Questo lavoro è stato sostenuto anche da finanziamenti della Knut e Alice Wallenberg fondazione. Il personale dei centri di intere proteina umana Atlas a Uppsala, Stoccolma e India sono riconosciuti per i loro sforzi per generare l&#39;Atlante proteina umana. Gli autori desiderano ringraziare in particolare Frank Hammar e Sofie Gustafsson per l&#39;assistenza con la foto e Elene Karlberg per l&#39;assistenza con la produzione TMA durante le riprese.

1. Come preparare i tessuti per la produzione Tissue Microarray (Animazione 1) <ol><li> Selezionare rilevante materiale paraffina fissato in formalina incorporato (campioni di tessuto o cellula), compresa la corrispondente sezione di tessuto tinto ematossilina. </li><li> Segna un&#39;area rilevante del sezione di tessuto. Si raccomanda di avere una sezione appena tagliata tinto ematossilina corrispondente al blocco di paraffina. </li><li> Progettare il modello utilizzato per la produzione di TMA. Randomize i campioni all&#39;interno del modello al fine di evitare artefatti causati da problemi tecnici come la copertura degli anticorpi sull&#39;intera sezione TMA e problemi di sezionamento. Aggiungere marcatori di orientamento aggiuntivi al modello per l&#39;orientamento. </li><li> Organizzare i tessuti in base al modello. </li></ol> 2. Manuale di produzione Tissue Microarray (essenziale per le riprese) <ol><li> Per poter ottenere una lunghezza standardizzata dei nuclei di tessuto, segnare il mandrino ad esempio 4,5 mm (Figura 2). Guidelines per la distanza tra i centri di esempio: nucleo dimensioni 0,6 mm - 0,8-1,0 mm nucleo formato da 1,0 mm - 1,8-2,0 mm nucleo formato 1.5 mm - 2,0-3,0 mm nucleo dimensioni 2,0 millimetri - 2,5-4,0 millimetri Si raccomanda di lasciare margini 2,5-3,0 mm su ciascun lato del blocco paraffina per evitare la rottura della paraffina. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montare le punzoni selezionati da utilizzare. Inizia allentando le viti a testa esagonale che tiene il pugno al suo posto. Il punzone è posizionato correttamente quando la scanalatura nel mozzo punzone viene saldamente appoggiato l&#39;asta di metallo in plastica v-blocco. Fissare le viti e fare in modo che il bordo della clip in metallo è orizzontale. </li><li> Il punzone destinatario (contrassegnati in verde e rosso, specifico per il distributore) deve essere posizionato a sinistra. Il punzone donatore (contrassegnati in verde e blu, specifico per il distributore), che ha un diametro leggermente maggiore, dovrebbe essere collocato a destra (figura 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Spostare i pugni lungo i x e y assi utilizzando le manopole di regolazione XY. La manopola di regolazione destra sposta i punzoni lungo l&#39;asse x e la manopola di regolazione sinistra sposta i punzoni lungo l&#39;asse y. Vi è una lettura micrometro digitale su entrambe le manopole di regolazione. Questi vengono attivati ​​quando si spostano le manopole. </li><li> Ripristinare → premere il tasto ZERO / ABS pulsante. Spostamento tra i pollici e mm → premere il tasto IN / mm pulsante. Lo spazio tra i fori devono essere mm 2,0 (misurata tra i centri dei fori) quando si utilizza un punzone 1 mm per un modello 9x8. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Per assicurarsi di non spingere il pugno troppo in basso nel blocco, colpendo la cassetta e distruggendo il punzone, mettere una cassetta senza paraffina nel supporto e impostare la posizione di fondo del recipiente punzone a 1 mm sopra il fondo della cassetta utilizzando la vite di arresto di profondità alnell&#39;angolo in alto a sinistra della Z-guida (Figura 3). </li><li> Mettere il blocco ricevente nel supporto e utilizzare il più piccolo cacciavite per serrare le viti. Non fissare le viti a stretto o la paraffina potrebbero staccarsi dalla cassetta. </li><li> Premere il punzone ricevente verso il basso di circa 5 mm nel blocco ricevente e utilizzare la maniglia in pugno per ruotare il pugno avanti e indietro una volta (Figura 3). Il buco sarà di 5 mm di profondità quando si spinge il punzone fino giù in blocco il più possibile. </li><li> Alleviare la pressione verso il basso spingendo lentamente, in modo che le molle può spostare il pugno alto. Utilizzare il mandrino per svuotare il punzone ed eliminare