Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) a MM. Il nostro articolo è in parte supportato da Carl Zeiss Microimaging LLC.

Specie reattive dell&#39;ossigeno può essere misurata in cellule vive con coloranti sensibili all&#39;ossidazione (1 &amp; 2) o utilizzando sensori plasmide (3 e 4) con la microscopia confocale. 1. Visualizzazione dei citosolico ROS nelle cellule J774 <ol><li> Crescere J774.1 topo derivate da monociti macrofagi (10 6 cellule / ml) sul fondo di vetro da 35 mm piatti (Apparecchi di Harvard) per 48 h. </li><li> Cellule sfida con TLR agonisti (2 mg / ml, Lipo-teichoic acido-TLR2 agonista; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3 agonista; 1 mg / ml LPS-TLR4 agonista) per 6 ore a 37 ° C. Nota: I macrofagi trattati in condizioni simili sono state utilizzate per la co-coltura modello mobilitazione Ca 2 +. </li><li> Aggiungere l&#39;ossidazione sensibile colorante H 2 DCF-DA (Invitrogen) per ottenere una concentrazione finale di 10 micron di ECM (extracellulare medio: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10mM glucosio e 2,0% destrano, pH 7,4, tutti ottenuti da Sigma) contenente il 2% BSA ai piatti e cellule incubare per 20 minuti prima visualizzazione al microscopio confocale. </li><li> Dopo aver caricato colorante, visualizzare le cellule posto su un palcoscenico temperatura controllata di un adeguato sistema di imaging. Noi usiamo Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema di imaging confocale accoppiato con sorgente laser ad argon ionizzato ad una eccitazione di 488 nm per DCF fluorescenza con obiettivo 40x olio 13 (Fig. 1 A e D). </li><li> Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ (1,44), il software liberamente disponibile presso il National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. Visualizzazione di cellule J774 MROS nel <ol><li> Crescere J774.1 topo derivate da monociti macrofagi (10 6 cellule / ml) sul fondo di vetro da 35 mm piatti (Apparecchi di Harvard) per 48 h. </li><li>Sfida le cellule con ligandi TLR per indurre la produzione MROS (2 mg / ml, Lipo-teichoic acido-TLR2; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) per 6 ore a 37 ° C. </li><li> Aggiungi superossido mitocondriale indicatore MitoSOX Rosso (Invitrogen) per ottenere una concentrazione finale di 5 micron di ECM contenente il 2% BSA ai piatti e cellule incubare per 30 min a 37 ° C per consentire il caricamento di MitoSOX Rosso. </li><li> Dopo aver caricato colorante, visualizzare le cellule su un palco a temperatura controllata di un obiettivo Carl Zeiss LSM 510 Meta paio sistema di imaging confocale con sorgente laser ad argon ionizzato ad una eccitazione di 561 nm per MitoSOX Red fluorescenza con obiettivo 40x olio (Fig. 1B ed E). </li><li> Per gli esperimenti di controllo, dopo aver caricato colorante aggiungere PBS o DMSO (controllo negativo) o antimicina 2μM A (come superossido mitocondriale generatore-positivo di controllo) per le cellule prima immagine del campione, come descritto in 2.4 (Fig. 1C). </li><li> Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ (1,44). </li></ol> 3. Visualizatisu di citosolica ROS in stabile Hyper-cito MPMVECs <ol><li> Noi usiamo pHyPer-cito (Evrogen) un mammifero codifica vettore di espressione Hyper sensore fluorescente che localizza nel citoplasma e in particolare la concentrazione sensi submicromolar di H 2 O 2 14. </li><li> Trasfettare murini polmonare delle cellule endoteliali microvascolari (MPMVECs) con pHyPer-cito vettore utilizzando elettroporazione o reagenti di trasfezione. Noi utilizziamo 10 x 10 6 cellule e trasfezione con 10μg di pHyPer-cito tramite elettroporazione utilizzando BioRad Gene pulser sistema elettroporatore (250V, 500 uF). MPMVECs cultura nel medio DMEM supplementato con 10% FBS, aminoacidi non essenziali, supplemento di crescita endoteliale e antibiotici. Nota: Dopo la trasfezione, le cellule piastra a bassa densità per facilitare la crescita della colonia. </li><li> Sostituire media con terreno di coltura completo integrato con 500 mg / ml di G418, 48 ore dopo la trasfezione. Schermo di cloni che hanno più alta percentuale di H<html> yPer cellule positive e passaggio cloni Hyper positivo per aumentare il numero di Hyper cellule positive (Fig. 2). Nota: utilizzare la diluizione seriale di cellule per la selezione clonale delle singole cellule e schermo per le cellule che esprimono Hyper altamente stabile. </li><li> Crescita stabile Hyper-cito MPMVECs il 0,2% coprioggetto gelatina rivestito (80 confluenza%). Prossima sfida cellule giornata con ligandi TLR (2 mg / ml, acido-TLR2 lipoteichoic; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) per 6 ore a 37 ° C. Cellule non trattate servire come controllo. </li><li> Dopo il trattamento, montare il coprioggetto sul Attofluor cellule in camera (Invitrogen). Aggiungere 1 ml di pre riscaldato soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) alla camera e posizionare la camera su un palcoscenico temperatura controllata di Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema di imaging confocale. Visualizzare e fluorescenza cambiare immagine ad una eccitazione di 488 nm, usando obiettivo 40x olio (Fig. 3A e D). </li><li> Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ (1,44) (vedi paragrafo 6). </li></ol>DENOMINAZIONE &quot;&gt; 4. Visualizzazione mitocondriale di ROS in stabile Hyper-dMito MPMVECs <ol><li> Noi usiamo pHyPer-dMito (Evrogen) un mammifero vettore di espressione codifica mitocondri mirati Hyper che localizza nella concentrazione sensi submicromolar mitocondri e in particolare di H 2 O 2. </li><li> MPMVECs trasfezione con pHyPer-dMito e generare stabile Hyper-dMito MPMVECs seguenti passaggi descritti nella sezione 3,2-3,3. </li><li> Crescita stabile Hyper-dMito MPMVECs il 0,2% coprioggetto gelatina rivestito (80 confluenza%). </li><li> Prossima sfida cellule giornata con ligandi TLR (2 mg / ml, acido-TLR2 lipoteichoic; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) per 6 ore a 37 ° C. Cellule non trattate servono come controllo negativo. Aggiungi antimicina 2μM Un campione (superossido mitocondriale induttore-positivo di controllo) prima visualizzazione. </li><li> Dopo il trattamento, montare il coprioggetto sul Attofluor cellule in camera (Invitrogen). Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) alla camerae posizionare la camera su un palcoscenico temperatura controllata di Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema di imaging confocale. Visualizzare e cambiare l&#39;immagine di fluorescenza a un&#39;eccitazione di 488 nm, usando obiettivo 40x olio (Fig. 3B, C ed E). </li><li> Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ (1,44) (vedi paragrafo 6). </li></ol> 5. Co-coltura modello per la visualizzazione di paracrini derivati ​​ROS innescato Ca 2 + di segnalazione nelle cellule endoteliali Per la visualizzazione e la misurazione del [Ca 2 +] i cambiamenti usiamo un Ca 2 + colorante fluorescente sensibile fluo-4 AM (Invitrogen). <ol><li> Crescere MPMVECs sul 0,2% di gelatina coprioggetto lastre di vetro 25 millimetri (80 confluenza%). </li><li> Incubare le cellule coltivate su vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti in ECM contenente il 2% BSA e acido Pluronic 0,003% con 5 mM fluo-4 AM (Invitrogen) concentrazione finale per consentire il caricamento di fluo-4 AM. Dopo il caricamento, lavare le cellule con soluzione di imaging sperimentale (ECM contenente 0.25% BSA) contenente sulfinpirazone per minimizzare la perdita colorante. </li><li> Dopo aver caricato fluo-4, montare coprioggetto sul Attofluor cellule in camera (Invitrogen). Aggiungere 800μl di pre riscaldato soluzione sperimentale di imaging per la camera e metterla su un palco a temperatura controllata di Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema di imaging confocale. </li><li> In un&#39;etichetta tubo separare i macrofagi attivati ​​nonactivated o isolate sia da wild-type o gp91 phox-/ - mice (trattati con LPS per 6 ore) con cella inseguitore rosso CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) in ECM contenente il 2% BSA e l&#39;acido Pluronic 0,003%. Lavare e risospendere le cellule con 200μl di soluzione di imaging sperimentale. </li><li> Aggiungi macrofagi etichettati a fluo-4:00 caricato MPMVECs nell&#39;assemblea camera. </li><li> Registrare la fluorescenza verde e rosso ogni 3 secondi per 10-20 min con Carl Zeiss LSM510 Meta sistema di imaging confocale con una sorgente laser ad argon ionizzato con eccitazione a 488 e 561 nm per fluo-4 AM e cellula inseguitore fluorescenza rossa respectively (Fig.4 AC). Nota: in alternativa, J774.1 linea cellulare potrebbe essere usata per suscitare MPMVECs Ca 2 + mobilitazione. </li><li> Analizzare fluo-4 cambia intensità di fluorescenza utilizzando il software ImageJ (1,44) (vedere paragrafo 6). </li></ol> 6. Analisi dei dati utilizzando il software ImageJ Trasferire le immagini ottenute dal sistema confocale come. LSM formato file per l&#39;analisi dei dati. ZEN 2009 e 2010 ZEN software fornito con LSM 510 Meta microscopio confocale LSM 710 o microscopio confocale multiphoton salva rispettivamente i file in formato. LSM. Si consiglia di utilizzare questo natale. Lsm file per l&#39;analisi dell&#39;immagine come qualità originale viene mantenuto. Questo formato di file possono essere aperti direttamente in immagine Immagine analisi J. programma I passi che seguono forniscono un esempio di analisi quantitativa singola immagine. Nessun plugin aggiuntivi sono necessari per questo l&#39;analisi dei dati. <ol><li> Aperto. Lsm o file. TIFF in programma Image J utilizzando File&gt; Apri </li><li> Fare clic sulla scheda IMAGE&gt; COLOR&gt; CANALI SPLIT e dividere i canali verde e DIC. Utilizzare l&#39;immagine dal canale verde per successive analisi. </li><li> Fare doppio clic e selezionare la &#39;selezione ellittica &quot;scheda pennello e impostare il valore del pixel a 20. </li><li> Per Hyper-cito le immagini, cliccare su una singola cella per definire l&#39;area circolare di misura. Quindi premere il tasto &quot;M&quot; per misurare l&#39;intensità della zona selezionata. I valori vengono conservati in una nuova finestra dei risultati. </li><li> Avanti tenendo cliccare su &quot;Shift&quot; in una cella diversa per selezionare un&#39;altra area, seguito premendo il tasto &quot;M&quot;. L&#39;intensità è registrato nella finestra dei risultati. Ripetere i passaggi 4-5 a 50 cellule diverse. </li><li> Per Hyper d-mito immagini, impostare il valore del pixel a 10 nella selezione pennello ellittica. Regione di interesse (ROI) deve essere manualmente tracciata tra i mitocondri delle cellule particolari. </li><li> Utilizzando freehand, traccia la regione di circa mitocondri e quindi premere &quot;M&quot;. Ripetere i passaggi 6-7 su 50 cellule diverse. </li><li> Copiare il me<html> uno dei valori dalla finestra dei risultati e pasta in un foglio Excel o qualsiasi altro software per tracciare i risultati. Noi usiamo sia SigmaPlot o PRISM GraphPad per tracciare i dati come grafico. