande, che è fissato al vetrino con vernice. Invertire l&#39;impostazione in modo che il biofilm sarà ora sulla faccia inferiore. </li><li> Posizionare la configurazione al microscopio laser confocale. Un diritto Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscopio laser confocale è stato utilizzato al f piattaforma Platim. </li><li> Impostazione. GFP Excite a 488 nm, e raccogliere la fluorescenza batterica nell&#39;intervallo 500-600 nm<html> . Utilizzare 40x obiettivo ad immersione in olio per l&#39;acquisizione di immagini in modalità a scansione laser confocale. Scansionare i complessivi strutture tridimensionali dei biofilm dalla superficie solida per l&#39;interfaccia con il mezzo di crescita, utilizzando un passo di 1 um. </li><li> Eseguire proiezioni tridimensionali con Imaris software (Bitplane, Zurigo, Svizzera). Determinare lo spessore del biofilm dall&#39;analisi del valore medio z lungo statistici sezioni longitudinali. Quantificazione di biovolumes biofilm può essere estratto da confocale z-stacks come descritto altrove 22. </li></ol> un RegulonDB fornisce informazioni sui meccanismi sull&#39;organizzazione dell&#39;operone e la loro scomposizione in unità di trascrizione, promotori e il loro tipo sigma, geni e dei loro siti di legame ribosomiale, terminatori, siti di legame di specifici regolatori trascrizionali, così come la loro organizzazione in frasi di regolamentazione.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp b Il database EcoGene contiene informazioni aggiornate sulla E. coli K-12 sequenze del genoma e proteoma, tra cui ampie bibliografie gene. Un obiettivo EcoGene importante è stata la rivalutazione dei siti di inizio di traduzione. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> c <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> Dono e di Chun Chau Sze, Nan Yang Technical University, Singapore. f Platim microscopica piattaforma UMS3444 BioSciences Gerland - Lione Sud.

<ol>
	<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+sensor+cell+arrays.">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li><li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array.">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li><li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes.">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li><li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli.">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li><li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains:+role+of+flagella,+curli+and+colanic+acid.">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li><li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation.">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li><li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces:+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression.">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li><li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg(II).">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li><li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Zn(II),+Cu(II),+and+Fe(II)+ions+to+Alzheimer's+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence.">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li><li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis.">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li><li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli.">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li><li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli.">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li><li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation.">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li><li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpxR/OmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli.">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li><li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis.">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li><li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive.">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li><li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12.">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li><li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site:+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt.">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li><li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context.">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli.">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li><li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere:+new+perspectives+for+studying+microbial+communities.">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li><li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Adhesives. , (2006).</li><li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method.">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device.">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li><li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria.">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li><li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in molecular genetics. , (1972).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi critici La fase più critica in questo approccio biologia sintetica è la progettazione gene. Disegno gene sintetico deve essere meticolosa per garantire un sistema di produzione efficiente. Due geni codificanti i monomeri fibra e tre geni codificanti per proteine ​​coinvolte nel loro sistema di secrezione sono stati montati con un promotore forte e metallo-inducibile per creare una nuova unità funzionale per una nuova applicazione: il bio-decontaminazione di effluente nucleare. C...