il nucleo di paraffina. </li></ol></li><li> Spostare il torretta per passare il punzone donatore (Figura 3). </li><li> Posizionare il ponte blocco donatore con il blocco donatore sopra il supporto del blocco ricevente (Figura 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Spingere la puntura donatoreh nella zona selezionata del blocco donatore. Utilizzare un corrispondente ematossilina ed eosina scivolo colorato in cui la regione di interesse è stato contrassegnato per individuare il tessuto che deve essere campionata. Manualmente tenere il blocco dei donatori in posizione con la mano sinistra e spingere il pugno con la mano destra. Si noti che non si dovrebbe spingere il mandrino. L&#39;arresto di profondità non blocca il movimento pugno nella posizione corretta per il blocco dei donatori, quindi è importante che si smette di spingere quando il secondo marchio è visibile sul mandrino. </li><li> Ruotare la maniglia sul punzone una volta (Figura 3). Rilasciare lentamente la pressione verso il basso tenendo premuto il blocco dei donatori sul ponte blocco donatore. </li><li> Il tessuto del donatore viene preferibilmente perforato 0,5 millimetri più corto del nucleo destinatario. Questo processo assicurare un allineamento regolabile dei nuclei sulla superficie blocco ricevente, evitando la perdita di tessuto valore rappresentativo. </li></ol></li><li> Rimuovere il ponte e il blocco donatore. FareAssicurarsi che il punzone donatore viene allineato con il foro che è stato fatto in precedenza (punto 4). È necessario regolare la posizione di perforazione utilizzando le viti, se il punzone donatore e il foro nel blocco destinatario non sono allineati. </li><li> Spingere con cautela il pugno verso il basso fino alla sua punta raggiunge la parte superiore del foro nel blocco destinatario. Mantenendo questa posizione, utilizzare il mandrino per svuotare il nucleo tessuto nel foro. La superficie di base deve essere in allineamento con la superficie del blocco. </li><li> Spostare la parte posteriore della torretta al punzone destinatario. </li><li> Passare alla posizione successiva, con le manopole di regolazione XY. </li><li> Ripetere dal 4c precedente punto fino a quando la matrice è completa. </li><li> Quando il blocco ricevente tutto è finito, allentare le viti del supporto blocco destinatario. Cuocere il blocco in 42 ° C per 40 minuti. Mettere il blocco con l&#39;area di sezionamento rivolta verso il basso su un vetrino. Posizionare il vetrino con il blocco sopra di un supporto provetta (o altra costruzione appropriati) e posto in tha forno. Dopo cottura, togliere il portaprovettoni dal forno e appiattire la superficie del blocco accarezzando delicatamente il vetrino. </li><li> Posizionare il blocco con il vetrino su una piastra di raffreddamento per 10 minuti. Per garantire tessuto rappresentante tutta la TMA un controllo di qualità su ogni sezione 50 ° viene eseguita. </li></ol> 3. Come TMAs Sezione (Animation 2) <ol><li> Tagliare 4 sezioni micron di spessore utilizzando un microtomo con sistema sezione di trasferimento (HM 355S, Microm). Il sistema può essere utilizzato con tutti microtomi correnti rotanti. Il sistema è costituito da un vettore lama con ponte integrato di trasferimento, un bagno di acqua riscaldata e una unità di controllo. Dalla lama le sezioni scivolare sulla superficie di trasferimento bagnata tramite un ponte di trasferimento in bagno d&#39;acqua. </li><li> Le sezioni devono essere prelevati da bagno d&#39;acqua subito dopo aver steso, per evitare la fusione dei punti sensibili del tessuto (es. tessuti lipidici ricchi come al seno e al cervello). Place la sezione su un vetrino SuperFrost. Il tempo le sezioni possono essere lasciate in acqua dipende dal tipo di paraffina e cera utilizzata la temperatura dell&#39;acqua. Il nostro laboratorio paraffina uso da HistoLab Products AB, che hanno un punto di fusione di 56-58 ° C e si consiglia una temperatura del bagno d&#39;acqua di 37-39 ° C. </li><li> Porre i vetrini in un portavetrini per l&#39;essiccazione a temperatura ambiente (RT) per tutta la notte. </li><li> I vetrini vengono cotti in 50 ° C per 12-24 ore. Utilizzando un microtomo senza STS si devono trasportare la sezione dalla lama di un bagno d&#39;acqua manualmente utilizzando ad esempio