Quindi lo scopo del metodo nel nostro manoscritto è quello di fornire un'analisi comparativa delle vie di segnalazione nelle cellule mieloidi usando sistemi umani e topi. Aiuta a definire quale via di segnalazione è coinvolta a valle dei recettori di riconoscimento dei modelli selezionati. Quindi questo metodo è semplice da implementare.
Si basa su preparati cellulari primari e composti di riferimento convalidati, che è essenziale per la spiegazione dei meccanismi di segnalazione. A dimostrare la procedura saranno Ratiba Touil e Adeline Unterreiner, rispettivamente scienziata e ricercatrice associata nel nostro gruppo. In un cappuccio di flusso laminare impostare un paio sterile di forbici, un becher da un litro e un sacchetto di plastica.
Posizionare il mantello buffy precedentemente ottenuto nel becher e utilizzare le forbici per aprirlo con cura. Utilizzando una pipetta da 25 mm aggiungere 100 ml di PBS integrato con 2 millimolare di EDTA. Mescolare pipettando lentamente su e giù.
Quindi trasferire 25 ml del rivestimento di buffy diluito in sei tubi di centrifuga conica da 50 ml che sono stati precompilato ciascuno con 15 ml di gradiente di densità a base di polisaccaride. Centrifugare i tubi per 20 minuti a 800 g con accelerazione moderata senza rottura per consentire la separazione delle cellule in base alla loro densità. Dopo la centrifugazione saranno visibili tre strati, un pellet contenente globuli rossi e granulociti, uno strato superiore fatto di plasma e un anello bianco contenente cellule mononucleari del sangue periferico.
Utilizzare una pipetta da 10 ml per raccogliere gli anelli PBMC e trasferirli in un nuovo tubo da 50 ml. Ricaricare con PBS ed EDTA. Eseguire tre lavaggi successivi con tempo e velocità di centrifugazione decrescente, come indicato nel protocollo di testo.
Dopo il lavaggio finale, resospendare il pellet in 25 ml di tampone di lysis freddo ghiacciato per lizzare i globuli rossi da pressione osmotica. Incubare la soluzione a temperatura ambiente fino a quando non diventa chiara. Quindi aggiungere 25 ml di tampone di separazione per interrompere la reazione.
Centrifugare a 150 g per otto minuti per lavare la soluzione. Versare il supernatante e rimescolare il pellet con tampone di separazione. Dopo aver contato le cellule, diluirle in un mezzo di coltura fino a 12.500 cellule per pozzo.
Distribuire 30 ml di questa sospensione cellulare in ogni pondo di una piastra di pozzo 384. Aggiungere quindi 15 microlitri di soluzioni composte quattro volte concentrate ad ogni pozzo e preincubare la piastra a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per un'ora. Se lo si desidera, aggiungere LPS alla concentrazione finale di 1 ng per ml o Zymosan impoverito a una concentrazione finale di 100 mcg per ml.
Quindi incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno dopo prendi 10 microlitri del supernatante per misurare i livelli alfa TNF secreti. Per iniziare la diluizione seriale, diluire la soluzione stock MLT-827 con mezzo per raggiungere una concentrazione di 8 micromolari in una volta sola.
Eseguire una diluizione seriale 1:5 in sei passaggio utilizzando un supporto con DMSO dello 0,08%. Per prepararsi per test a dose singola, diluire le soluzioni MLT-827, AFN700 e composto 11 stock con mezzo per raggiungere una concentrazione di 4 micromolari in una volta sola. In primo luogo, aggiungere 2 ml di acqua sterile endotossina-free a 10 mg di Zymosan impoverito.
Vortice questa soluzione stock per omogeneizzarlo. Aliquota la soluzione e quindi memorizzare le aliquote a 20 gradi Celsius. In questo studio i PBPC umani e le cellule di milza del topo sono stimolati con Zymosan impoverito, un agonista di Dectin-1, o lipopolisaccaride, un agonista TL4.
Il rilascio alfa NTNF nel supernatante viene misurato dopo 20 ore. Sia nel saggio umano che in quello del topo il composto MLT-827 blocca selettivamente la produzione alfa di TNF guidata dalla via Dectin-1 ma non dalla via TLR4. Nei monociti stimolati con LPS, la produzione di TNF alpha è quasi completamente abrogata da AFN700 ma non è sensibile al Cpd11, che è coerente con la dipendenza del percorso TLR4 dall'attività NF-kappa B e la sua indipendenza dall'attività SIC.
Al contrario, la produzione alfa TNF guidata da Dectin-1 e MODC mostra sensibilità a MLT-827, AFN700 e Cpd11. Ciò fornisce ulteriori prove del coinvolgimento di una cascata di segnalazione CBM SIC nel percorso Dectin-1. Anche la produzione di IL-1 beta, IL-6 e IL-23 è sensibile ai tre inibitori, indicando meccanismi regolatori simili al TNF alpha.
Tuttavia, l'effetto limitato visto sulla produzione di IL-8 suggerisce che questa citochina ha un meccanismo regolatore distinto. L'aumento delle concentrazioni di trehalose-dibehenate superiori a 50 mcg per ml porta alla produzione di TNF alpha, IL-6 e IL-1 beta, che si basavano sull'attività della paracaspasi MALT1 secondo l'effetto di blocco dell'MLT-827. Risultati simili sono stati osservati quando si sfidano i CLC con concentrazioni crescenti di Zymosan impoverito per stimolare il dectin-1.
Questo metodo ha permesso di dimostrare che la paracaspasi MALT1 regola selettivamente la segnalazione del recettore simile alla lettarina di tipo C. È essenziale utilizzare composti di riferimento ben caratterizzati. Prestare attenzione alla procedura per la diluizione delle soluzioni stock.
Questo è fondamentale per il composto con solubilità limitata.
