Vorrei ringraziare Olga de Souza Silva per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (FNS) Grant 31003A_127029.

Il metodo TransFLP (Figura 1) è esemplificato da tre diversi approcci: I) la delezione di due geni adiacenti codificano determinanti di virulenza di V. cholerae (ad esempio, ΔctxAB), II), la rimozione di un&#39;isola patogenicità (ad esempio, ΔVPI-1) e iii) l&#39;integrazione di una sequenza polimerasi dipendente dal promotore T7 RNA monte di un gene d&#39;interesse, che consente successivamente il suo espressione artificiale in background ceppo corrispondente (ad esempio, T7-TFox) (Figura 2). 1. Preparazione di fiocchi chitina <ol><li> Peso 50-80 mg di fiocchi chitina in un tubo di plastica standard da 1,5 ml. Questo può essere preparato in bulk. Fiocchi di chitina sono disponibili in commercio da Sigma (cat. numero C9213). </li><li> Autoclavare i fiocchi mantenendo i coperchi dei tubi aperto. </li><li> Immediatamente chiudere i coperchi dopo l&#39;autoclave si è raffreddato. </li><li> Conservare autoclavato chitina fiocchia temperatura ambiente. </li></ol> 2. Opzionale: trasformazione artificiale di V. cholerae con ricombinasi Flp-plasmide codificante <ol><li> Preparare electrocompetent V. cellule cholerae utilizzando metodi standard 11. Memorizzare aliquote di cellule competenti a -80 ° C. </li><li> Aggiungere 1-2 ml di un normale mini-preparazione del plasmide PBR-FLP 5 al electrocompetent V. cellule cholerae e trasferire il composto in una cuvetta elettroporazione (0,2 fessura cm). </li><li> Applicare un impulso a 1,6 kV. </li><li> Aggiungere 0,9 ml di terreno SOC, delicatamente trasferire cella a una standard 14 ml tubetto. Incubare non in movimento per 2,5 a 3 ore a 30 ° C. </li><li> Piastra 100 ul e 300 ul su piastre LB contenenti 100 pg / ml di ampicillina e incubare a 30 ° C per una notte. </li><li> Purificare singolo clone e negozio come stock in glicerolo per esperimenti TransFLP futuri. </li></ol> 3. Progettazione Oligonucleotide e Polymerase Chain Reaction <ol><li> Almeno sei oligonucleotidi sono necessari per amplificare la regione di DNA (s) di interesse e l&#39;FRT-fiancheggiato cassetta antibiotico mediante PCR (Figura 3). Si raccomanda di includere anche una coppia di oligonucleotidi innesco fuori del frammento inserito PCR. Ciò consente il controllo per l&#39;integrazione e escissione corretta FRT-fiancheggiato cassette resistenza agli antibiotici (ad esempio raffigurato come &#39;chk-up&#39; e &#39;chk-down&#39; primer nelle figure 3 a 5). </li><li> Progettare gli oligonucleotidi # 2, # 3, # 4 e # 5 con cura. Essi dovrebbero essere in grado di ricottura sufficiente (ad es ~ 28 bp) al DNA stampo. Il DNA stampo il DNA genomico (gDNA) per i primer # 2 e # 5 e FRT-Kan-FRT-DNA plasmide contenente come pROD17 12 e pBR-FRT-KAN-FRT (questo studio) per i primer # 3 e # 4 ( Figura 3A). </li><li> Progettare i primer # 2 a # 5 che consente ampia base-accoppiamento alla loro 5&#39;-end tra # 2 / # 3 e # 4 / # 5, rispettivamente (Figura 3A </strong&gt; riquadro). Due cicli di PCR seguire. </li><li> Eseguire tre reazioni PCR indipendenti come un giro 1 ° di PCR. Il primo sarà amplificare la regione a monte del gene / DNA regione d&#39;interesse con l&#39;ausilio di oligonucleotidi # 1 e # 2. La PCR dovrebbe risultare in un frammento di almeno 500 bp di lunghezza per consentire ricombinazione omologa all&#39;interno delle cellule. Brevi frammenti (~ 250 bp) può essere sufficiente 8 ma non sono raccomandati. </li><li> Parallelamente effettuare la seconda PCR, che amplifica la cassetta FRT-fiancheggiata antibiotico. Per gli esempi forniti qui abbiamo usato principalmente aph (kan R). Oligonucleotidi uso # 3 e # 4 di questa reazione (Figura 3A). </li><li> Allo stesso tempo, amplificare la regione a valle del DNA mediante PCR (terzo campione). Il frammento PCR deve essere almeno 500 bp di lunghezza. Eseguire la PCR con gDNA come stampo e oligonucleotidi # 5 e # 6 (Figura 3A). </li><li> Dopo purificazione di tutti e tre PCRframmenti, eseguire il 2 turno di PCR. Usare una miscela uguale di tutti e tre i frammenti ottenuti al primo turno come template. L&#39;amplificazione è catalizzata da oligonucleotidi # 1 e # 6. Il risultante frammento di PCR (Figura 3B) serve da trasformare DNA nell&#39;esperimento trasformazione naturale (Figura 