Questa ricerca è stata sostenuta dal Brigham &amp; Women&#39;s Hospital e dalla Marcia di Dimes. Gli autori vorrebbero ringraziare tutti i membri del Lab Whited per il loro supporto e consulenza.

Tutta la sperimentazione dell&#39;assolotl è stata eseguita in accordo con il comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali di Brigham e dell&#39;ospedale femminile (BWH). 1. Impostare Esperimento di Perfusion <ol><li> Posizionare un axolotl adulto in un contenitore di plastica riempito con soluzione 0,1% di tricina (MS222) per 15-20 min o fino a quando completamente anestetizzato. Assicurarsi che il contenitore sia riempito con sufficiente soluzione di triciclici in modo che l&#39;axolotl sia completamente sommerso. Nota: Tutte le procedure devono essere eseguite in conformità alle istruzioni istituzionali per la cura degli animali. A BWH, un axolotl è considerato completamente anestetizzato quando non riesce a provare un pizzicotto, il che significa che non c&#39;è movimento riflessivo quando il piede viene spremuto dolcemente. Attenzione: Anche se la tricina è un anestetico specificamente utilizzato per gli organismi acquatici, è necessario evitare il contatto diretto della pelle con la soluzione tricina. </li><li> Impostare la stazione di perfusione axolotl. <ol><li> Posiziona ilRilievo assorbente su una superficie piana e livellata con il lato assorbente rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Tagliare un foro nel telaio in polistirolo espanso che è la dimensione e la forma appropriati per l&#39;assolotolo anestetizzato per giacere in posizione supina. Posizionare il telaio sul tampone assorbente. Nota: alcuni tovaglioli di carta supplementari possono essere posizionati immediatamente sotto il telaio per ulteriori assorbimenti. </li><li> Caricare la pompa peristaltica con il tubo di perfusione. Impostare la pompa ad una portata di 0,7 ml / min, che scorre in senso orario. </li><li> Preparare la soluzione diluita con 0,7x PBS e 5% di glucosio in una miscela 1: 4. </li><li> Mescolare 10 ml di soluzione diluente con 200 μL della soluzione di base DiI in un tubo conico da 50 ml. Coprire e mescolare per inversione. Coprire questo tubo con carta in alluminio per proteggere la soluzione di lavoro dall&#39;esposizione alla luce. Nota: i volumi dovrebbero essere modificati in base alla dimensione dell&#39;assolotl proporzionalmente. Questi valori sono per un axolotl di circa 15 cm (lunghezza da coda a coda). UNI nomi di questa dimensione non possono avere raggiunto la piena maturità sessuale, quindi il sesso animale non può essere determinato in questo momento. </li><li> Riempire un tubo conico da 50 ml con 0,7x PBS. Nota: PBS verrà utilizzato per l&#39;innesco del ciclo e dell&#39;exolinguizzazione dell&#39;assolotl. </li><li> Fissare l&#39;ago a farfalla a 27 gauge all&#39;estremità di uscita del tubo di perfusione. Piegare le ali delle farfalle su un altro e collocare nel supporto del morsetto. </li><li> Posizionare l&#39;estremità libera del tubo di perfusione nel tubo conico da 50 ml riempito di 0,7x PBS e eseguire la pompa di perfusione fino a quando l&#39;intero tubo è riempito di soluzione. Sospendi la pompa una volta che l&#39;intero tubo è riempito con PBS. Nota: assicurarsi che il tubo sia privo di bolle d&#39;aria in qualsiasi momento, in quanto ciò provocherà l&#39;embolia nell&#39;assolotl e impedisce la perfusione completa. </li><li> Mettere un tovagliolo di carta nello stampo a forma di axolotl nel telaio in polistirolo espanso. Usando una pipetta di trasferimento, immergere l&#39;asciugamano con la soluzione di tricaine. Nota: Tagliare un piccolo quadrato in mezzo alla trama della cartaEl per consentire il drenaggio dei fluidi durante la procedura di perfusione. </li><li> Posizionare l&#39;axolotl anestetizzato supino sul tovagliolo di carta all&#39;interno del telaio in polistirene espanso. </li></ol></li></ol> 2. Apertura della cassa dell&#39;Asolotl <ol><li> Utilizzare pinze chirurgiche per pizzicare la pelle lungo l&#39;asse centrale del petto dell&#39;assolotl, appena sotto la linea delle spalle. Tirare in su. </li><li> Usa un bisturi per fare una piccola incisione dove la pelle è stata tirata. </li><li> Rimuovere una patch quadrata di pelle sopra il torace per rivelare due piastre di cartilagine. <ol><li> Rimuovi la pelle per aprire una finestra sulla cavità toracica abbastanza grande da vedere chiaramente il cuore e circa 5 mm dell&#39;aletta che si ramifica dal cuore. </li></ol></li><li> Attentamente strappare il tessuto connettivo con pinze o forbici chiuse per evitare di tagliare i vasi sanguigni più importanti. </li><li> Sollevare ciascuna piastra di cartilagine singolarmente usando le pinze e scambiandoleCon le forbici chirurgiche. </li><li> Stringere con cautela il pericardio con le pinze, sollevare e forzarlo