un pennello. </li></ol> 4. Test e procedura di titolazione per immunoistochimica (animazione 3) Ciascun anticorpo è stato sottoposto ad una procedura di prova standardizzata utilizzando appositamente progettati TMAs contenenti una miscela di tessuti e tipi di cellule differenti. L&#39;obiettivo è quello di valutare un protocollo immunostaining individuale e ottimizzata per ciascun anticorpo. Inizialmente una diluizione, sulla base formicamagazzino concentrazione ibody dell&#39;anticorpo primario viene testato. Il risultato di questa prova colorazione viene utilizzato per guidare ulteriori diluizioni e ottimizzazione del protocollo. <ol><li> Deparaffinizzazione e idratazione in etanolo xilene e graduale di acqua distillata vengono eseguite prima dell&#39;immunocolorazione. </li><li> Un passo di blocco per estinguere perossidasi endogena viene eseguita in 0,3% H 2 O 2 in etanolo al 95% per 5 minuti. </li><li> Indotto dal calore (Recupero di epitopi) viene eseguita in un tampone pH recupero 6, utilizzando una caldaia in pressione (camera Decloaking, Biocare Medical) come fonte di calore per 4 minuti a 125 ° C. Dopo aver completato ebollizione, vetrini rimangono nella caldaia pressione e vengono lasciate raffreddare a 90 ° C. Il tempo di elaborazione totale per HIER è di circa 45 minuti. </li><li> Se nessun risultato conclusivo è ottenuto nel test iniziale, ulteriori prove sono fatte in base al pattern di colorazione osservata 5 6. Uno studio pilota, nel HPA ad elevata capacità set-up, ha mostratoche il recupero antigene più utile dove HIER pH 6, ma altri metodi di recupero, come pre-incubazione con proteinasi, microonde e punto in tampone con pH maggiore o minore può naturalmente essere utilizzato. Modificando la condizione di IHC ad esempio cambiando i tempi di incubazione di anticorpi, le diluizioni degli anticorpi e diaminobenzidina (DAB) tempi di incubazione del pattern di colorazione può dare risultati più conclusivi. </li></ol> 5. Colorazione Program, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Tutte le incubazioni vengono eseguite a temperatura ambiente e questo protocollo può anche essere utilizzato in una configurazione manuale con gli stessi reagenti. <ol><li> Sciacquare in tampone di lavaggio. </li><li> Incubazione con Ultra V blocco per 5 minuti. </li><li> Sciacquare in tampone di lavaggio. </li><li> L&#39;incubazione con anticorpo primario per 30 minuti. </li><li> Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). </li><li> Incubazione con rafano-perossidasi polimero marcato per 30 minuti. </li><li> Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). </li><li> Sviluppare in soluzione DABper 10 minuti. </li><li> Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). </li><li> Controcolorazione in Mayers ematossilina * per 5 minuti. Quando si utilizza un metodo progressivo di colorazione (ad esempio Mayers ematossilina) l&#39;intensità dipende dal tempo e non è necessaria differenziazione. Un metodo di colorazione regressiva esempio ematossilina di Harris richiede differenziazione per rimuovere il colorante in eccesso dai tessuti al fine di accentuare una struttura. </li><li> Sciacquare con acqua di rubinetto *. </li><li> Sciacquare con acqua di litio carbonato, diluito 1:5 dalla soluzione satura per 1 minuto *. </li><li> Sciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti *. </li><li> Le diapositive sono disidratati in etanolo graded e le diapositive sono coprioggetto (PeRtex, Histolab) </li></ol> Tutti i reagenti sono applicati ad un volume di 300 pl per vetrino. * I passi 10-14 sono fatte in uno strumento histostaining (Autostainer XL, Leica) e coprivetrino è inoltre fatto in un sistema montavetrini (montavetrini Automated CV5030, Leica). 