Questo lavoro è finanziato dal Wellcome Trust, il Medical Research Council, della Royal Society, Birmingham Science City e The Research Trust infertilità. Vorremmo riconoscere l&#39;assistenza di esperti di ricerca Cairn nella costruzione e integrando gli impianti di perforazione di imaging.

Spermatozoi da soggetti sani fertile, con un esame dello sperma normale, sono normalmente preparati per l&#39;imaging come segue. <ol><li> Campioni di sperma sono conservati a 37 ° C per non più di 30 min. Le cellule sono isolate dal plasma seminale di nuotare fino in integrato la soluzione di Earle salina bilanciata (sEBSS; mM: 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 0,7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, NaCl 116,4, 55,6 D-glucosio, piruvato 2,73 Na, 41,8 lattato Na) integrata con lo 0,3% carbone de-lipidated/fatty libero Frazione acido V BSA (qualità della BSA è cruciale per il successo di capacitazione dello sperma). 1 ml di sEBBS è pipettato in ciascuno di una serie di provette da 5 ml e delicatamente underlayered con 0,3 ml di sperma. Dopo l&#39;incubazione per 1 ora (37 ° C, 6% di CO 2) la parte superiore 0,7 ml viene delicatamente rimosso da ogni provetta e in pool. 10 microlitri della sospensione di spermatozoi viene diluito con 90 ml di 1% (v / v) formalina per immobilizzare le cellule, poi gli spermatozoi vengono conteggiati in una camera di Neubauer. Densità delle cellule nella sospensione viene quindi regolata (con sEBSS) a 6 milioni di cellule / ml. </li><li> Il campione viene quindi diviso in aliquote di 200 microlitri in tubi loosely-ricoperti e incubate (37 ° C, 6% di CO 2) a per 5-6 h per consentire capacitazione. </li><li> Coprioggetti (22x50 mm) sono stati precedentemente trattati con poli-D-lisina. 10 ml di poli-D-lisina soluzione (10% w / v) viene applicato come un certo numero di piccole gocce al centro del vetrino. La poli-D-lisina è poi lasciati asciugare all&#39;aria. Questo può essere su un palco riscaldato e deve essere a completo essiccamento. Un copri è attaccato con grasso per vuoto ad un chiuso, appositamente costruito, perfusable, policarbonato immagini da camera (dimensioni 35 mm x 20 mm x 5 mm; capacità ≈ 180 microlitri). Analoga alla camera di Warner RC20 La poli-D-lisina- coprioggetto rivestito costituisce la base della camera quando le cellule sono visualizzati su un microscopio invertito e una da 12 mm di diametro circolare coprioggetto forma la superficie superiore della camera, consente la trasmissione di luce. </li><li> Oregon verde BAPTA1-AM (OGB) o calcio Verde 1-AM sono usati per le cellule etichettatura. OGB si prepara sciogliendo in DMSO. Pluronic acido F127 (un detergente) è incluso nel DMSO per evitare &#39;aggregazione&#39; del colorante. Questo può essere preparato in laboratorio (100 Pluronic mg in 0,5 ml di DMSO), immediatamente prima dell&#39;uso, o può essere acquistato già pronto. 20 l è aggiunto ad una aliquota di OGB 50 mg (2,5 mg / ml). Il flaconcino può essere quindi conservati congelati e scongelati per un uso successivo. </li><li> Dopo la capacitazione dello sperma (5-6 h in sEBBS, 37 ° C, 6% di CO 2) è stato selezionato un tubo per l&#39;imaging e 1,2 ml di soluzione OGB si aggiunge, dando una concentrazione finale di 10 micron. Il tubo viene quindi incubato per altri 40 minuti, dopo di che la sospensione cellulare viene iniettata dolcemente nella porta della camera di afflusso di immagini con un p1000 (blu) puntale. La camera si trova nel lato coprioggetti incubatore, poli-D-lisina rivestite in giù, per 20 minuti. Cellule tendono a nuotare lungo le superfici della camera e aderire al poli-D-lisina rivestite zona. </li><li> La camera è ora montato sul microscopio, sono collegati agli apparecchi e perfusione perfuso a circa 0,5 ml / min. Una pompa a rulli alimenta salina nella camera e troppo pieno dalla porta di uscita viene rimosso da una pompa di aspirazione con trappola. La preparazione è lasciato al buio per almeno 10 minuti, mentre le cellule sciolte e tintura extracellulare vengono rimossi dalla perfusione della camera. Stabilità della temperatura è di fondamentale importanza perché piccole fluttuazioni non possono incidere solo sul cellulare di Ca 2 + omeostasi, ma può colpire anche K d del colorante. Gli esperimenti sono normalmente effettuate a 25 ° C, ottenuta mantenendo la temperatura della stanza buia a questo livello. Abbiamo scoperto che mantenere la temperatura ambiente al livello richiesto offre una maggiore stabilità di temperatura e attenzione rispetto all&#39;utilizzo