1. Le cellule colorazione con il kit Viability Tali - Reattivo cella Red Dead <ol><li> Iniziare questa procedura con le cellule U2OS (American Type Culture Collection), che sono state trasdotte con CellLight Nucleo-GFP * BacMam 2,0 *. (Nota: Le celle possono anche essere centrifugati e risospesi in media o PBS). </li><li> Per colorare le cellule morte con PI, il trasferimento di 100 l di cellule in una provetta da microcentrifuga nuovo. Si noti che una concentrazione di 1 x 10 5 a 1 x 10 7 cellule / ml è consigliato per questa analisi, anche se la concentrazione non deve essere esatti. </li><li> Successivamente, a macchiare le cellule morte, aggiungere 1 ml di PI-based reagente cella Tali Red Dead. Mescolare brevemente nel vortex per miscelare. Incubare Morti Tali reagenti Red Cell e la miscela di cellule a temperatura ambiente al buio per 1-5 minuti. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, immediatamente procedere all&#39;analisi del campione sul Image-Based Citometro Tali. </li></ol> 2. Esecuzione di un test di vitalità cellulare Utilizzando unTali Image-Based Citometro <ol><li> Il citometro Tali utilizza la plastica monouso Tali diapositive analisi cellulare che specificamente inseriscono nel citometro e può contenere due campioni separati 25μL in camere chiuse (A e B). Quando si maneggia il vetrino, assicurarsi di tenere sempre ai lati. </li><li> Per caricare la slitta, pipetta 25 ml di campione lentamente nella forma di mezzaluna area campione di carico, avendo cura di evitare la formazione di bolle o indietro splatter. Non sopra o sotto riempimento. </li><li> Qui, le cellule di controllo (senza macchia, non trasdotte) vengono caricati in camera di A e il colorato GFP che esprimono le cellule vengono caricati in camera di B. Il campione di controllo contribuirà a determinare il livello di autofluorescenza quando si analizzano i dati. </li><li> Per eseguire un test di vitalità, toccare GFP / RFP sulla schermata iniziale del citometro. Le opzioni di dosaggio apparirà sulla destra. Seleziona GFP + vitalità. </li><li> Successivamente, a nome della serie di campioni, premere Nome Adesso </strong&gt;. Quindi, utilizzando il touch screen, digitare il nome della serie di campioni, e premere Salva. (Nota: Seleziona Nome tardi per assegnare automaticamente un nome per ogni serie di campioni per data e ora). </li><li> Dopo aver nominato il campione, il citometro Tali passa automaticamente alla schermata di misura. Premere la linguetta Sfondo nella metà inferiore destra dello schermo Misura. </li><li> Successivamente, con il campione di controllo (A) rivolto verso il citometro, inserire la diapositiva nel porto di carico fino all&#39;arresto. Non forzare. </li><li> Nella schermata di sfondo, toccare Premere per inserire nuove cellule di controllo non colorati. La slitta automaticamente tirato in citometro e una immagine dal vivo delle cellule verrà visualizzato sullo schermo. </li><li> Utilizzando la manopola di messa a fuoco, portare le cellule nel piano adeguato di vista. Le cellule devono essere uniformemente scuro con un alone luminoso attorno a ciascuna cella (Figura 1, a sinistra). </li><li> Cellulas può essere sottostimata quando la transizione tra lo sfondo ei bordi delle celle è sfocata, in modo che i bordi delle celle non sono ben definiti (Figura 1, Center). Le cellule possono essere overcounted quando hanno centri luminosi e perimetri scuro (figura 1, a destra). </li><li> Per meglio visualizzare la popolazione cellulare mentre ci si concentra, far scorrere il pulsante rosso indicatore Zoom per 4X o 16X. </li><li> Una volta che le cellule sono state portate a fuoco, toccare Premere per eseguire il controllo non colorati cellulare per misurare la fluorescenza di fondo. </li><li> Il citometro automaticamente acquisire e analizzare le immagini del campione. Ci vuole circa 1 minuto per catturare e analizzare le immagini di default (9 foto) modalità. </li><li> Le miniature di ogni campo di vista vengono visualizzati come vengono catturati e la barra di avanzamento fornisce un