Salari e sostenere la ricerca sono stati forniti dal Consiglio soia Uniti, e da fondi statali e federali stanziati per la Ohio State University / Ohio ricerca agricola e Centro Sviluppo. Questa ricerca è stata anche parzialmente sostenuto da una borsa di studio CONACYT, Messico, a cmHg. La citazione di marchi o prodotti di proprietà non costituisce una garanzia o garanzia del prodotto da OSU / OARDC e inoltre non comporta l&#39;approvazione ad esclusione di altri prodotti che possono anche essere adatto. Gazzetta articolo non HCS 09-17.

La metodologia che segue delinea un protocollo per l&#39;analisi delle immagini di espressione genica utilizzando un sistema automatizzato di raccolta di immagini. Per semplicità di spiegazione, l&#39;approccio globale è stato suddiviso in quattro fasi: 1) la preparazione di semi, 2) introduzione del gene mediante bombardamento di particelle, 3) raccolta di immagini robotica, e 4) l&#39;analisi delle immagini. Anche se questa metodologia generale può essere utilizzata per un&#39;ampia gamma di altre applicazioni, la serie attuale di protocolli sono basati sull&#39;utilizzo della proteina fluorescente verde (GFP) del gene, che è un gene reporter utile per l&#39;espressione genica di tracciamento nello stesso pezzo di tessuti viventi nel tempo. I. Preparazione Seed <ol><li> Fagiolo di Lima (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush), i semi possono essere acquistati, o idealmente raccolto da piante coltivate in una camera di crescita (50% di umidità relativa, 16 / 8 h luce: buio, 25/23 ° C giorno / notte). Post-raccolta di semi di qualità può essere mantenuta da semi di stoccaggio a -20 ° C. </li><li> Preparare Magenta GA7 contenitori per la germinazione dei semi. Piegare la carta filtro o salviette di carta in base al fondo di scatole di Magenta. Aggiungere circa 25 ml di acqua deionizzata a ogni contenitore per inumidire asciugamani di carta, e versare l&#39;acqua non assorbita. Autoclave inumidito carta contenente scatole per 20 min. </li><li> Con 50 ml provette per centrifuga monouso, sterilizzare i semi in una soluzione al 10% di candeggina commerciale (20 semi in ml 20-40) per 20 minuti con agitazione su un agitatore rotatorio a 60 giri. Nota: Tutti i passi successivi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare. </li><li> Lavare i semi 4-7 volte con acqua deionizzata sterile scuotendo con cautela per 30 secondi durante ogni lavaggio. </li><li> Luogo 5-6 semi sterili tra gli strati di carta piegato trova in ogni casella Magenta sterile. </li><li> Incubare i semi per 4 giorni alle seguenti condizioni: 25 ° C, 16 / 8 h luce: buio e 40 μEm -2 s -1. </li></ol> II. Gene Introduzione con bombardamento di particelle <ol><li> Costruire costrutti del gene utilizzando il vettore preferito espressione con un gene reporter che possono essere monitorati nei tessuti viventi. Abbiamo progettato un elevato numero di copie vettore di espressione utile per promotore e analisi elemento promotore. Questo vettore contiene il gene GFP che viene utilizzato per visualizzare promotore / Funzione di un elemento promotore nei tessuti trasformati. </li><li> Circa 1-2 ore prima del bombardamento, accise Lima cotiledoni fagiolo di germinare piantine e togliere i cappotti seme. Cotiledoni adatto per bombardamento dovrebbe essere giallo al verde chiaro, piana e priva di qualsiasi danno che possa interferire con l&#39;analisi delle immagini ulteriormente. </li><li> Cotiledoni luogo il terreno di coltura contenente sali OMS MS 1, vitamine B5 2, 3% di saccarosio e 0,2% Gelrite (pH 5,7) subito dopo essere stato asportato. </li><li> Precipitare il DNA costruire sulla M10 particelle di tungsteno (Sylvania, Towanda, PA, USA). In un tubo microcentrifuga 0,6 ml, aggiungere 25 microlitri di particelle di tungsteno (le particelle sono risospeso in acqua sterile, 100 mg ml -1, a destra prima dell&#39;uso), 5 microlitri di DNA (1 mcg microlitri -1), 25 microlitri 2,5 M di cloruro di calcio (Sigma Cat-Aldrich. C3881-500G) e 10 microlitri 100 mM spermidina (Cat Sigma. S-2626). Vortex brevemente per mescolare completamente tutti i componenti. </li><li> Incubare