1). </li></ol> 4. La chitina-indotta trasformazione naturale <ol><li> Grow V. cellule cholerae aerobiosi in terreno ricco a 30 ° C fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm di circa 0,5. </li><li> Raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Lavare pellet volta in mezzo artificiale definito (DASW 6) prima di risospendere le cellule in 2 volumi di DASW. Aggiungere 1 ml di coltura a 50-80 mg di sterile fiocchi di chitina (spiegato al punto 1). Se i batteri porto plasmide pBR-FLP (opzionale punto 2), add ampicillina (50 pg / ml) alla cultura. Incubare a 30 ° C per 16-24 hr senza movimento. </li><li> Aggiungi &amp; ge, 200 ng del II-tutto PCR derivato da due frammenti (indicato al punto 3). Mescolare con cura, evitando ampiamente staccare i batteri dalle superfici chitina. Incubare a 30 ° C per 24 ore senza movimento. </li><li> Vortex la cultura ampiamente per ≥ 30 sec. Stendere 100-300 microlitri su piastre di terreno selettivo LB (ad esempio gentamicina o kanamicina contenenti piastre LB per gli esempi forniti qui). Utilizzare doppio selettive piastre se i batteri ospitano il plasmide pBR-flp aggiungendo ampicillina concomitanza ad altri antibiotici. Incubare le piastre a 30 ° C per 16-24 ore o fino colonie sono visibili. </li><li> Isolare trasformanti singoli dalle piastre selettive. Tali trasformanti hanno sostituito il locus cromosomico originale dal frammento PCR a causa di un evento di crossover doppia. Questi ceppi possono essere direttamente utilizzati per ulteriori esperimenti nel caso la rimozione della cassetta antibiotico non è necessario. </li></ol> 5. Rimozione di cassetta selettivo (s) da Flp-Ricombinazione <ol><li> Artificialmente trasformare i trasformanti con il plasmide PBR-flp come descritto al punto 2, se non ancora effettuato il test di trasformazione naturale. </li><li> Crescere i batteri su piastre di agar LB contenenti ampicillina a 37 ° C per 16-24 ore. Opzioni: consente di modificare la temperatura in mezzo per 2-3 ore a 40 ° C come espressione della FLP dal plasmide PBR-FLP è de-represso alle alte temperature; 5,10 batteri trasferimento a piatti freschi dopo ca. 8 ore di incubazione. </li><li> Di prova per antibiotico-sensibilità (dimostrato qui per kanamicina, figura 1) da restreaking i cloni in parallelo su piastre di agar contenenti antibiotici e antibiotico-free. Isolare singole colonie sensibili. Congelare ampicillina-clone resistente come stock in glicerolo se si intende modificare ulteriormente la tensione con delezione altri / inserimento utilizzando TransFLP. </li></ol> 6. Polimerizzazione plasmide <ol><li> Crescere la cultura durante la notte in condizioni aerobiche ea 30 ° C. Utilizzare terreno ricco senza l&#39;aggiunta di qualsiasi antibiotico. </li><li> Opzionale: crescere coltura fresco per 3-6 ore diluendo il 1:100 notte cultura in fresco antibiotici terreno privo. </li><li> Piatto o striscia di diluizione (s) della cultura sulla piastra piana agar LB (s) e incubare a 30 ° C per 8-16 ore (fino a quando le colonie sono visibili). </li><li> Test per ampicillina sensibilità dei cloni restreaking dai cloni in parallelo su piastre di agar contenenti antibiotici e antibiotico-libera (figura 1). Congelare ampicillina sensibile ceppo stock in glicerolo. </li></ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo sopra descritto TransFLP e altrove 5 è stato ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio. Il tipo di manipolazioni genetiche che sono fattibili includono tra gli altri: delezione di geni singoli e gruppi di geni, delezione di isole genomiche (es., VPI-1), l&#39;inserimento di sequenze a monte di un gene di interesse (ad esempio, sequenze promotore) ed inserimento di sequenze alla fine di un gene specifico (ad esempio, codifica tag di affinità). <p class="jove_conten...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Chitina fiocchi </td><td> Sigma </td><td> C9213 </td><td> Sterilizzazione in autoclave necessaria </td></tr><tr><td> OPTIONAL: Micropulser (nel caso in cui cassetta antibiotica deve essere asportato da ricombinasi Flp codificati su PBR-FLP) </td><td> Biorad </td><td> 165-2100 </td><td> O electroporators comparabili </td></tr></tbody></table>

transflp &#x2014; a method to genetically modify vibrio cholerae based on natural transformation and flp-recombination