L&#39;adesione batterica al supporto abiotico svolge un ruolo importante nelle celle a combustibile biorisanamento, biocatalisi o microbica. Processi di biorisanamento utilizzare le capacità dei microrganismi di degradare sostanze organiche, o per modificare la distribuzione del metallo (immobilizzazione, volatilizzazione) o speciazione. Queste attività benefiche sono osservati negli ecosistemi acquatici e terrestri, ma anche nei sistemi artificiali sviluppati per il trattamento di acque inquinate di rifiuti industriali e domestici. L&#39;intensità e la qualità dell&#39;attività microbica dipendono fattori fisico-chimici, ma anche sullo stile di vita dei microrganismi (free-floating o incorporato in biofilm). La formazione di biofilm è associato un metabolismo promuovere resistenza ai biocidi da meccanismi diversi. Questo fenomeno sarà dunque incoraggiata maggior parte dei processi di biorisanamento. Inoltre, ingegneria cellule di Escherichia coli per controllare la formazione di biofilm è stato applicato con successoimmobilizzare cellule intere sensori su biochip 2-3. Adattamento dei microrganismi a concentrazione di metalli avviene attraverso diversi meccanismi quali adsorbimento a componenti della matrice extracellulare, attivazione della pompa di efflusso o di vettori specifici in grado di concentrare il metallo nella cella. Incrementare queste attività batteriche tramite ingegneria genetica consente trattamento efficiente ed economico di inquinamento da metalli in scala di laboratorio, in particolare nel caso di metalli altamente tossici in quantità debole come descritto da Raghu et al. 2008 4. Bonifica batterica rappresenta in questo caso un metodo di risparmio e costo competitivo rispetto ai processi chimici classici con resine a scambio ionico. Gli autori hanno descritto un E. telaio coli geneticamente modificati per l&#39;assorbimento e la ritenzione cobalto prima battendo l&#39;efflusso pompa gene che codifica rcnA, e poi la trasformazione con una copia più plasmide sovrapproduzione permettendo di untrasportatore con captazione preferenziale per il cobalto. Tale ceppo appare come una valida alternativa alle resine a scambio ionico per il trattamento di effluenti radioattivi, ma una questione chiave irrisolta è il recupero di batteri contaminate al termine del processo 4. L&#39;obiettivo del nostro lavoro è stato quindi di progettare una custom-designed ceppo in grado di attenersi ai supporti abiotici quali il vetro o plastica. Tra l&#39;insieme delle adesine e fimbrie aderente identificati batteri Gram-, abbiamo scelto di progettare un sistema che consenta di produzione curli. Curli sono fibre amiloidi sottili (2-5 nm di diametro) e altamente aggregativa che sporgono dalla E. coli e Salmonella superficie come matrice non cristallino e insolubile 5-7. Curli sono anche coinvolti nella colonizzazione delle superfici abiotiche e lo sviluppo di biofilm 8. Curli sono stati recentemente dimostrato di legare ioni di mercurio 9. Amiloidi sono infatti noti per possedere elevataaffinità per ioni di metalli come Cu 2 +, Zn 2 + e Fe 3 + 10. Questa proprietà potrebbe migliorare ulteriormente la decontaminazione di metallo effluenti inquinati. Il cluster CSG è responsabile per la produzione di fibre curli ed è costituito da due operoni trascritti divergentemente (Figura 1). L&#39;, CSGB csgA e geni csgC costituiscono l&#39;operone senso, codifica le due subunità curli, CsgA e CSGB. CsgC sembra essere coinvolto in attività redox all&#39;interno del sistema biogenesi curli e di influenzare il comportamento dei pori CsgG 11. Tuttavia, l&#39;assenza di csgC nella maggior parte dei batteri produttori curli indica che la proteina corrispondente fornisce solo un livello secondario di controllo sulla biogenesi curli. Per semplificare il sistema, abbiamo scelto di lavorare con il minimo numero di geni. Il csgDEFG operonencodes proteine ​​essenziali nella regolazione e trasportodi CsgA e CSGB alla superficie cellulare. CsgD è un attivatore trascrizionale dell&#39;operone csgBAC e svolge un ruolo chiave nel controllo della formazione di biofilm controllando la produzione delle fimbrie curli e altri componenti biofilm come cellulosa 12 e inibendo la produzione flagellum 13. CsgE, CsgF e CsgG costituiscono una curli-specifico apparato secretorio nella membrana esterna attraverso cui viene secreto principali curli subunità proteica CsgA come proteina solubile. La polimerizzazione di CsgA dipende in vivo sulla membrana legata nucleator proteina CSGB (recensione in 14). Complessi percorsi regolatori coinvolgono diversi sistemi a due componenti hanno dimostrato di controllare l&#39;espressione del gene curli 15-16. Questi regolamenti complessi permettere ai batteri di formare biofilm di spessore attraverso la produzione curli in risposta a stimoli ambientali, ma sono difficili da controllare per applicazioni industriali. Per facilitare il recupero della metal-farcito batteri durante un processo industriale, fissazione batterica ad un supporto solido deve effettivamente essere controllato dal parametro ben definito (s). Le proprietà di aderenza di curli sono legati alla loro natura amiloide 17 e potrebbe essere utilizzata per migliorare i processi di biorisanamento, ma un dispositivo semplice e facilmente controllato deve essere creato. Tra questi 7 geni 18, una serie di cinque geni assolutamente necessaria per curli sintesi (CSGB e csgA monomeri fibra codifica) e l&#39;esportazione (csgE csgF e csgG, che codifica il complesso secrezione curli) sono stati selezionati per costruire l&#39;operone sintetico. Per sfuggire alla regolazione &quot;naturale&quot; di curli, un operone sintetico composto da questi 5 geni CSG sotto il controllo di un promotore forte e cobalto-overinducible (Figura 2) è stato progettato e sintetizzato. Il passo-passo analisi della curli-regione codificante e la procedura di progettazione di un funzionale synsintetico dell&#39;operone sono descritti. Due metodi per visualizzare e quantificare l&#39;adesione batterica al polistirolo e vetro sono spiegato.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) con un bp 3165 EcoRI / PstI frammento contenente il sintetico P RCN - csgBAEFG operone; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Multicopia plasmide (pMB1 ori, 2686 bp), Amp r </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-tagged MG1655, dono di CC Sze) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0,1 M soluzione madre conservato a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-pozzetti </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Polistirene piastre da 24 pozzetti </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