la preparazione del DNA in ghiaccio per 5 min. Poi, rimuovere e scartare il surnatante 50 microlitri. </li><li> Risospendere il DNA particelle rivestite con vortex e rimuovere immediatamente un 2 aliquota microlitri. Ripetere questa operazione vortex ogni volta che viene rimosso un&#39;aliquota dal tubo. Particelle rivestite devono essere conservati in ghiaccio e utilizzato entro 15 minuti. </li><li> Attraverso la parte superiore di un filtro a siringa, si introducono 2 particelle microlitri rivestito nel centro dello schermo filtro. Posizionare l&#39;unità filtro contenente le particelle rivestito nell&#39;unità tenendo filtro all&#39;interno della camera di pistola particelle. </li><li> Posizionare un fagiolo di Lima lato adaxial cotiledone su un deflettore e posizionare il deflettore nella camera di pistola particelle. Il deflettore, che consiste in uno schermo sciolto al fondo di un bicchiere, è utilizzato come piattaforma per supportare i tessuti durante i bombardamenti. </li><li> Bombardano i tessuti utilizzando una pistola particelle (in questa metodologia, usiamo un semplice e poco costoso Gun afflusso particelle 3, PIG, progettata nel nostro laboratorio) come segue: a) aprire la valvola che conduce al vuoto di evacuare la camera, b) dopo il vuoto raggiunge i 760 mm (30 in) Hg, attivare il solenoide e rilasciare l&#39;elio per spingere le particelle, c) dopo il bombardamento di particelle, chiudere la valvola della linea del vuoto e il vuoto d&#39;aria con la valvola di scarico. La pressione dell&#39;elio utilizzato per accelerare le particelle è di 50 PSI. </li><li> Dopo il vuoto viene rilasciato, aprire la porta della camera per recuperare i cotiledoni bombardato e restituire il, lato adaxial cotiledone alto, alla cultura medio OMS. Nota: Per la quantificazione e profilo di espressione, di solito bombardare un minimo di tre cotiledoni per ogni DNA costruire. Un controllo positivo, che di solito è un DNAcostrutto che dà un ben studiato il profilo di espressione genica, è incluso come riferimento. </li></ol> III. Immagine di raccolta automatizzata <ol><li> Accendere la lampada al mercurio e attendere 30 minuti per la lampada si riscaldi. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione dei Spot-RT CCD (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA) e la piattaforma robotica di controllo motore, che aziona il movimento della piattaforma di robotica. </li><li> Impostare il set di filtri per il rilevamento di GFP (GFP2 filtro impostato;.. Ex nm 480/40, Em 510 LP) su un microscopio MZFLIII dissezione (Leica, Heerbrugg, Svizzera). </li><li> Sterilizzare il addensato in policarbonato coperchi Petri a spruzzo con il 70% di etanolo. I coperchi specializzati, utilizzati per coprire la base piastra di Petri evitare la condensa durante la raccolta di immagini 4. </li><li> Posizionare le piastre contenenti cotiledoni bombardato sulla piattaforma robotica (Arrick Robotica, Hurst, TX, USA) del sistema automatizzato di raccolta di immagini. La piattaforma robotica è guidata da un gruppo motore passo-passo e si compone di un tavolo per il fissaggio di 8 piastre di Petri. La piattaforma è costruita in policarbonato, polipropilene e alluminio. Le piastre sono fissate in posizione serrando una plastica laterale vite di fissaggio. </li><li> Aprire l&#39;applicazione software personalizzato che controlla sia la piattaforma robotica e l&#39;acquisizione di immagini. Inoltre, aprire il software bianco interruttore di controllo della luce. </li><li> Nella &quot;mozione motore&quot; scheda, fare clic su &quot;motore&quot; e &quot;camper&quot;. Dopo che il software orienta la piattaforma nella posizione iniziale, siamo pronti per iniziare a inserire le posizioni per ogni cotiledone. </li><li> Nel &quot;movimento del motore&quot;, selezionare il primo piatto. La piattaforma si posizionerà al centro della scatola di Petri nell&#39;ambito dell&#39;obiettivo del microscopio. Utilizzando i pulsanti di distanza in movimento, proprio la posizione del cotiledone prima raccolta di immagini. Con il controller di luce bianca, la regione di destinazione può essere osservata