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati La figura 1 mostra citosolica e mitocondriale produzione di ROS su sfida con ligandi TLR. Rappresentante immagini confocale mostrano aumento del DCF (citosolica) e MitoSOX Rosso (mitocondri) a fluorescenza, dopo 6 ore di stimolazione. Cambiamenti fluorescenza sono stati normalizzati ed espressi come fold change. La figura 2 mostra la generazione di stabili Hyper-cito e iper-dMito cellule endoteliali. Topo cellule endoteliali sono state trasfettate con pHyPer-cito o pHyPer-dMito costruisce plasmide tramite elettroporazione. Plasmidi cellule che esprimono stabilmente sono stati selezionati con G418 per due settimane. Dopo la selezione, le cellule sono state seminate diluito in 96 pozzetti. Singole colonie sono stati isolati e ripreso per l&#39;espressione omogenea. e_content &quot;&gt; La figura 3 mostra la misura della endoteliale citosolica e mitocondriale H 2 O 2 livelli. rappresentante immagini confocale mostrano aumento di Hyper-cito (citosolica) e Hyper-dMito (mitocondri) a fluorescenza, dopo 6 ore di stimolazione. variazioni di intensità di fluorescenza sono stati normalizzati ed espressi come fold change. La figura 4 mostra la valutazione dei macrofagi derivati ​​ROS endoteliali citosolico indotto mobilitazione Ca 2 +. LPS-stimolato macrofagi sono stati aggiunti sul microcircolo polmonare delle cellule endoteliali (PMVEC) che era stato precedentemente caricato con il intracellulare di Ca 2 + ([Ca 2 +] i) indicatore colorante Fluo-4. Applicazione di tipo selvaggio LPS-macrofagi attivati ​​evocato un [Ca 2 +] i PMVECs aumento che è stato attenuato per KO di NADPH ossidasi funzionale (gp91 phox-/ -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Visualizatisul cellulare di macrofagi generato ROS e superossido mitocondriale. J774.1 cellule si sono sfidati con leganti TLR2, 3 e 4 (2 mg / ml, acido-TLR2 lipoteichoic; 10μg/ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4). Per 6 ore a 37 ° C. Dopo il trattamento le cellule sono stati caricati con (A) cellulare ROS indicatore (H 2 DCF-DA; fluorescenza verde) o (B) Indicatore superossido mitocondriale (MitoSOX Rosso; fluorescenza rossa). (C) antimicina A è stato utilizzato come controllo positivo per la produzione mitocondriale di ROS. Variazioni di intensità di fluorescenza sono stati valutati usando la microscopia confocale. (D) e (E) La determinazione quantitativa di variazione media fluorescenza. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Rappresentazione schematica di generare l&#39;espressione stabile di citosolica delle cellule endoteliali e indicatori ROS mitocondriali. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. V. isualization di endoteliali citosolica e mitocondriale H 2 O 2 livelli MPMVECs esprimono stabilmente (A) di Hyper-cito o (B) di Hyper-dMito si sono sfidati con leganti TLR2, 3 e 4 (2 mg / ml, acido-TLR2 lipoteichoic; 10μg / ml, Poli (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) per 6 ore a 37 ° C. (C) antimicina A è stato utilizzato come controllo positivo per la produzione mitocondriale di ROS. Dopo il trattamento, i cambiamenti intensità di fluorescenza sono stati valutati usando la microscopia confocale. (D) e (E) La determinazione quantitativa di variazione media fluorescenza. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Macrofagi derivati ​​ROS suscitare alterata delle cellule endoteliali Ca 2 + mobilitazione. (A) Rappresentazione schematica delle cellule endoteliali / macrofagi di co-coltura studio del modello. (B), macrofagi murini appena isolate sia da topi WT e gp91phox null (The Jackson Laboratory) sono stati attivati ​​da 1 mg / ml LPS per 6 ore Macrophages sono stati etichettati con cellule-tracker Red (rosso) e adattata Fluo-4 PMVECs caricato (verde) per valutare paracrino O 2 • -. segnalazione (C) LPS-activated macrofagi isolati da topi WT innescato ampie e rapide mobilitazione Ca 2 + in PMVECs rispetto ai macrofagi da topi nulli gp91phox. Validazione di attivazione dei macrofagi è stato dimostrato in precedenza.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo qui descritto consente di misurare rapidamente e quantitativa delle specie reattive dell&#39;ossigeno nelle cellule viventi sia utilizzando coloranti ossidazione sensibili o sensori plasmide. Agonisti dei TLR (Toll-like receptors) sono composti che stimolano le cellule attraverso il TLR presenti sulla superficie cellulare e attivare le vie di segnalazione a valle 15. Nel nostro protocollo, abbiamo utilizzato tre diversi cioè TLR agonisti, Lipo-teichoic acido-TLR2 agonista, Poli (I: C). TLR3-agonist...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Attofluor cellule in camera </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> Un antimicina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM medio bassi di glucosio </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> Fattore di crescita endoteliale supplemento (ECG) </td><td> Upstate </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Red </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM ho ridotto Media siero </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer-cito </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poli (I: C) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Il software Prism 5,0 </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11,0 </td><td> Systat software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 fiasche </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T-75 fiasche </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96-T eC micro pozzetti </td><td> BD Falcon </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Zen 2009 il software </td><td> Carl Zeiss 510 Meta microscopia confocale </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