aggiornamento in corso. Dopo la cattura delle immagini è completo, il citometro espelle automaticamente la diapositiva e fornisce i dati dall&#39;analisi delle immagini catturate. </li><li>I dati memorizzati saranno visualizzati nel menu a discesa della scheda Sfondo sul citometro. Il campione di controllo di fondo verrà assegnato lo stesso nome dato alla sperimentazione e saranno importati nel menu a discesa. Nota: Se un controllo di fondo non viene eseguito, il citometro assegna automaticamente una soglia di fluorescenza. Questa può essere cambiata manualmente dopo aver eseguito il test. </li><li> Per eseguire il PI-macchiato campione trasdotte, rimuovere il vetrino dal citometro, lancia intorno e reinserirlo con il campione trasdotte rivolto verso lo strumento. </li><li> Premere la linguetta di esempio e quindi toccare Premere per inserire nuovo campione. Quando l&#39;immagine viene visualizzata sullo schermo, utilizzare la manopola di regolazione delle immagini per portare le cellule a fuoco come prima. Poi tocco Premere per esempio di esecuzione. </li><li> Dopo la cattura delle immagini è completa, i dati della analisi appare nella scheda del campione e l&#39;automatico citometroalleato espelle la diapositiva. </li><li> Opportunamente smaltire l&#39;analisi scorrere Tali cellulare come rifiuti a rischio biologico. Tali diapositive Analisi cellulare non può essere riutilizzato. </li></ol> 3. Soglie di impostazione e Gates <ol><li> Una volta che il campione è stato eseguito, le soglie possono ora essere applicati al campione di casa su una popolazione di cellule specifiche. Qui, regolerà le soglie per determinare la percentuale di cellule vive e morte in GFP-trasdotte. </li><li> Nella scheda del campione, il numero e la percentuale di cellule che esprimono GFP, le cellule vive e morte che esprimono GFP, vitalità totale, la dimensione media delle cellule, il numero di cellule contate, e la concentrazione delle cellule vengono visualizzati. </li><li> Inoltre, la visualizzazione istogramma le dimensioni delle cellule, fluorescenza verde e rosso fluorescenza (PI) vengono visualizzati nella parte inferiore dello schermo. </li><li> Per impostare la porta di dimensioni delle celle, toccare la miniatura Dimensione cella per aprire l&#39;istogramma dimensione della cella. Mentre le cellule in coltura hanno raramente debris, altri campioni possono contenere residui che è più grande o più piccolo rispetto alle cellule. </li><li> Per escludere questo detriti, far scorrere i pulsanti blu sulla barra di scorrimento per escludere gli eventi piccoli e grandi. Poi, selezionare Applica a ri-analizzare i dati e aggiornare i risultati. </li><li> Poi, per aggiungere la fluorescenza GFP per l&#39;analisi, toccare la miniatura istogramma GFP per aprirlo. Far scorrere la barra blu di fissare la soglia appena a destra del picco più debole, utilizzando il campione di controllo come guida. </li><li> Questo permette di includere l&#39;analisi delle cellule GFP positive, ma escludere le cellule autofluorescenti. Autofluorescenza è frequente quando le molecole biologiche all&#39;interno delle cellule sono eccitati. </li><li> Selezionare Applica per confermare e tornare alla schermata precedente. I dati visualizzati nella scheda del campione dovrebbe rispecchiare le porte e le soglie indicate per entrambi i canali di fluorescenza. </li><li> Successivamente, per separare le cellule PI macchiato da autofluorescenza, premere tsi miniature istogramma PI per aprire l&#39;istogramma PI. </li><li> Anche in questo caso, il picco campione di controllo viene visualizzato come un picco grigio sul istogramma. Il picco rosso è la fluorescenza del campione. La fluorescenza di fondo viene visualizzato come un picco più vicino al valore 0 RFU su questo citometro. </li><li> Per eliminare la fluorescenza di fondo nel canale PI, spostare il pulsante blu sulla barra di scorrimento per regolare la soglia di escludere il picco corrispondente fluorescenza di fondo, con il picco di grigio dal campione di controllo come riferimento. Selezionare