Questo protocollo è significativo perché descrive un altro importante strumento per sezionare la biologia molecolare dell'agente della malattia di Lyme Borrelia burgdorferi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizzando la trasduzione fagica, fornisce un metodo alternativo per introdurre il DNA nella Borrelia burgdorferi senza richiedere l'applicazione di un impulso elettrico, come nell'elettroporazione. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per fornire ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari utilizzati da Borrelia burgdorferi per persistere nel suo ciclo enzootico e, infine, causare la malattia di Lyme negli esseri umani.
Per iniziare, inoculare 150 microlitri del clone appropriato di Borrelia burgdorferi in 15 millilitri di BSK in provette coniche sterili strettamente coperte per il protocollo di trasduzione. Quindi, integrare il terreno con la concentrazione appropriata di antibiotici o una combinazione di antibiotici per la selezione e il mantenimento del DNA eterologo all'interno del clone Borrelia burgdorferi e incubare il campione a 33 gradi Celsius. Dopo che la coltura è cresciuta, centrifugare il volume appropriato di coltura a 6.000 G per 10 minuti.
Dopo aver decantato il surnatante, risospendere il pellet in quattro millilitri a BSK fresco e trasferire il campione nel tubo sterile più piccolo disponibile per contenere il campione con uno spazio minimo sulla testa. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di agente induttore alla concentrazione raccomandata sulla base di un volume di coltura di quattro millilitri per indurre la produzione di fagi, tappare strettamente il tubo e mescolare accuratamente. Incubare il campione a 33 gradi Celsius per due o quattro ore.
Quindi, trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare il campione a 6.000 G per 10 minuti. Dopo aver travasato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 15 millilitri di BSK.
Integrare la coltura preparata con la concentrazione antibiotica appropriata descritta nel manoscritto, mentre si incuba il campione a 33 gradi Celsius per 72-96 ore. Per preparare soluzioni per la precipitazione PEG, preparare 500 millilitri di cloruro di sodio a cinque molari, 500 millilitri di PEG al 40% e 100 millilitri di mezzo di sospensione come descritto nel manoscritto. Per sterilizzare, autoclavare la soluzione, raffreddare prima dell'uso e conservare la temperatura ambiente o quattro gradi Celsius.
Per la precipitazione PEG del fago dal clone del donatore Borrelia burgdorferi, dopo 72-96 ore di incubazione, centrifugare i campioni a 8.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri e smaltire il pellet cellulare. Aggiungere cloruro di sodio a cinque molari ad una concentrazione finale di un molare.
Dopo aver mescolato bene, rotola delicatamente a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare i campioni a 8.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver decantato il surnatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri come dimostrato in precedenza, aggiungere la soluzione 40% PEG-8000 al surnatante a una concentrazione finale del 10% Mescolare bene e mettere su ghiaccio per più di un'ora, fino a una notte.
Centrifugare i campioni a 8.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius come dimostrato in precedenza. Scartare il surnatante e rimuovere quanto più liquido in eccesso possibile senza perdere alcun pellet, che contiene le particelle fagiche. Risospendere il pellet in un volume minimo di mezzo di sospensione utilizzando il mezzo di sospensione per lavare il lato della bottiglia e raccogliere eventuali particelle fagiche.
Trattare il campione di fago recuperato con un volume uguale di cloroformio in base al volume di risospensione. Mescolare bene il campione e centrifugare a 8.000 g per 10 minuti. Quindi, rimuovere lo strato acquoso in un tubo pulito, evitando uno qualsiasi degli strati di interfaccia spessi.
Dopo aver determinato il volume recuperato, dopo il primo trattamento con cloroformio, trattare nuovamente il campione con una quantità di cloroformio pari al 10% di tale volume. Trasferire lo strato acquoso in un tubo pulito facendo attenzione ad evitare qualsiasi interfaccia o strati organici. Utilizzare immediatamente il fago o conservarlo a quattro gradi Celsius.
Dopo aver preparato le colture di Borrelia burgdorferi da utilizzare come riceventi nei saggi di trasduzione come dimostrato in precedenza, centrifugare il volume di coltura a 6.000 G per 10 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 14,5 millilitri di BSK fresco. Aggiungere meno o uguale a 500 microlitri di campione di fago precipitato con PEG alla coltura del clone ricevente.
Dopo aver mescolato bene, incubare a 33 gradi Celsius per 72-96 ore. Eseguire la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida dopo miscelazione con fago precipitato con PEG come descritto nel manoscritto. A seconda del background del clone ricevente, controllare che le colonie appaiano all'interno dell'agarosio sulle piastre di selezione dopo 10-21 giorni di incubazione.
Scegli almeno da 5 a 10 colonie che crescono sulla piastra in presenza di entrambi gli antibiotici usando pipetta borosilicata sterilizzata da 5,75 pollici con tappo di cotone e inoculali in 1,5 millilitri di BSK con l'antibiotico appropriato. L'amplificazione PCR dei geni è stata eseguita su 10 dei cloni che codificano la resistenza alla kanamicina e alla gentamicina. Il gene di resistenza alla kanamicina potrebbe essere amplificato dal donatore c1673 e dai potenziali trasduttori, ma non dal ricevente c1706.
Allo stesso modo, il gene di resistenza alla gentamicina potrebbe essere amplificato dal ricevente c1706 e dai potenziali trasduttori ma non dal donatore, rappresentando eventi di trasduzione. Dimostrare che la cassetta di resistenza alla kanamicina è stata trasdotta da 5BB1 dal donatore al ricevente. Lo sfondo dei trasduttori è stato determinato utilizzando marcatori specifici del ceppo.
Il clone c1673 e lo sfondo CA-112A codificano ampliconi specifici quattro, cinque e sei, mentre c1706, che ha uno sfondo B31 ad alto passaggio, non lo fa. Allo stesso modo, ai trasduttori uno e due mancavano gli ampliconi quattro, cinque e sei, dimostrando che i cloni hanno il background c1706 e hanno acquisito il gene di resistenza alla kanamicina da c1673. Per la precipitazione PEG del fago, eseguire attentamente tutti i passaggi per massimizzare la resa del fago e trattare accuratamente il fago risospeso con cloroformio per rimuovere il più possibile i contaminanti PEG e dei terreni di coltura prima dell'uso e dello stoccaggio dei fagi.
Una volta che il saggio di trasduzione è stato eseguito con successo e il transduttore verificato, questi cloni sono quindi disponibili per rispondere alle domande che richiedono Borrelia burgdorferi geneticamente modificata. Si spera che lo sviluppo di questa tecnica consentirà ai ricercatori di manipolare geneticamente i ceppi di Borrelia burgdorferi per i quali l'introduzione del DNA tramite elettroporazione è attualmente difficile.