di una fase a temperatura controllata o di un riscaldamento termostatato sull&#39;afflusso salina. </li><li> Le cellule sono visualizzati in contrasto di fase (40x o 60x ad immersione in olio) obiettivo e un&#39;area per l&#39;imaging è selezionata. La porzione di poli-D-lisina zona rivestita che è vicino alla porta d&#39;ingresso è preferito, dove il flusso salino è laminare e coerente. E &#39;inoltre importante utilizzare una zona dove la densità delle cellule è appropriata (densità eccessiva influisce sulla qualità e integrità dei dati attraverso la ripresa del segnale da celle adiacenti) e dove le cellule sono adeguatamente collegati, ma l&#39;attività flagellare è visibile. Un&#39;immagine contrasto di fase è salvato. Il microscopio è poi passa alla modalità a fluorescenza (eccitazione 480 nm, emissione di 540 nm) e di esposizione sia ridotto al minimo il tempo necessario per ottenere una chiara immagine di fluorescenza (di solito 50-200 ms). </li><li> L&#39;esperimento è iniziato da tempo attivando la serie software di acquisizione immagini (IQ). Di solito le immagini sono acquisite a 0,1 Hz e l&#39;illuminazione è limitato ai periodi di acquisizione di immagini solo usando un Software otturatore controllato. Maggiore velocità di acquisizione dell&#39;immagine può essere utilizzato, ma occorre tener conto per problemi di sbiancamento e la generazione di artefatti dovuti a foto-danni alle cellule (vedi discussione). IQ (e la maggior parte altre piattaforme software di acquisizione) consentirà in tempo reale, grafici di fluorescenza durante l&#39;esperimento. </li><li> Dopo un periodo di controllo di 3-5 minuti Durata manipolazione di costituenti salini (come ad esempio [Ca 2 +] o) e l&#39;applicazione di farmaci si ottiene la sostituzione di soluzione salina nell&#39;intestazione perfusione. Tempo di aggiunta di ogni stimolo è notato in modo che l&#39;orario di arrivo nella camera di imaging può essere calcolato, garantendo precisione sufficiente per la valutazione delle risposte lento qui descritti (campionato a 0,1 Hz). Per le risposte più rapide maggiore precisione si può ottenere con l&#39;aggiunta di stimoli direttamente al flusso di soluzione salina attraverso una porta afflusso secondo quanto previsto nel RC20 Warner camera. </li><li> Le immagini sono analizzate in linea con IQ. Regioni di interesse (ROI) sono del giro ogni cella (o parte di cellulari) e anche una zona cella libera è selezionata (per la sottrazione del fondo automatico dal software. La serie di immagini viene poi controllato per rimuovere le cellule che sono morti o sono stati sottoposti reazione acrosomiale ( che appare come un consistente e rapido aumento della fluorescenza seguita dalla perdita di colorante citoplasmatica) durante l&#39;esperimento e quelli che hanno mostrato il movimento sufficiente a causare artefatti quando analizzata come una serie temporale. </li><li> Un tempo-fluorescenza serie intensità è poi ottenuto per ogni ROI e questi dati vengono analizzati in linea in Excel. Inizialmente fluorescenza è normalizzato al valore medio ottenuto durante il periodo di controllo, utilizzando l&#39;equazione R = [(FF riposo) / F resto] x 100%, dove R è il cambiamento della fluorescenza% rispetto al periodo di controllo,, F è l&#39;intensità di fluorescenza in un tempo t ed il resto F è la media di almeno 30 determinazioni di F ottenuti durante il periodo di controllo. </li></ol> Rappresentante Risultati La figura 1 mostra una serie di immagini da un esperimento in cui le cellule sono state stimolate con 3 mM progesterone. La riga superiore e film 1 mostrano le immagini di fluorescenza in scala di grigi e la stessa maghi sono riportati di seguito (e nel film 2) in pseudocolori (&#39;16_colors lookup table &#39;in Image J), ​​dove&#39; cool &#39;colori indicano bassa intensità e fluorescenti &#39;caldi&#39; colori indicano alta intensità di fluorescenza. Le celle possono essere visualizzati in pseudocolore durante l&#39;esperimento, utilizzando tabelle di ricerca in intelligenza, ma con scala di grigi è generalmente più informativo per la valutazione. Se le cellule sono ben etichettati. Le prime due immagini sono state raccolte a 0 s e 100 s dopo l&#39;inizio della registrazione. Fluorescenza deve essere stabile e tende ad essere più forti nella zona posta acrosomiale e del collo sperma. Il progesterone è entrato nella camera di imaging a circa 175 s ed il 3 ° e 4 ° delle immagini (180 s e 220 ​​s) mostra un rapido aumento della [Ca 2 +] i (fluorescenza) originarie della testa e del collo posteriore della cellula. Immagini successive sono a 290, 360, 740, 990 e 1440 s, mostrando il decadimento del periodo iniziale di [Ca 2 +] i transitori e lo sviluppo di una elevazione secondaria sostenuta. La figura 2 mostra un&#39;analisi foglio di calcolo, di conversione raw valori di fluorescenza per ogni ROI a fluorescenza normalizzata (variazione% della fluorescenza rispetto al periodo di controllo) La figura 3 mostra trame fluorescenza tempo normalizzato per 3 celle che mostrano &#39;tipico&#39; risposte a 3 mM progesterone. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esempio di dati da una cella stimolati con progesterone. Una serie di immagini di fluorescenza in scala di grigi (riga superiore) e pseudocolori (fila inferiore) sono mostrati. Punti di tempo sono 0, 180, 220, 290, 360 e 990. 3 progesterone microM entrato nella camera di imaging a 175 s. ROI sono mostrati nel primo pannello. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Analisi dei dati singoli fluorescenza cella in Excel. Figure in nero sono serie temporali di dati di fluorescenza, disposti verticalmente. I valori in rosso (sotto) sono dati normalizzati ottenuti usando l&#39;equazione data nel testo. Il grafico mostra normalizzato fluorescenza in tempo trama per 64 celle in questo esperimento che, su stimolo, mostra un aumento transitorio della fluorescenza seguita da una crescita lenta e una serie di piccole oscillazioni. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Fluorescenza in tempo le tracce per 3 celle individuali, espresso come variazione% rispetto al valore di controllo .. 3 mM progesterone è stato aggiunto al momento segnato dalla freccia. Mostra la linea tratteggiata significa fluorescenza di controllo.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Se eseguite con successo, questa tecnica permette di registrare la distribuzione e la cinetica di spontaneo e indotto Ca 2 + segnali di sperma umano. Le risposte possono essere ottenute da un gran numero di cellule (fino a 200) che è importante in quanto lo sperma umano può mostrare un sacco di variazione nella loro spontanea e stimolata Ca 2 + segnali. L&#39;etichettatura di successo e la sopravvivenza delle cellule durante la registrazione sono altamente dipendenti sulla qualità del campione. Campioni poveri danno etichettatura poveri, le risposte poveri e le cellule possono morire durante la registrazione. Spermatozoi umani sono molto sensibili al foto-danni e quindi utilizzare l&#39;illuminazione minima necessaria (sia l&#39;intensità e tempo di esposizione) al fine di massimizzare la sopravvivenza cellulare e ridurre al minimo gli artefatti dovuti alla morte delle cellule. Una telecamera ad alta sensibilità (permettendo l&#39;uso di illuminazione a bassa intensità) è un grande vantaggio in quanto la telecamera riprenderà fluorescenza debole. Retro-illuminato, EM-CCD sono particolarmente adatti, anche se molto costoso. Illuminazione a LED (invece di utilizzare una lampada allo xeno o mercurio con filtro di eccitazione migliora anche la sopravvivenza delle cellule (Nishigaki et al, 2006). Non usiamo Fura-2, nonostante i vantaggi evidenti del rapporto-metrica delle immagini, perché Fura richiede l&#39;eccitazione con luce UV e perché è necessario prendere due immagini per ogni rapporto. Per i dati ottenuti con singola lunghezza d&#39;onda, coloranti luce visibile, la normalizzazione della fluorescenza compensa ampiamente la differenza di carico colorante tra le cellule, ma non per la distribuzione colorante all&#39;interno di una singola cellula, e questo deve essere tenuto presente. Sebbene coloranti singola lunghezza d&#39;onda può, in linea di principio, essere calibrato, l&#39;accuratezza della tecnica è scarsa e non tentiamo di fare questo. Considerando che i dati ottenuti con rapporto di Fura-2 (o l&#39;emissione rapporto colorante indo), anche senza calibrazione, dare una rappresentazione accettabile fedele di variazioni relative a [Ca 2 +] i, l&#39;intensità di fluorescenza dei coloranti singola lunghezza d&#39;onda è tutt&#39;altro che linearmente relative alla [Ca 2 +] i. Sopra la parte più utile della curva di saturazione del rapporto per le tinture singola lunghezza d&#39;onda si avvicina di solito a logaritmica. Al momento stiamo utilizzando Oregon Verde Bapta-1 (Figura 4), ​​perché è sensibile alle piccole variazioni [Ca 2 +] i di riposo vicino al livello s (50-100 nM). Quando [Ca 2 +] i supera 1 risposte microM saranno sottorappresentati in termini di cambiamento di fluorescenza e il colorante