Applica per confermare e tornare alla schermata precedente. </li><li> Poi, per confermare visivamente che ogni cellula sia correttamente assegnato, selezionare un campo di vista catturato per la revisione premendo la miniatura dell&#39;immagine nella scheda Zoom, quindi premendo la scheda Livelli. </li><li> Successiva, premere il pulsante GFP o PI, per visualizzare l&#39;immagine catturata attraverso quel particolare canale. Premere lo stesso tasto di nuovo per rimuovere lo strato dallo schermo, oppure, a sovrapporre strati, toccare il pulsante più livelli. </li><li> Per identificare come le cellule sono contate attraverso un canale particolare, Cerchi tatto. Le cellule che sono stati contati solo attraverso il campo chiaro canale, che non esprimono fluorescenza sarà cerchiato in blu. Ciò indica che quella cella particolare sono in diretta (cioè PI negativo). </li><li> GFP cellule che esprimono si vedrà nel canale GFP, e sarà cerchiata in verde. Le cellule morte colorate con Red Cell Morto si vedrà nel canale PI, e sarà cerchiata in rosso. </li><li> Cellule contate sia nel canale rosso e verde saranno cerchiato in giallo, significa che la cellula esprime GFP, ma è anche macchiata di PI ed è quindi morto. </li><li> Occasionalmente, cerchi neri apparirà sullo schermo, questi sono oggetti che sono stati identificati, ma sono stati esclusi dall&#39;analisi in base alle dimensioni delle celle. </li><li> Continuare a fine regolare la soglia sull&#39;istogramma fluorescenza utilizzando la procedura appena descritta finché ogni cellula che sta esprimendo la fluorescenza è cerchiato con il colore appropriato. </li><li> Tutti i parametri di analisi vengono automaticamente salvate nella scheda di dati. Il citometro Tali grado di memorizzare file di dati da circa 500 corre campione. </li><li> Ogni file memorizzato nella scheda sono disponibili dati per rianalisi. Selezionando il file dalla scheda Dati sarà aperto e tutti gli istogrammi e livelli diventano attivi. </li><li> Per archiviare i dati e generare report, i dati memorizzati nel citometro possono essere trasferiti ad un computer tramite un drive USB. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: La Image-Based Tali Citometro è stato utilizzato per misurare il livello di espressione della proteina fluorescente in cellule che sono state trasdotte con un nucleare mirata espressione GFP BacMam costruire 2.0. Quattro tipi di cellule rappresentative trasdotte (U2OS, 293MSR, HEKn e CHO-S).Per queste linee cellulari, il numero di cellule che si esprimono GFP è stato riportato dal citometro Tali e confrontati con i dati stessi campioni analizzati su un citometro a flusso. Inoltre, le cellule sono state colorate con il reagente di Red Dead cella utilizzando il kit Viability Tali per identificare la popolazione cellulare sia morto sul citometro Tali e su un citofluorimetro. Le rappresentazioni grafiche in Figura 2 mostrano la percentuale della popolazione totale per ogni tipo di cellula che stavano esprimendo GFP. Questi dati dimostrano che il citometro produce Tali dati comparabili ai dati generati da un citofluorimetro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> Figura 1. Le cellule devono essere correttamente a fuoco prima dell&#39;analisi. Diapositive Analisi Tali Cellulare con concentrazioni di cella appropriata per l&#39;analisi (1 x 10 5 a 1 x 10 7 cellule sono consigliati). (SINISTRA) a fuoco le cellule sono uniformemente darca in tutta la cellula, con un alone luminoso attorno ad ogni cellula Cellule. (CENTRO) può essere sottostimata quando la transizione tra lo sfondo ei bordi delle celle sono sfocate e le cellule hanno confini indefiniti (DESTRA) Cellule forse overcounted quando hanno luminoso centri e perimetri buio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> Figura 2. Espressione della proteina fluorescente dati dal citometro Tali Image-Based è paragonabile a quella ottenuta con citometria a flusso. Un side-by-side di confronto calcolato GFP-espressione risultati in 4 diverse linee cellulari di cellule vitali.