attraverso il monitor del computer attivando la &quot;modalità live&quot; caratteristica. </li><li> Per il cotiledone prima impostare la messa a fuoco e ingrandimento (ingrandimento 1,6 x è preferibile) utilizzando le manopole manuale sul microscopio da dissezione. Concentrare le regolazioni per i cotiledoni rimasti sulla stessa lastra sono realizzati con tre viti calanti posizionato sotto ciascun piatto, sulla piattaforma robotica. </li><li> Una volta che la regione di interesse è stata impostata, fare clic sul pulsante &quot;aggiungi questa posizione&quot;. Il software si aggiungono le coordinate di questa regione in un file di pianificazione posizione e la piattaforma torna al centro del piatto. </li><li> Impostare le posizioni e punto di riferimento per tutti i cotiledoni rimasti su piatti utilizzando i pulsanti di distanza in movimento e le viti di livellamento manuale. Dopo tutte le coordinate di tutti i cotiledoni sono stati inseriti, salvare le coordinate di posizione programma. </li><li> Immettere i parametri dell&#39;immagine raccolta. Nella &quot;creazione dell&#39;immagine&quot;, selezionare il tipo di luce desiderata, bianco o blu. Per il rilevamento GFP, solo la luce blu dovrebbe essere usato. Inoltre, immettere le impostazioni di esposizione. Anche se siamo in grado di modificare il tempo di esposizione in modo indipendente per il colore rosso, blu e verde, che in genere utilizzano le stesse impostazioni per GFP la documentazione fotografica (20, 14 e 14 sec per canali rosso, verde e blu, rispettivamente) che ci permette di fare diretto e confronto costante tra costrutti del DNA diversi. </li><li> Nella stessa &quot;impostazione immagine&quot; sulla scheda, specificare una cartella vuota dove le immagini vengono memorizzate. Ogni serie di immagini saranno salvate all&#39;interno di questa cartella master in cartelle indipendenti, numerati in sequenza secondo l&#39;ordine di posizioni sono assunte per cotiledoni. </li><li> Vai alla sezione &quot;tempo di acquisizione di controllo&quot; scheda e impostare l&#39;intervallo di acquisizione di immagini in tempo e il numero totale di cicli di raccolta di immagini. Le immagini vengono in genere raccolti ogni ora per 100 ore, generando ben definiti profili di espressione genica. </li><li> Avviare l&#39;acquisizione di immagini cliccando sulla &quot;pianificazione di esecuzione!&quot; pulsante che si trova nel &quot;programma di posizione&quot; sulla scheda. </li><li> Al termine della raccolta h 100 immagini, trasferire tutte le immagini dal computer di controllo del robot a qualsiasi unità di grande capacità rigido o computer per l&#39;analisi delle immagini ulteriormente. Immagini ad alta risoluzione (1600 x 1200 pixel) sono raccolti sotto forma di file TIF misura ~ 5 Mb ciascuna. </li></ol> IV. Analisi dell&#39;immagine <ol><li> Assemblare la 100 immagini in sequenza da ciascuna cartella utilizzando Adobe ImageReady. <ol><li> Aperto ImageReady e importare tutte le immagini in sequenza che compongono una serie di fotogrammi. </li><li> Ridimensionare le immagini originali a 800 x 600 pixel. Immagini raccolte sono ad alta risoluzione, che genera file di grandi dimensioni che possono rendere l&#39;elaborazione delle immagini lento. </li><li> Scorrere le immagini e trovare un punto (s), visibile nella maggior parte delle immagini. </li><li> Zoom fino al 300% sul posto scelto (s). Allineamento delle immagini con un ingrandimento maggiore consente una registrazione più precisa. </li><li> Inserire uno strato sopra di tutte le immagini e fare sicuramente visibile in tutti i fotogrammi. Segnare la (s) posizione posto con lo strumento &quot;pennello&quot;. </li><li> Avviare l&#39;allineamento tutti i fotogrammi con lo strumento &quot;sposta&quot; e prendendo i segni sullo strato come riferimento. </li><li> Quando l&#39;allineamento è completo, cancellare il livello utilizzato come riferimento e salvare le immagini come un unico file &quot;psd&quot;. Inoltre, esportare tutti i fotogrammi come un unico file &quot;mov&quot; con la più alta risoluzione. Allineamento manuale di ogni serie di immagini si ~ 10 min. </li></ol></li><li> Eseguire