con le forbici chirurgiche; Questa incisione dovrebbe essere abbastanza profonda da percuotere il pericardio molto sottile e dovrebbe essere abbastanza grande da permettere la rimozione del pericardio. Fare attenzione a non tagliare il cuore. </li><li> Rimuovere delicatamente il pericardio per esporre il cuore e l&#39;aorta. Nota: Usando una pipetta di trasferimento, periodicamente sciacquare la cavità toracica e le gole con la soluzione tricaine per mantenere l&#39;area chiara e mantenere l&#39;axolotl anestetizzato. </li></ol> 3. Perfusione dell&#39;Asolotl <ol><li> Posizionare lo staffa con l&#39;ago a farfalla caricato accanto al telaio in polistirolo espanso, in modo tale che il braccio del morsetto possa essere facilmente manipolato per inserire l&#39;ago nell&#39;aletto axolotl. Puntare la punta dell&#39;ago verso l&#39;aspetto rostralo dell&#39;animale durante l&#39;inserimento e mantenere l&#39;ago parallelo all&#39;aorta per evitare di perforarla attraverso l&#39;opLato positiva. </li><li> Accendere la pompa peristaltica. 0.7x PBS dovrebbe continuare a fluire attraverso il tubo. </li><li> Inserire l&#39;ago nell&#39;aletta. <ol><li> Far scivolare la pinza sotto l&#39;arco aortico e sollevare leggermente per consentire un facile accesso. </li><li> Manovrare la combinazione di aghi-ago in modo tale che l&#39;ago corre lungo la lunghezza dell&#39;arto, rivolto verso la testa. Inserire l&#39;ago durante l&#39;uso della pinza per il supporto dietro l&#39;aorta. Nota: L&#39;ago deve essere inserito abbastanza profondamente nell&#39;aorta per assicurarsi che non scivoli durante la perfusione. Questo può essere di circa 5 mm per un axolotl da 15 cm. Assicurarsi che l&#39;ago sia perfettamente in linea con l&#39;aorta per evitare la completa foratura del vaso. Le puncture attraverso-e-through possono causare emorragie massicce e diminuire i tassi di successo della perfusione. L&#39;inserimento riuscito può essere confermato dall&#39;allargamento visibile dell&#39;atria del cuore. </li></ol></li><li> Rapidamente lacerate un atrio con la sciSsors e consentire il sangue di scarico. <ol><li> Sciacquare con la soluzione tricaina per prevenire l&#39;accumulo di sangue e la formazione di coaguli nella cavità toracica. </li></ol></li><li> Perfuse l&#39;axolotl con circa 20-30 mL di PBS. L&#39;animale dovrebbe cambiare da rosa chiaro in colore a bianco in una perfusione di successo. </li><li> Sospendi la pompa peristaltica e sposta l&#39;estremità libera del tubo nel tubo da 15 ml di soluzione DiI. Riavviare la pompa, fai attenzione a non creare delle bolle d&#39;aria nel tubo. </li><li> Perfuse l&#39;axolotl con l&#39;intero stock di DiI. Nota: in una perfetta perfusione, l&#39;axolotl con colore cambiato al rosa brillante della DiI. Questo sarà più evidente nelle cavità. </li><li> Sospendi la pompa dopo la perfusione con DiI è completa e metta l&#39;estremità libera del tubo in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per fissare il tessuto. Riavviare la pompa e perfezionare almeno 10 mL di PFA. Attenzione: il PFA è tossico e deve essere manipolato e dispoSed di appropriato. Guanti e occhiali di protezione devono essere indossati e soluzioni devono essere fatte all&#39;interno di un cappuccio. La perfusione dell&#39;assolotl con PFA per fissare i tessuti provoca la morte dell&#39;animale. </li></ol> 4. Terminare la preparazione della perfusione e della visualizzazione <ol><li> Arrestare la pompa peristaltica e rimuovere l&#39;ago dall&#39;alettone axolotl. </li><li> Posizionare l&#39;axolotl su una piastra di plastica. Nota: Utilizzando una metà di un grande piatto di Petri funziona bene e permette di versare una piccola quantità di Tricaine o PBS sull&#39;assolotl per mantenere la pelle bagnata e migliorare la qualità della visualizzazione. </li><li> Smaltire tutti i materiali utilizzati nei contenitori idonei. Pulire gli attrezzi chirurgici con il 70% di etanolo, disinfettare con uno sterilizzatore di vetro tra gli animali e sterilizzare mediante autoclave seguendo la procedura. Infilare il tubo con la soluzione PBS e quindi scolare, asciugare completamente e conservare per ulteriori impieghi. </li></ol> 5. Visualizzare l&#39;Axolotl Perfuso <ol&gt; <li> Posizionare l&#39;axolotl sotto un microscopio confocale fluorescente. </li><li> Spegni le luci come la visualizzazione delle navi trattate con DiI è ostacolata dalla luce. </li><li> Utilizzare un cubo di filtro per emissione di fluorescenza verde ( ad es. ET-CY3) con il microscopio confocale per visualizzare la vascolarizzazione dell&#39;assolotl. Utilizzare la luce di eccitazione della lunghezza d&#39;onda 545 nm. Nota: Per ottenere un&#39;immagine di alta qualità, è possibile utilizzare i seguenti parametri: esposizione per 1,1 s, guadagno di 1x, saturazione di 1,0, ingrandimento di 2X. </li></ol>