Il metodo qui descritto consiste nel ridisegnare E. aderenza proprietà coli assemblando il numero minimo di curli geni sotto il controllo di un promotore forte e metallo-overinducible, e nella visualizzazione e quantificare il guadagno risultante di adesione batterica. Questo metodo si applica principi di ingegneria appropriati di astrazione e la normalizzazione della biologia sintetica, e risultati in Biobrick BBa_K540000 (Miglior dispositivo Biobrick nuovo, progettato, iGEM 2011). La prima fase consiste nella progettazione dell&#39;operone sintetico dedicato sovrapproduzione curli in risposta al metallo, e quindi ad aumentare le capacità di aderenza del ceppo di tipo selvatico. L&#39;originale curli operone è stato modificato in silico al fine di ottimizzare i segnali trascrizionali e traslazionali e sfuggire alla regolazione &quot;naturale&quot; di curli. Questo approccio ha permesso di testare con successo la nostra attuale comprensione della produzione curli. Moreover, semplificando la regolazione curli commutando il promotore endogeno complesso (più di 10 regolatori trascrizionali identificati) per un semplice metallo promotore regolato rende aderenza molto più facile da controllare. La seconda fase prevede la valutazione qualitativa e quantitativa delle capacità di adesione mediante applicazione di metodi semplici. Questi metodi sono applicabili ad una vasta gamma di batteri aderenti indipendentemente strutture biologiche coinvolte nella formazione di biofilm. Prova di aderenza in piastre da 24 pozzetti in polistirene fornisce una visualizzazione rapida preliminare del biofilm batterico dopo colorazione violetto cristallo. Questo test qualitativo può essere affilata per la quantificazione della percentuale di adesione. Tale metodo è molto semplice ma più accurato solo colorazione viola cristallo come descritto in precedenza con 1 sia una buona ripetibilità e riproducibilità. Visualizzazione di batteri GFP-tagged su vetrini con la fluorescenza o conf lasermicroscopia Ocal permette di rafforzare i risultati ottenuti con il 24 pozzetti piastra prova mediante osservazione diretta del fenomeno.

In annotazione silico della sequenza selvatico CSG tipo di E. coli K12 associato con l&#39;ottimizzazione dei segnali trascrizionale e traduzionale ha permesso di progettare il singolo sintetico curli operone P RCN-csg mostrato in Figura 3 (sequenza completa in dati supplementari). Protocollo 2 e del protocollo 3 sono stati utilizzati per visualizzare e quantificare l&#39;aderenza associato alla produzione curli. Usando colorazione viola cristallo su piastre ...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon at JoVE.com

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

La progettazione di un operone codifica sintetico sia l&#39;apparato secretorio ei monomeri di fibre strutturali curli è descritto. Sovrapproduzione di questi amiloidi e polimeri aderenti permette un guadagno misurabile di aderenza del<em&gt; E. coli</em&gt; Telaio<sup&gt; 1</sup&gt;. Un modo semplice per visualizzare e quantificare l&#39;aderenza sono spiegato.

Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

engineering-adherent-bacteria-creating-single-synthetic-curli

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Views.  Université de Lyon. La progettazione di un operone codifica sintetico sia l'apparato secretorio ei monomeri di fibre strutturali curli è descritto. Sovrapproduzione di questi amiloidi e polimeri aderenti permette un guadagno misurabile di aderenza del E. coli Telaio 1. Un modo semplice per visualizzare e quantificare l'aderenza sono spiegato.

Video: Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedura per l&#39;Ingegneria del polmone

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Ricerca

Bioingegneria

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

Sintetico, Multi-Layer, Auto-oscillante Fabrication Vocal modello Fold

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per l&#39;ingegneria tissutale

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.