quantificazione dell&#39;espressione genica utilizzando ImageJ. <ol><li> Software open ImageJ e aprire il file &quot;mov&quot; salvato in precedenza in ImageReady. </li><li> Utilizzando lo strumento di selezione, scegliere una zona x 400 300 pixel e ritagliare l&#39;immagine. Questo nuovo file dovrebbe essere salvato come file &quot;avi&quot;. </li><li> Separare le immagini in sequenza, che si trova nel nuovo file &quot;avi&quot; in canali rosso, blu e verde, cliccando su &quot;immagine&quot;, &quot;colore&quot; e &quot;Split RGB&quot; in ImageJ. </li><li> Sottrarre la fluorescenza di fondo di tutte le immagini nei canali verde e rosso. Utilizzando la serie verde immagine del canale, selezionare una zona di 20 x 20 pixel da una regione con i non-cellule che esprimono e registrare la sua posizione nel &quot;Manager ROI&quot; strumento, in modo che la stessa area saranno selezionati in entrambi i canali. Con il quadrato di 20 x 20 pixel attivi nel canale verde, andare al comando &quot;plugins&quot; che si trova nella barra delle applicazioni di ImageJ e quindi fare clic su &quot;ROI sottrarre misurati per ogni sezione&quot; plug-tool. </li><li> In ImageJ, cliccare su &quot;Immagine&quot;, &quot;regolare&quot; e poi &quot;soglia&quot; per definire il segmento o GFP-esprimere pixel. Regolare i livelli di soglia trascinando la barra della finestra soglia di ottenere una dimensione media macchia di 20-30 pixel. </li><li> Determinare l&#39;espressione GFP utilizzando un plugin che abbiamo progettato per misurare il valore di grigio medio per pixel e il numero totale di GFP che esprimono pixel. </li><li> Copiare l&#39;uscita significano i valori in scala di grigi ImageJ e incolla in Microsoft Office Excel. Calcolare l&#39;espressione della GFP per ogni canale (rosso e verde) moltiplicando la media valore di grigio per pixel per il numero totale di GFP-esprimere pixel per ogni canale. La somma dei valori di espressione per entrambi i canali dà l&#39;espressione GFP. I valori possono essere utilizzati per illustrare profili di espressione genica e fare confronti diretti. Time-lapse animazioni possono essere anche generati utilizzando &quot;mov&quot; e &quot;avi&quot; file, che fornisce una visualizzazione unica e chiara del profilo di espressione genica. </li></ol></li></ol> V. Rappresentante Risultati La raccolta di immagini robotica e Procedura per l&#39;analisi (Fig. 1) qui riportata permette l&#39;acquisizione di una grande quantità di dati quantitativi sulla espressione genica in un breve periodo di tempo. Per la caratterizzazione dell&#39;impianto promotore utilizzando il gene GFP, questa metodologia non solo è utile per creare profili di espressione transitoria (Fig. 2), ma anche di tenere traccia in modo dettagliato, espressione di GFP in transitoriamente e tessuti vegetali stabilmente trasformato 5,6. Breve time-lapse animazioni generate con le immagini raccolte in sequenza sono uno strumento prezioso per approfondite analisi di espressione genica nel tempo nei tessuti vegetali. Questa metodologia ha anche grande applicazione per valutare i fattori che influenzano direttamente l&#39;espressione genica. Per esempio, l&#39;espressione GFP transitoria sotto la presenza di diversi soppressori di silenziamento di origine virale è stato studiato con successo usando la nostra raccolta automatica delle immagini e sistema di analisi 7,8. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Procedura di analisi di immagine si compone di quattro fasi principali. (A) Acquisizione di serie di immagini utilizzando il sistema robotico raccolta di immagini, (B) separazione di immagini in canali rosso, blu e verde, (C) segmentazione dei pixel che esprime regolando i livelli di soglia, e (D) ottenendo i risultati di uscita contenente i valori in scala di grigi e la GFP che esprimono conteggio fuoco. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Grafico che mostra diversi profili di espressione transiente guidati da promotori impianto fuso a GFP. I dati sono stati raccolti utilizzando il nostro sistema robotico raccolta di immagini e analizzati con ImageReady e software ImageJ.