6. Come effettuare la scansioneuna diapositiva Il metodo di scansione di diapositive dipende dal scanner digitale viene utilizzato, questo protocollo definisce solo come eseguire la scansione di una diapositiva con il sistema di scansione automatica Aperio XT (Aperio Technologies). Nella proteina umana Atlas set-up 20x per il tessuto e 40x per le cellule vengono utilizzati. Scansione automatica potrebbe incontrare problemi di fuoco dovuti alla eterogeneità del tessuto e il numero di diversi tessuti inclusi in un TMA. <ol><li> Pulire il vetrino da polvere, colla e verificare la presenza di bolle d&#39;aria tra il vetrino e la sezione. In caso di rimontare bolle d&#39;aria della diapositiva. </li><li> Mettere il vetrino in un rack e posizionare il cestello nello scanner digitale. Il tempo per la scansione di un TMA a 20x è di circa 6 minuti. Un software di Aperio viene utilizzato per selezionare l&#39;area di interesse. Selezione del punto di messa a fuoco viene effettuata automaticamente all&#39;interno del software. Manualmente la selezione dell&#39;area di scansione e punti di messa a fuoco è inoltre possibile. </li><li> Dopo che l&#39;immagine hcome stato generato può essere utilizzato per la valutazione e la annotazione della colorazione immunoistochimica. Le immagini rimangono come un file risultato dell&#39;esperimento e può essere distribuito ai colleghi per le discussioni e ulteriormente utilizzati per la pubblicazione dei dati. Le immagini possono essere visualizzate in un software liberamente disponibile da Aperio. </li></ol> 7. Come per cercare il tuo Protein Favorite nell&#39;Atlante proteine ​​umane <ol><li> Sfoglia per <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Immettere il nome del vostro preferito proteine, Ensembl id, numero di accesso UniProt o insulina nome HGNC es. </li><li> Entrare nella pagina di riepilogo e scorrere verso il basso al tessuto normale e sintesi organo. La panoramica mostra l&#39;espressione della proteina nel pancreas. </li><li> Clicca su &quot;dati di tessuto più&quot;. Si entra nei tessuti normali visualizzare dove si possono vedere tutti i tessuti incluso ordinati per organo. </li><li> Clicca sul pancreas per visualizzare i risultati IHC per 3 anticorpi diretti verso la stessa proteina. Per visualizzare un high-risoluzione del pancreas click sull&#39;immagine. </li><li> Ulteriori informazioni espressione della proteina nel tessuto del cancro, le cellule e altri dati di convalida all&#39;interno del Atlas proteina umana può essere trovato navigando Human Protein sito Atlas. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Animazione 1. Come preparare i tessuti per la produzione di tissue microarray. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere Animazione 1</a> . Animation 2. Come TMAs sezione. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere Animation 2</a> . Animazione 3. La tecnica immunoistochimica è descritta. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere Animation 3</a> .<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figura 1. Schema generale del processo all&#39;interno della proteina umana Atlas Uppsala. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Figura 2. Stiletto donatori segnato per la lunghezza standardizzata di nuclei di tessuto, ad esempio 4,5 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figura 3. Micro-distributore tessuto manuale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di diversa qualità di TMA prodotte. (A) A diritta e correttamente allineata con TMA spazio sufficiente tra le righe e colonne, nonché al bordo della paraffina. (B) Un TMA con alcuni dei nuclei troppo vicino al bordo conseguente difficoltà probabili Durante il taglio. (C) Un TMA che sono stati cotti per too lunga con un conseguente crollo TMA senza il modello corretto. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figura 5. Ematossilina e eosina TMAs macchiati. (A) una sezione opportunamente tagliato con colonne diritte e allineate e righe. Utilizzando una lama brutto o sporco potrebbe dar luogo alla suddivisione (B) o sezioni compressi (C). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figura 6. Titolazione di anticorpi. (A) Reazione cellule del centro in linfonodo mostra un anticorpo ottimale titolato con un conseguente colorazione citoplasmatica specifica (mostrata in marrone) senza fondo. (B) La sezione di tessuto presenta una debole colorazione. Colorazione negativa o debole si trova quando la concentrazione di anticorpo primario è troppo basso o se la proteina bersaglio non è presente nei tessuti immunocolorate. (C) La sezione di tessuto è overstained dovuto all&#39;uso di concentrazione troppo elevata di anticorpo primario. Il drisultati cromatici arca in difficoltà che determinano la localizzazione subcellulare per traboccare, attraversare reattività e falsa positività.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