Lo stress ossidativo è stato implicato in una serie di condizioni patologiche tra cui ischemia / riperfusione danni e sepsi. Il concetto di stress ossidativo si riferisce alla formazione aberrante di ROS (specie reattive dell&#39;ossigeno), che includono O 2 • -, H 2 O 2, e di radicali idrossili. Specie reattive dell&#39;ossigeno influenza una moltitudine di processi cellulari tra cui trasduzione del segnale, proliferazione cellulare e la morte delle cellule 1-6. ROS hanno il potenziale di danno vascolare e le cellule degli organi direttamente, e può avviare reazioni chimiche secondarie e alterazioni genetiche che alla fine risultare in un ampliamento del periodo iniziale di ROS-mediate danni ai tessuti. Una componente chiave della cascata di amplificazione che aggrava un danno irreversibile del tessuto è il reclutamento e l&#39;attivazione delle cellule infiammatorie circolanti. Durante l&#39;infiammazione, le cellule producono citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-α (TNF) e IL-1 cheattivare le cellule endoteliali (CE) e le cellule epiteliali e ulteriormente aumentare il 7 risposta infiammatoria. Disfunzione endoteliale vascolare è una caratteristica consolidata di infiammazione acuta. Macrofagi contribuire alla disfunzione endoteliale durante l&#39;infiammazione con meccanismi che rimangono poco chiari. Attivazione dei macrofagi risultati nel rilascio extracellulare di O 2 • - e varie citochine pro-infiammatorie, che attiva segnali patologici nelle celle adiacenti 8. NADPH ossidasi sono la fonte principale e primario di ROS nella maggior parte dei tipi di cellule. Recentemente, è dimostrato da noi e gli altri 9,10 che ROS prodotta da NADPH ossidasi indurre la produzione mitocondriale di ROS durante molte condizioni fisiopatologiche. Quindi misurando la produzione mitocondriale di ROS è altrettanto importante oltre a misurare citosolico ROS. I macrofagi producono ROS dalla NADPH ossidasi enzima flavoproteina che svolge un ruolo primario nel processo infiammatorio. Una volta attivato,NADPH ossidasi fagocitica produce grandi quantità di O 2 • - che sono importanti nel meccanismo di difesa dell&#39;ospite 11,12. Anche se paracrino derivati ​​O 2 • - gioca un ruolo importante nella patogenesi delle malattie vascolari, la visualizzazione di segnali paracrini intracellulare di ROS-indotta tra Ca 2 + mobilitazione è ancora un&#39;ipotesi. Abbiamo sviluppato un modello in cui vengono utilizzati macrofagi attivati ​​come fonte di O 2 • - per trasdurre un segnale adiacente cellule endoteliali. Utilizzando questo modello abbiamo dimostrato che macrofagi derivati ​​O 2 • - portare al calcio di segnalazione in cellule endoteliali adiacenti.