può saturare. Un&#39;opzione per il miglioramento della tecnica senza ricorrere a eccitazione UV è di raddoppiare celle di carico con un colorante come Fluo-3 e Fura rosso. Entrambi possono essere eccitato a 488 nm, ma contemporaneamente le loro risposte sono molto diverse. Registrazione di emissione a 540 e 650 nm fornisce un rapporto che può fornire un metodo migliore per un accurato monitoraggio di [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) e possono essere applicabili allo sperma (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Relazione tra libera [Ca 2 +] (nm) ed emissione di fluorescenza a lunghezza d&#39;onda massima (circa 525 nm) per Oregon Verde Bapta-1 e Oregon verde Bapta-2. OGB1 dà una maggiore fluorescenza a riposo [Ca 2 +] ma satura a livelli più bassi e quindi ha un range più piccolo utilizzabile. Dati per tali appezzamenti sono stati ottenuti dal Molecular Probes manuale (Haughland, 2002).

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

Microscopia a fluorescenza di cellule caricate con fluorescenti, Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibile coloranti viene utilizzato per la misurazione degli aspetti spaziali e temporali di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnalazione in cellule vive. Qui si descrive il metodo utilizzato nei nostri laboratori per caricare sospensioni di sperma umano con Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnalazione coloranti e misurando il segnale di fluorescenza durante la stimolazione fisiologica. Cellule mobili sono isolati diretto swim-up e incubate in condizioni capacitating per 0-24 ore, a seconda dell&#39;esperimento. La cellula-permeanti AM (acetossi estere metilico) forma estere del Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnalazione colorante viene poi aggiunto ad una aliquota di cellule e un periodo di 1 h è consentito per il caricamento del colorante nel citoplasma. Noi usiamo coloranti lunghezza d&#39;onda visibili per minimizzare foto-danni alle cellule, ma questo significa che la registrazione raziometrico non è possibile. Vantaggi e svantaggi di questo approccio sono discussi. Durante il periodo di celle di carico sono inseriti in una camera di imaging e il permesso di aderire ad una poli-D-lisina coprioggetto rivestito. Alla fine del colorante periodo di carico in eccesso e le cellule vengono rimosse da perdere il collegamento della camera per l&#39;apparato di perfusione. La camera è perfuso continuamente, stimoli e saline modificati vengono poi aggiunti all&#39;intestazione perfusione. Gli esperimenti vengono registrati dal time-lapse acquisizione di immagini a fluorescenza e analizzati in dettaglio in linea, disegnando manualmente le regioni di interesse. I dati sono normalizzati a pre-stimolo livelli tali che, per ogni cella (o parte di una cellula), un grafico che mostra il Ca<sup&gt; 2 +</supRisposta&gt; come il cambiamento% della fluorescenza si ottiene.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimolo-evocato [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] I segnali dei singoli spermatozoi umani sono valutati. Cellule mobili sono caricati con Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibili colorante fluorescente (AM-estere metodo) e immobilizzato in una camera perfusable. Le cellule sono ripreso dal time-lapse microscopia a fluorescenza e stimolato attraverso il medium di perfusione. Le risposte di singole cellule (o regioni) sono analizzati in linea con Excel.

Tecniche di Imaging Ca 2 + Segnalazione di sperma umano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K Views.  University of Birmingham. Stimolo-evocato [Ca 2 +] I segnali dei singoli spermatozoi umani sono valutati. Cellule mobili sono caricati con Ca 2 + Sensibili colorante fluorescente (AM-estere metodo) e immobilizzato in una camera perfusable. Le cellule sono ripreso dal time-lapse microscopia a fluorescenza e stimolato attraverso il medium di perfusione. Le risposte di singole cellule (o regioni) sono analizzati in linea con Excel.

Video: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imaging di neuroni Corpo funghi durante l&#39;apprendimento olfattivo nel Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un alto contenuto di flusso di lavoro di imaging per studiare GRB2 Centri di segnalazione di espressione clonazione

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitori e correnti di membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Misurare intracellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...