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	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

La visualizzazione della vasculatura dell&#39;assolotl può essere ottenuta con perfezionamento con il colorante lipocilico di carbocyanina, DiI. In questo studio descriviamo un nuovo protocollo per la perfusione dell&#39;assolotl con DiI usando una pompa peristaltica. Mostriamo anche la successiva visualizzazione della vasculatura axolotl utilizzando un microscopio confocale fluorescente. Questo protocollo è stato un adattamento del protocollo di perfusione di roditore DiI visto in Li et al. <sup class="xref"...

La visualizzazione della vascolarizzazione svolge un ruolo fondamentale nella comprensione della struttura e della funzione degli organismi in molte specie. A partire dal XVI secolo con Leonardo da Vinci sono stati studiati modelli e rappresentazioni grafiche della circolazione 1 . Utilizzando cere e stampi di gomma, i tessuti sono stati perfusi per creare modelli tridimensionali della vasculatura, che hanno permesso lo studio dell&#39;organogenesis e della patogenesi 1 , 2 . Le resine e le cere sono state colorate con coloranti come India Ink o rosso carminio per consentire la loro facile visualizzazione 1 , 2 . Tuttavia, queste tecniche hanno causato molti problemi perché le loro elevate viscosità impediscono la perfusione completa del tessuto di interesse 1 . Poiché il campo è diventato più sofisticato, l&#39;uso di microscopi confocali ed elettronici è entrato in gioco, spostando la tecnica di perfusione<html> Lontano dagli stampi e verso perfusioni liquide della vasculatura, alcune delle quali permettevano la perfusione e l&#39;imaging dei vasi sanguigni senza distruggere il tessuto iniziale 3 . DiI, un colorante fluorescente di carbocyanina, è una tale macchia che permette la perfusione di animali senza danneggiare il tessuto vascolare. I coloranti di carbocianina sono coloranti lipofili che incorporano nelle membrane cellulari al contatto. Questi coloranti permettono la colorazione facile e istantanea di cellule endoteliali vascolari, che possono essere visualizzate sotto un microscopio confocale fluorescente. DiI si muove attraverso la diffusione laterale nella membrana lipidica delle cellule, come mostrato nell&#39;etichettatura e nella traccia dei neuroni 4 . Chemically, le due catene alchiliche di Di conferiscono al colorante la sua elevata affinità per le membrane cellulari, mentre due anelli coniugati da un fluorochrome che è responsabile di emettere una lunghezza d&#39;onda rossa quando eccitato dai filtri di luce fluorescenti verdi&gt; 4. DiI è stato utilizzato in molte capacità, tra cui l&#39;etichettatura di successo della membrana plasmatica e l&#39;etichettatura anterograda e retrograda nei neuroni 5 , 6 . DiI è stato precedentemente utilizzato nei protocolli di perfusione mentre visualizza la vasculatura dei topi 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sono salamandri che vivono esclusivamente in laghetti salmastre vicino a Città del Messico, in Messico. Questi animali sono diventati un importante modello per comprendere processi rigenerativi in ​​quanto possono regenerare gli arti completi, la coda (compreso il cavo nervo), le parti del cuore e altri organi interni e le parti dell&#39;occhio come adulti 8 , 9 . Inoltre, con la recente applicazione di strumenti genetici in axolotls, è ora possibile conoscere senza precedenti le molecole e le cellule che guidano questi processi 8 . Il regene di successoLa razione di un arto intero richiede un ampio processo di rivascolarizzazione, che può svolgere un ruolo significativo nella rigenerazione oltre le semplici funzioni dei vasi sanguigni nel fornire ossigeno e sostanze nutritive. La comprensione della rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione dei tessuti è indispensabile. I vasi sanguigni Axolotl sono stati precedentemente visualizzati usando l&#39;India Ink e, mentre