L&#39;immunoistochimica è di gran lunga l&#39;applicazione più comunemente utilizzato per TMA. La combinazione di IHC TMA e può essere utilizzato in diverse impostazioni, ad esempio alto throughput screening dei pattern proteici di espressione in tessuti 7 8 9 10 e cellule, studi biomarker basato su campioni di tessuto di grandi gruppi di pazienti 11 12 e più biologia tumorale base studi, tra cui diversi fenotipi / genotipi, stadi di differenziazione, la progressione e metastasi 13. Uno dei vantaggi di TMA è che il materiale da coorti di grandi dimensioni possono essere analizzati in una sola volta, entrambi gli esperimenti di risparmio prezioso materiale biologico e garantire più riproducibili. Inoltre, l&#39;uso di TMA tecnologia consente di risparmiare sui costi dei reagenti e dei tempi di elaborazione di laboratorio. Come TMA contiene solo una limitata quantità di tessuto, tessuto eterogeneità è un problema. A seconda del tipo di tessuto e domande da affrontare, diversi campioni possono essere necessarie dalla stessa specimen. Per i tessuti tumorali, l&#39;utilizzo di due a quattro nuclei da ciascun campione è raccomandato come è stato dimostrato di produrre un elevato grado di precisione nella rappresentazione di intere sezioni di tessuto 13 14. A seconda della composizione del tessuto diametro dei punzoni (da 0,6 mm a 2 mm) può essere regolata. I tessuti sono complessi e composto da due diversi tipi di cellule diverse, strutture e matrice extracellulare. La composizione di ogni tipo di tessuto diverso contenente una quantità variabile di grasso, vasi sanguigni, tessuto connettivo, cartilagine ecc influenzerà la pressione necessaria per la punzonatura e la raccolta core distinti. E &#39;quindi importante mettere in pratica tutte le fasi della procedura su materiale che non è di alcun valore, prima di produrre un TMA con i tessuti definiti per gli esperimenti previsti. Quando sezionamento una varietà di differenti tessuti entro un blocco TMA la composizione del blocco potrebbe influenzare la capacità di acquisire sezioni di alta qualità. Certain tessuti, ad esempio pelle, midollo osseo, grasso, cervello e del seno, render sezionamento del blocco TMA difficile per effetto delle differenze nella struttura effettuano come sezioni estendono nel bagno d&#39;acqua e come durezza differente è tagliato dalla lama ecc Si raccomanda pertanto ai tessuti di gruppo con caratteristiche simili, ad esempio il tessuto ricco di lipidi in una TMA, quando applicabile. La maggior parte dei tessuti tumorali sono in questo senso omogenea, che facilita il sezionamento di TMA cancro. Un metodo alternativo sezionamento per stabilizzare i nuclei microarray può essere impiegato nel maneggiare una TMA eterogenei con tipi di tessuti. L&#39;uso di un nastro adesivo può essere utile per evitare la perdita delle anime e ricaduta nella sezionata TMA. L&#39;uso di nastro adesivo dovrebbe essere impiegato con cautela, dato che il nastro può influenzare lo spessore dei nuclei sezionati e successivamente anche il risultato della colorazione IHC 15. Nella proteina umana Atlas set-up un modello di TMA di 9x8 (escluso marcatori) ar coree usato. È di fondamentale importanza per ottenere il massimo numero di sezioni e mantenere tutti i tessuti rappresentati in tutto il blocco. Per risparmiare reagenti e tempo di scansione, 2 sezioni sono posti su un vetrino consentendo un modello massimo di 9x8. Il repository principale per le informazioni di proteine, Universal Resource Protein 16 comprende circa 20,300 voci recensione proteina umana, di cui solo circa il 66% hanno le prove a livello della proteina. Anche per la maggior parte dei geni per le quali vi sono prove di esistenza a livello proteico, vi è scarsa o nessuna informazione sulla funzione della proteina e la distribuzione di espressione. Una sfida importante per il futuro è quello di analizzare il modello di distribuzione e l&#39;abbondanza relativa di queste proteine ​​sconosciute in vari tipi di tessuto umano. Le informazioni da banche dati come UniProt, ENSEMBL, i dati pubblicati da PubMed può essere utilizzato come guida per stabilire se i modelli di colorazione immunoistochimica utilizzando anticorpireparti