<ol>
	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

L&#39;uso della robotica ha enormi applicazioni in diversi aspetti della vita umana, in particolare, i robot sono stati effettivamente utilizzati per svolgere attività in ambienti pericolosi, per automatizzare le attività noiose e complesse, e di svolgere compiti in modo più preciso. In biologia molecolare, ed in particolare le analisi di espressione genica, i robot possono contribuire a tracciare non solo le caratteristiche dei geni, ma anche la crescita dei tessuti e lo sviluppo nel tempo. Molti fenomeni biologici avvengono in modo dinamico, che può essere difficile da seguire con singolo punto di osservazione del tempo. L&#39;uso del gene GFP per studi di espressione apporta ulteriori vantaggi per l&#39;osservazione di risposta dei tessuti e la crescita. Per le nostre procedure sperimentali, GFP ci permette di seguire l&#39;espressione genica nello stesso pezzo di tessuto nel corso del tempo il rilevamento GFP è un non-distruttiva. Inoltre, la nostra versione della proteina GFP è sufficientemente stabile da consentire il rilevamento, ma mostra anche alcune fatturato di ridurre al minimo l&#39;accumulo nei tessuti vegetali, che ci permette di seguire sia l&#39;ascesa e la caduta di espressione genica. Abbiamo già utilizzato nostra collezione robotico immagine e sistema di analisi per una vasta gamma di applicazioni. Si prevede un elevato potenziale per molte applicazioni biologiche in cui si desidera una comprensione dinamica di un fenomeno. Per esempio, la crescita e lo sviluppo dei tessuti vegetali si possono seguire con il nostro sistema dando informazioni preziose / informazioni su questi processi. Inoltre, la dinamica del trasporto di proteine ​​utilizzando geni reporter come GFP, possono essere facilmente visualizzati utilizzando time-lapse animazioni. La metodologia descritta in questo rapporto è tecnicamente complessa ma concettualmente semplice. I nostri risultati sono robusti e nuove applicazioni vengono continuamente scoperti.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