Sono disponibili diversi metodi per manipolare cromosomi batterici 1-3. La maggior parte di questi protocolli invocare l&#39;inserimento di plasmidi replicativi condizionale (es. ospitano repliconi pir-dipendenti ovvero termosensibili 1,2). Questi plasmidi sono integrati in cromosomi batterici basati su omologia-mediata ricombinazione. Tali mutanti inserzionali sono spesso direttamente utilizzati in contesti sperimentali. In alternativa, la selezione per escissione plasmide seguita dalla perdita può essere eseguita, per cui batteri Gram-negativi dipende spesso contro-selezionabile enzimatico saccarasi Levan codificata dal gene sacB 4. L&#39;escissione può ripristinare il pre-inserimento genotipo o provocare uno scambio tra il cromosoma e il plasmidica copia del gene modificato. Uno svantaggio di questa tecnica è che richiede tempo. Il plasmide deve essere clonato prima, richiede trasferimento orizzontale in V. cholerae la maggior parte (n<html> otably con l&#39;accoppiamento con una E. coli ceppo donatore) o trasformazione artificiale di quest&#39;ultimo, e l&#39;escissione del plasmide è casuale e può ripristinare il genotipo iniziale o creare la modifica desiderata in assenza di selezione positiva viene esercitata. Qui, presentiamo un metodo per la manipolazione rapida V. cholerae cromosoma (s) 5 (Figura 1). Questo metodo TransFLP si basa sulla recente scoperta chitina-mediata induzione di competenza naturale in questo organismo rappresentativo 6 e altri del genere Vibrio come V. fischeri 7. Competenza naturale permette l&#39;assunzione di DNA libero tra cui PCR generati frammenti di DNA. Una volta assunto, il DNA ricombina con il cromosoma data la presenza di un minimo di 250-500 bp fiancheggianti della regione omologa 8. Compreso un marcatore di selezione in-tra le regioni a fianco permette la facile individuazione dei trasformanti frequenti. t &quot;&gt; Questo metodo può essere utilizzato per diverse manipolazioni genetiche V. cholerae e batteri naturalmente competenti potenzialmente anche altri. Forniamo tre esempi nuovi su ciò che può essere realizzato con questo metodo, oltre al nostro studio precedentemente pubblicato sul gene delezioni singole e la aggiunta di affinità-tag sequenze 5. procedura di ottimizzazione in materia di protocollo iniziale di chitina-trasformazione indotta naturale 6 sono incorporati nel presente protocollo TransFLP., tra cui tra l&#39;altro la sostituzione di frammenti di conchiglie granchio disponibile in commercio da chitina fiocchi 8, la donazione di PCR derivato da DNA trasformante materiale 9, e l&#39;aggiunta di FLP-ricombinazione siti bersaglio (FRT) 5. siti FRT consentono escissione sito-diretta del marcatore di selezione mediata dalla ricombinasi Flp 10.

Risultati rappresentativi di tre esempi sono mostrati nelle figure 4 a 6. Il primo approccio volto a eliminare i geni vicini ctxA e ctxB. Insieme codificare il principale fattore di virulenza V. cholerae, tossina del colera. Abbiamo progettato oligonucleotidi per il metodo TransFLP come sopra descritto e secondo la figura 3. Il ceppo parentale, il ceppo intermedio ospitare la FRT-fiancheggiato cassetta antibiotico resistenza al locus DNA originale ctxAB</e...

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TransFLP &amp;#x2014; A Method to Genetically Modify &lt;em&gt;Vibrio cholerae&lt;/em&gt; Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Un metodo rapido per modificare il genoma di<em&gt; V. cholerae</em&gt; È descritto. Queste modifiche includono la cancellazione dei singoli geni, i cluster di geni e le isole genomiche, nonché l&#39;integrazione di brevi sequenze (ad esempio, elementi promotori o per affinità tag sequenze). Il metodo si basa sulla trasformazione naturale e FLP-ricombinazione.

TransFLP - un metodo per modificare geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sulla base di trasformazione naturale e FLP-ricombinazione

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

transflp-method-to-genetically-modify-vibrio-cholerae-based-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

14.5K Views.  Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). Un metodo rapido per modificare il genoma di V. cholerae È descritto. Queste modifiche includono la cancellazione dei singoli geni, i cluster di geni e le isole genomiche, nonché l'integrazione di brevi sequenze (ad esempio, elementi promotori o per affinità tag sequenze). Il metodo si basa sulla trasformazione naturale e FLP-ricombinazione.