proteine ​​sconosciute rappresentano profili proteici effettivi della proteina bersaglio designato. Inoltre, diverse strategie di validazione altri sono necessari per garantire la funzionalità degli anticorpi, per la funzionalità degli anticorpi ad esempio in un array di proteine, Western blot, immunofluorescenza, immunoprecipitazione e pull-down esperimenti. Forse lo strumento più importante per la convalida di funzionalità anticorpo è quello di utilizzare anticorpi associati, cioè due differenti anticorpi sollevati contro separati, non sovrapponibili epitopi sulla proteina bersaglio stesso, per confrontare dosaggio specifico risultato 17. Sulla base delle informazioni raccolte, gli anticorpi sono testati e titolati secondo le norme IHC e l&#39;esperienza da testare e convalidare oltre 35.000 anticorpi nel progetto proteina umana Atlas. Per oltre 20% di tutti i geni con profili proteine, anticorpi dati appaiati (2 o più anticorpi diretti contro epitopi non sovrapposte sulla stessa proteina) è stata usata per determinare uno migliore stimacompagno del corrispondente modello di espressione della proteina. Anticorpi associati di fornire una strategia definitiva per la convalida specifiche tecniche immunoistochimiche basate su pattern di espressione delle proteine. Questa strategia è importante perché la moltitudine di differenti tessuti inclusi nel screening di base aumenta il rischio per la cross-reattività. Va inoltre notato che alcuni tessuti sono in generale più inclini a mostrare colorazione di fondo macrofagi esempio, muscolo liscio, tubuli distali nel rene e nel fegato epatociti. Ulteriori problemi da considerare includono variazioni nelle tecniche di lavorazione dei tessuti nel tempo per i tessuti prelevati da materiale d&#39;archivio, che possono causare falsi negativi o inappropriati positivi modelli di marcatura IHC. Questo fenomeno si riscontra anche in analisi ampia sezione. Sia i controlli negativi e positivi sono di vitale importanza e devono essere utilizzati quando possibile. Per studi più approfonditi comprese le analisi funzionali, linee di cellule con espressione forzata e specifica knock-down di tr corrispondentianscripts (tecnologia siRNA) può essere utilizzato per creare i controlli. Per ottenere risultati ottimali in IHC, è importante testare e utilizzare sistemi di recupero di antigene, poiché la fissazione in formalina induce modificazioni chimiche diverse, ad esempio reticolazione, idrolisi di basi di Schiff mascheramento l&#39;antigene 18. In conclusione, basate su anticorpi proteomica impiegano la tecnologia TMA e IHC è una potente strategia per generare dati di espressione di proteine ​​su larga scala. Il progetto Human Protein Atlas è stato istituito per creare una mappa di espressione della proteina umana in tessuti umani normali e tumorali. Lo scopo di questo progetto è quello di presentare una prima bozza di un Atlante completo proteina umana entro il 2015. Oltre a fornire profili proteici di organi e tessuti normali, questo sforzo fornisce anche un punto di partenza per progetti di ricerca biomedica, compresi gli sforzi clinici scoperta di biomarcatori. L&#39;obiettivo finale è quello di aggiungere uno strato successivo informazioni sulla sommità della sequenza del genoma umano che will essere cruciale per una più profonda comprensione della biologia sottostante vari stati di malattia, e fornire una base per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici e terapeutici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tampone di lavaggio </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Tampone citrato pH 6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Anticorpo diluente </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP polimero HRP </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB più substrato del sistema </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Block </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Anticorpo primario Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers ematossilina </td><td> Histolab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PeRtex </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Manuale del tessuto micro Arrayer </td><td> Estigen, Beecher Instrument </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Waterfall microtomo </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Immagine scanner automatico </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Sistema di colorazione automatizzato slitta </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Sistema di colorazione automatico scivolo per deparafinization e disidratazione </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Vetro montavetrini automatizzato </td><td> Leica BiosISTEMI </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking camera </td><td> Biocare Medical </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