Espressione genica nei tessuti vegetali è tipicamente studiato per estrazione distruttiva di composti da tessuti vegetali per<em&gt; In vitro</em&gt; Analisi. I metodi presentati qui utilizzare la proteina fluorescente verde (<em&gt; GFP</em&gt;) Del gene per il monitoraggio continuo di espressione genica gli stessi pezzi di tessuti, nel corso del tempo. Il<em&gt; GFP</emGene&gt; è stata posta sotto controllo regolamentare promotori diversi ed introdotti nel fagiolo di Lima tessuti cotyledonary tramite bombardamento di particelle. Cotiledoni sono stati poi posto su un sistema robotico raccolta di immagini, che consisteva di un microscopio a fluorescenza dissezione con una macchina fotografica digitale e un 2-dimensionale piattaforma robotica progettato su misura per consentire l&#39;attaccamento sicuro di piatti della cultura. Le immagini sono state raccolte da tessuti cotyledonary ogni ora per 100 ore di generare profili di espressione per ciascun promotore. Ogni serie di 100 immagini raccolte per la prima volta sottoposto ad allineamento manuale delle immagini con ImageReady per accertarsi che GFP che esprimono focolai sono stati costantemente mantenuti all&#39;interno dei campi selezionati di analisi. Regioni specifiche della serie di 300 x 400 pixel, sono state poi selezionate per ulteriori analisi per fornire misurazioni dell&#39;intensità GFP utilizzando il software ImageJ. Le immagini dei lotti sono stati divisi in canali rosso, verde e blu e GFP che esprimono aree sono state individuate utilizzando la funzione soglia di ImageJ. Dopo aver sottratto la fluorescenza di fondo (sottrazione di valori di grigio di non esprimere pixel da ogni pixel) nei rispettivi canali rosso e verde, l&#39;intensità GFP è stata calcolata moltiplicando la media valore di grigio per pixel per il numero totale di GFP-esprimere pixel in ogni canale, e quindi aggiungere i valori per entrambi i canali rosso e verde. I valori di intensità GFP sono stati raccolti per tutti i 100 punti di tempo per produrre profili di espressione. Variazioni di profili di espressione GFP il risultato di vari fattori come la forza promotrice, la presenza di un soppressore tacere, o la natura del promotore. Oltre alla quantificazione dell&#39;intensità GFP, la serie di immagini sono state utilizzate anche per generare time-lapse animazioni con ImageReady. Time-lapse animazioni rivelato che la netta maggioranza delle cellule mostrato un aumento relativamente rapido espressione GFP, seguito da un lento declino. Alcune cellule occasionalmente mostrato una improvvisa perdita di fluorescenza, che può essere associata a una rapida morte cellulare. Trasporto apparente GFP attraverso la membrana e parete cellulare a celle adiacenti è stata anche osservata. Lasso di tempo animazioni fornito ulteriori informazioni che altrimenti non potrebbero essere ottenuti utilizzando i profili di intensità GFP o singola volta raccolte di immagini punto.

Watch this Scientific Journal Video about Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues at JoVE.com

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Riportiamo un metodo per l&#39;introduzione, il monitoraggio e l&#39;analisi quantitativa di espressione GFP nelle cellule vegetali. Questo metodo utilizza un sistema progettato su misura per la robotica semi-continua raccolta di immagini da un gran numero di campioni, nel corso del tempo. Abbiamo anche dimostrare l&#39;uso di ImageJ e ImageReady per l&#39;analisi delle serie di immagini.

Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

robotics-dynamic-image-analysis-for-studies-gene-expression-plant

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Views.  The Ohio State University. Riportiamo un metodo per l'introduzione, il monitoraggio e l'analisi quantitativa di espressione GFP nelle cellule vegetali. Questo metodo utilizza un sistema progettato su misura per la robotica semi-continua raccolta di immagini da un gran numero di campioni, nel corso del tempo. Abbiamo anche dimostrare l'uso di ImageJ e ImageReady per l'analisi delle serie di immagini.

Video: Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Ricerca

Biologia

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elettrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...