i risultati erano intriganti, questo processo non è stato rivisto nei decenni successivi 10 . Abbiamo cercato di adattare un protocollo di perfezionamento DiI sviluppato per essere utilizzato nei mammiferi per consentire una completa perfusione e visualizzazione della vasculatura axolotl 7 . Questo protocollo descrive le fasi adottate per perfezionare e successivamente visualizzare la circolazione dell&#39;assolotlina con una tecnica di colorazione DiI. Questa procedura consentirà una visualizzazione precisa dei vasi sanguigni di brevetto nei tessuti omeostatici, nonché nel rigenerare i tessuti e fornisce un nuovo metodo di visualizatioN e l&#39;analisi del processo di rivascolarizzazione nell&#39;assolotl.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Marshall Scientific&amp;nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion tubing</td><td>Excelon Lab &amp;amp; Vacuum Tubing</td><td>436901705</td><td>size S1A</td></tr><tr><td>27g butterfly needle</td><td>EXELint Medical Products</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-Dioctadecyl-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100% vol/vol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Surgical foreceps&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene foam frame</td><td></td><td></td><td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&amp;nbsp; cut out</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent underpad</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard disposable transfer pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Clamp stand</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricaine powder</td></tr><tr><td>Adult axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tanks</td><td></td><td></td><td>Varying size appropriate for the axolotl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Fluorescent Filter</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

Le tecniche di perfusione sono state utilizzate da secoli per visualizzare la circolazione dei tessuti. Axolotl (Ambystoma mexicanum) è una specie di salamandra che è emersa come un modello essenziale per gli studi di rigenerazione. Poco si sa circa come si verifica la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione in questi animali. Qui riportiamo un metodo semplice per la visualizzazione della vasculatura in axolotl attraverso la perfusione di 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocyanin perchlorato (DiI). DiI è un colorante lipocilico di carbocyanina che inserisce istantaneamente nella membrana plasmatica delle cellule endoteliali. La perfusione avviene usando una pompa peristaltica in modo che DiI entri nella circolazione attraverso l&#39;aorta. Durante la perfusione, il colorante scorre attraverso i vasi sanguigni dell&#39;assolotl e si incorpora nel bilayer lipidico delle cellule endoteliali vascolari al contatto. La procedura di perfusione dura circa un&#39;ora per un axolotl da otto pollici. Immediatamente dopo la perfusione wiTh DiI, l&#39;axolotl può essere visualizzata con un microscopio fluocentrico confocale. Il DiI emette luce nella gamma rossa-arancione quando viene eccitato con un filtro fluorescente verde. Questa procedura di perfusione DiI può essere usata per visualizzare la struttura vascolare degli assoloti o per dimostrare modelli di rivascolarizzazione nei tessuti rigeneranti.

<html> Con la colorazione DiI, la vasculatura dell&#39;assolotl può essere facilmente visualizzata. I vasi sanguigni di animali perfusi con il colorante lipofile sono immediatamente visibili sotto un microscopio confocale fluorescente. La Figura 1 .1-1.5 è una rappresentazione schematica del protocollo di perfusione. Dopo la perfusione con il colorante rosa brillante, un axolotl perfuso perfettamente apparirà rosa. Usando un filtro fluores...

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l&#39; Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura.

DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

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Research

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Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K Views.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l' Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura. 

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Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Ricerca

Genetica

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Biologia dello sviluppo

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The cerebral vasculature dynamically responds to various pathophysiological states and it exhibits considerable differences between strains and under conditions of genetic manipulations. Essentially, a reliable technique for intracranial vessel staining is essential in order to study the pathogenesis of ischemic stroke. Until recently, a set of different techniques has been employed to visualize the cerebral vasculature including injection of low viscosity resin, araldite F, gelatin mixed with various dyes1 (i.e. carmine red, India ink) or latex with2 or without3 carbon black. Perfusion of white latex compound through the ascending aorta has been first reported by Coyle and Jokelainen3. Maeda et al.2 have modified the protocol by adding carbon black ink to the latex compound for improved contrast visualization of the vessels after saline perfusion of the brain. However, inefficient perfusion and inadequate filling of the vessels are frequently experienced due to high viscosity of the latex compound4. Therefore, we have described a simple and cost-effective technique using a mixture of two commercially available carbon black inks (CB1 and CB2) to visualize the cerebral vasculature in a reproducible manner5. We have shown that perfusion with CB1+CB2 in mice results in staining of significantly smaller cerebral vessels at a higher density in comparison to latex perfusion5. Here, we describe our protocol to identify the anastomotic points between the anterior (ACA) and middle cerebral arteries (MCA) to study vessel variations in mice with different genetic backgrounds. Finally, we demonstrate the feasibility of our technique in a transient focal cerebral ischemia model in mice by combining CB1+CB2-mediated vessel staining with TTC staining in various degrees of ischemic injuries.

Analysis of rodent cerebrovascular anatomy plays an important role in experimental stroke research. In this context, intravascular perfusion with colored latex has been considered as a standard tool for several years. However, this technique implies distinct technical limitations, which undermine its reproducibility. Here, we describe a simple method to visualize cerebral vessels in a reproducible manner. Injection of a mixture of two commercially available carbon black inks through the left myocardial ventricle results in adequate filling of cerebral vessels with high contrast visualization. We have successfully applied this technique to identify anastomotic points between cerebral vascular territories of mice with different genetic backgrounds. We finally give evidence that this novel and simple method for vessel staining can be combined with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining - a widely used tool to observe and analyze infarct volumes in mice.

Perfusione intravascolare di inchiostro nero di carbonio permette la visualizzazione affidabile dei vasi cerebrali

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The ...

Neuroscienze

Preparazione di un modello di microtumore umano vascolarizzato basato sulla microfluidica

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Autore in primo piano: Creazione di microtumori vascolarizzati umani come modelli per la ricerca traslazionale sul cancro 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Ricerca sul cancro

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioingegneria

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model species such as zebrafish and salamanders that are capable of intrinsic heart regeneration hold promise for future regenerative therapies for human patients. To evaluate the outcome of cardioregenerative experiments it is imperative that heart function can be monitored. The axolotl salamander (A. mexicanum) represents a well-established model species in regenerative biology attaining sizes that allows for evaluation of cardiac function. The purpose of this protocol is to establish methods to reproducibly measure cardiac function in the axolotl using echocardiography. The application of different anesthetics (benzocaine, MS-222, and propofol) is demonstrated, and the acquisition of two-dimensional (2D) echocardiographic data in both anesthetized and unanesthetized axolotls is described. 2D echocardiography of the three-dimensional (3D) heart can suffer from imprecision and subjectivity of measurements, and to alleviate this phenomenon a solid method, namely intra/inter-operator/observer analysis, to measure and minimize this bias is demonstrated. Finally, a method to acquire 3D echocardiographic data of the beating axolotl heart at a very high spatiotemporal resolution and with pronounced blood-to-tissue contrast is described. Overall, this protocol should provide the necessary methods to evaluate cardiac function and model anatomy, and flow dynamics in the axolotl using ultrasound imaging with applications in both regenerative biology and general physiological experiments.

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl Ambystoma Mexicanum

Here we present echocardiography protocols for two-dimensional and three-dimensional image acquisition of the beating heart of the axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), a model species in heart regeneration. These methods allow for longitudinal evaluation of cardiac function at a high spatiotemporal resolution.

Ecocardiografia 2D e 3D nell'Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model ...

Medicina

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualizzazione e la quantificazione dello strato acellulare nelle arteriole del muscolo Cremaster Rat

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in

Riepilogo

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Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro

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