Il tessuto microarray (TMA) fornisce i mezzi per analisi ad alta produttività dei diversi tessuti e cellule. La tecnica viene utilizzata nell&#39;ambito del progetto proteina umana Atlas per l&#39;analisi globale dei modelli di espressione della proteina in tessuti umani normali, il cancro e linee cellulari. Qui vi presentiamo il montaggio di 1 core mm, recuperate dai tessuti al microscopio rappresentativi selezionati, in un unico blocco destinatario TMA. Il numero e la dimensione dei nuclei in un blocco TMA può variare da circa 40 mm a 2 conduttori centinaia di 0,6 mm core. Il vantaggio di utilizzare TMA tecnologia è quella grande quantità di dati può rapidamente essere ottenuti utilizzando un unico protocollo immunocolorazione per evitare variabilità sperimentale. È importante sottolineare che, solo quantità limitata di tessuto scarsa è necessario, che permette l&#39;analisi di grandi gruppi di pazienti 1 2. Circa 250 sezioni consecutive (4 um di spessore) può essere tagliato da un blocco di TMA e utilizzati per immunoistochimico staining per determinare specifici pattern di espressione di proteine ​​per 250 differenti anticorpi. Nel progetto proteina umana Atlas, anticorpi sono generati verso tutte le proteine ​​umane e utilizzato per acquisire profili proteici corrispondenti in entrambi i tessuti umani normali da 144 individui e tessuti tumorali di 216 pazienti diversi, rappresentano le 20 più comuni forme di cancro umano. Immunoistochimiche sezioni colorate TMA su vetrini vengono analizzati per creare immagini ad alta risoluzione da cui patologi in grado di interpretare e commentare il risultato di immunoistochimica. Le immagini, insieme con i corrispondenti patologia basati su dati di annotazione sono resi disponibili al pubblico per la comunità di ricerca attraverso la proteina umana Atlas portale ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Figura 1) 3 4. La proteina umana Atlas fornisce una mappa che mostra la distribuzione e l&#39;abbondanza relativa di proteine ​​nel corpo umano. La versione attualesione contiene oltre 11 milioni di immagini con i dati per l&#39;espressione della proteina 12.238 proteine ​​uniche, corrispondenti a oltre il 61% di tutte le proteine ​​codificate dal genoma umano.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Microarray di tessuto permette un metodo efficace per ottenere informazioni contemporaneamente da una moltitudine di tessuti. Parti rappresentativi di tessuti sono assemblate in un singolo blocco di paraffina. Sezioni dal blocco sono utilizzati per immunoistochimica e analisi di schemi di espressione della proteina. Scansione digitale genera immagini corrispondenti per la distribuzione dei dati.

Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All&#39;interno della Atlas proteina umana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

55.7K Views.  Uppsala University. Microarray di tessuto permette un metodo efficace per ottenere informazioni contemporaneamente da una moltitudine di tessuti. Parti rappresentativi di tessuti sono assemblate in un singolo blocco di paraffina. Sezioni dal blocco sono utilizzati per immunoistochimica e analisi di schemi di espressione della proteina. Scansione digitale genera immagini corrispondenti per la distribuzione dei dati.

Video: Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Ricerca

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Coltura tissutale della corteccia ovarica bovina

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Analisi unicellulare dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae all'interno del tessuto vegetale

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...