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Krissy Remple e Laurel pietra sono dipendenti di Life Technologies che ha prodotto lo strumento utilizzato in questo articolo. Life Technologies ha sponsorizzato la produzione di questo video-articolo.

Abbiamo appena una procedura dettagliata per eseguire conteggi vitalità e valutare l&#39;espressione della GFP con il Image-Based Tali Citometro. Utilizzando la stessa procedura, questa citometro è in grado di eseguire una serie di altri test, tra cui: l&#39;apoptosi viabilità, RFP e cella di analisi utilizzando non cellule trasdotte. Analisi fluorimetrica di vitalità cellulare, apoptosi e l&#39;espressione genica sono diventate metodologie chiave nella ricerca biomedica 7-12. In passato, la strumentazione a parte è stato utilizzato per ottenere informazioni quantitative e visivi sulle cellule. Mentre le informazioni quantitative sulle cellule all&#39;interno di una popolazione eterogenea è stato ottenuto tramite l&#39;uso di citometria a flusso, le informazioni visive o qualitative sono state raccolte attraverso l&#39;utilizzo della microscopia a fluorescenza 1-4. Qui vi presentiamo una tecnologia che colma il divario tra popolazione e studi sulle cellule individuali. Utilizzando la Image-Based Tali Citometro, quantitativo data dati di celle e visive di singole cellule o popolazioni di cellule possono essere raccolte contemporaneamente. Tali Lo strumento può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni compresa la valutazione dell&#39;espressione genica, test di apoptosi, gli studi di efficacia dei farmaci e la valutazione della progressione della malattia. La Image-Based Tali cattura e analisi Citometro campo chiaro, fluorescenza rossa e verde immagini di fluorescenza, permettendo informazioni su sottopopolazioni di cellule da ottenere. Per esempio, in questo saggio, siamo stati in grado di distinguere le cellule morte da cellule vive all&#39;interno della GFP che esprimono popolazione di cellule utilizzando Morto colorante Red Cell. Questo dà la precisione nella misurazione di cellule vitali che esprimono GFP, e identifica la popolazione di cellule utilizzabili per la lavorazione a valle. E &#39;importante notare che le cellule morte nella popolazione potrebbe derivare da varie fonti, tra cui la morte delle cellule normali in coltura o morte cellulare causato da condizioni ambientali (ad esempio, tripsinizzazione o death indotta dalla trasfezione / trasduzione metodo scelto). Qui mostriamo l&#39;uso del citometro Tali U2OS con le cellule. Metodi simili possono essere eseguite utilizzando maggior parte delle cellule di mammiferi e insetti. Per ogni linea cellulare, il citometro Tali prodotti quantitativa dei dati di espressione GFP, che non è possibile con un controllo visivo delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza di serie. Anche se questi risultati sono paragonabili a citometria a flusso, sono raccolti in una frazione del tempo. Il citometro è in grado di contare con precisione le cellule da 5 micron a 60 micron di diametro, idealmente a una concentrazione di 1 x 10 5 a 1 x 10 7 cellule / ml. E &#39;importante sottolineare che la maggior parte dei protocolli di colorazione standard, tra cui il Morto il protocollo di colorazione Red Cell qui descritte, utilizzare lo ioduro di propidio per distinguere le cellule vive e morte. Questo rappresenta una sfida per valutare la vitalità delle cellule che sono state permeabilizzate per staining dei markers intracellulari, dal momento che PI si macchia una cella con una membrana compromesso. Dal momento che qualsiasi colorante fluorescente o proteine ​​che possono essere rilevati con i canali verde o rosso fluorescenza possono essere analizzati sulla Image-Based Citometro Tali, gli studi futuri possono esplorare l&#39;uso di coloranti alternativi, come amine coloranti vitalità reattiva 4. Uno studio del 2006 da parte Perfetto et al. 12 trovati questi coloranti per essere facile da usare e riproducibili nel discriminare popolazioni cellulari vivi e morti. Si noti che la Tali ha delle limitazioni rispetto alle tipologie di test si può eseguire. Per esempio, poiché l&#39;obiettivo utilizzato dallo strumento è 4X, le operazioni di conteggio sono limitati a tipi di cellule più grandi: le strutture sub-cellulari come i mitocondri o vescicole, e le cellule batteriche non può essere quantificato. Si noti inoltre che i canali di rilevamento in Tali sono limitati a fluorofori che si eccitano ed emettono all&#39;interno dei canali. Mentre YFP e luminoso mCherry segnali cuno da rilevare, dimmer segnali mCherry non può. Infine, l&#39;analisi Tali solo le cellule in sospensione. Non sarà accuratamente contare le cellule che aderiscono a una diapositiva. Inoltre, mentre c&#39;è solo capacità limitata per il conteggio delle cellule che sono di forma irregolare, tra cui alcuni lieviti e cellule primarie. Inoltre, studi futuri è probabile che trattano l&#39;uso di questo sistema per valutare l&#39;espressione di marcatori intracellulare. Coloranti individuali possono essere controllati per sovrapposizione spettrale con canali adiacenti, utilizzando uno strumento online SpectraViewer Invitrogen ( <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). Data la novità di questa tecnologia, la gamma completa di applicazioni è ancora da scoprire. In sintesi, l&#39;immagine-Based Tali Citometro dimostrato qui presenta una nuova tecnologia che consente la visualizzazione simultanea e l&#39;analisi delle popolazioni di cellule, consentendo la valutazione delle singole cellule e cell popolazioni in un formato compatto, con un flusso di lavoro semplice.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tali Image-Based Citometro </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> Tali diapositive analisi cellulare, 50 diapositive </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> Tali diapositive analisi cellulare, 500 diapositive </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> Tali kit di Fattibilità - Red Cell Morto </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> Tali kit di Fattibilità - Verde cellule morte </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> Tali Apoptosis Kit </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> U2OS cellule </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer

Unicellulari e informazione della popolazione sono comunemente ottenute mediante citometria di flusso o microscopia a fluorescenza. Tuttavia, questi due metodi forniscono informazioni diverse. Citometria a flusso dà quantitativa multi-parametrico informazioni sulle caratteristiche fisiche e colorazione o espressione, ma non permette per la visualizzazione. Stand-alone microscopia a fluorescenza fornisce dati visivi, ma non consente semplici misurazioni quantitative 1. Image-based citometria colma il divario tra questi due metodi, che permette la visualizzazione rapida e simultanea analisi quantitativa di migliaia di cellule in popolazioni eterogenee 2. Qui vi presentiamo un metodo per eseguire la vitalità cellulare e la Green Fluorescent Protein (GFP) saggi di espressione utilizzando la Tali Image-Based Citometro 3. Tali Lo strumento è un 3-canale (campo chiaro, verde fluorescenza, fluorescenza rossa), piattaforma di analisi da banco che offers numerosi vantaggi oltre citometria a flusso e microscopia a fluorescenza. Il citometro Tali è meno costoso, occupa spazio sul banco di meno, richiede meno manutenzione, e il flusso di lavoro è stata semplificata in modo che l&#39;operazione e l&#39;analisi è molto più semplice e veloce. Il citometro Tali è in grado di eseguire una vasta gamma di sospensione saggi cellulari, tra cui GFP e rosso proteina fluorescente (RFP) espressione, l&#39;apoptosi 4-6 e vitalità analisi cellulare con ioduro di propidio (PI) 7-11. Qui, dimostrano l&#39;uso dello strumento Tali in esecuzione di un test di vitalità cellulare nelle cellule che esprimono GFP. GFP-trasdotte sono testate in base alla Viabilità Tali Kit - Red Cell Morto. Le cellule sono poi pipettati in una diapositiva Tali analisi cellulare e caricato nel citometro. Campo chiaro, fluorescenza rossa e verde immagini di fluorescenza vengono catturati e analizzati utilizzando algoritmi di analisi specifiche. Gli istogrammi vengono poi generati per visualizzare le dimensioni delle cellule, PI fluointensità fluorescenza, e GFP intensità di fluorescenza. Questi parametri possono essere thresholded a casa su una popolazione di cellule specifiche. A fianco a confronto i lati del Citometro Tali basato su immagine e citometria a flusso tradizionali dimostra che i due metodi forniscono dati comparabili per quanto riguarda la vitalità delle cellule e di espressione delle proteine. Tuttavia, lo strumento Tali fornisce ulteriori informazioni visive sulla popolazione di cellule che non possono essere ottenuti utilizzando un citofluorimetro.

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Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Questo protocollo descrive come eseguire la vitalità cellulare e saggi di espressione utilizzando la fluorescenza Image-Based Tali Citometro.

Valutazione di espressione GFP e sostenibilità Utilizzando la Image-Based Tali Citometro

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Views.  Life Technologies. Questo protocollo descrive come eseguire la vitalità cellulare e saggi di espressione utilizzando la fluorescenza Image-Based Tali Citometro.

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Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Espressione mirato di GFP nel follicolo pilifero Utilizzando Ex trasduzione virale Vivo

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Ricerca

Biologia

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Conteggio e determinazione della vitalità delle cellule in coltura

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.