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Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ​​ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.

Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

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Biology

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

15.4K Views.  Temple University. Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ​​ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Tecniche di Imaging Ca 2 + Segnalazione di sperma umano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

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Biologia

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells downstream of pattern recognition receptors. Best studied are the Dectin-1 and Dectin-2 members of the C-type lectin-like receptor family that induce a SYK- and CARD9-dependent signaling cascade leading to NF-&#954;B activation, in a MALT1-dependent manner. By contrast, Toll-like receptors (TLR), such as TLR-4, propagate NF-&#954;B activation but signal via an MYD88/IRAK-dependent cascade. Nonetheless, whether MALT1 might contribute to TLR-4 signaling has remained unclear. Recent evidence with MLT-827, a potent and selective inhibitor of MALT1 paracaspase activity, indicates that TNF- production downstream of TLR-4 in human myeloid cells is independent of MALT1, as opposed to TNF- production downstream of Dectin-1, which is MALT1 dependent. Here, we addressed the selective involvement of MALT1 in pattern recognition sensing further, using a variety of human and mouse cellular preparations, and stimulation of Dectin-1, MINCLE or TLR-4 pathways. We also provided additional insights by exploring cytokines beyond TNF-, and by comparing MLT-827 to a SYK inhibitor (Cpd11) and to an IKK inhibitor (AFN700). Collectively, the data provided further evidence for the MALT1-dependency of C-type lectin-like receptor &#8212;signaling by contrast to TLR-signaling.

MALT1 regulates innate immunity but how this occurs remains ill-defined. We used the selective MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 to unravel the contribution of MALT1 to innate signaling downstream of Toll-like or C-type lectin-like receptors, demonstrating that MALT1 regulates the production of myeloid cytokines, and downstream of C-type lectin-like receptors, selectively.

Mieloide innata Signaling Pathway regolamento da MALT1 Paracaspase attività

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...