Questo protocollo utilizza l'irradiazione a luce violetta visibile per indurre la fotolisi mononucleotidica della flavina. Questo produce una grande quantità di radicali liberi, che inibiscono i batteri patogeni come Staphylococcus aureus ed E.coli. Abbiamo testato il mononucleotide di flavina come fotosensibilizzante appropriato.
In questo protocollo, utilizziamo la luce viola visibile che è sicura e non richiede attrezzature costose. Questo metodo può essere utilizzato per la terapia della pelle lesa o dei tessuti sottocutanei infetti inserendo una fibra ottica per l'illuminazione. Può anche essere applicato alla pratica igienico-sanitaria nell'industria alimentare.
A dimostrare la procedura sarà Tang-Yu Chen, uno studente laureato del mio laboratorio Per iniziare, montare sei diodi emettitori di luce di 12 volt ciascuno all'interno di un bicchiere di plastica opaca. Prendi una provetta di vetro con un diametro di 13 millimetri e un'altezza di 100 millimetri e aggiungi i reagenti alla provetta. Fissare i tubi nella parte superiore della tazza e posizionare questa configurazione a una temperatura costante di 25 tre gradi Celsius.
Monitorare e registrare la temperatura delle unità di prova durante le reazioni fotolitiche mediante un termometro a infrarossi. Quindi, preparare una soluzione FMN da 0,1 millimolari in tampone fosfato di potassio da 100 millimolari a pH 7,8. Esporre tre millilitri di campioni FMN ciascuno alla luce blu, verde, rossa o viola per cinque minuti.
In parallelo, tenere tre millilitri di soluzione FMN al buio come controllo. Inserire il campione in uno spettrofotometro visibile ai raggi UV e registrare l'assorbanza dei campioni irradiati nell'intervallo da 250 a 750 nanometri. Per prepararsi alla rilevazione dei radicali superossido, aggiungere prima 109,3 milligrammi di L-metionina a 73,3 millilitri di tampone fosfato da 100 millimolari a pH 7,8.
Nella soluzione, aggiungere 10 milligrammi di polvere NBT e 1,5 millilitri di FMN da 0,117 millimolari. Esporre un millilitro della soluzione di reazione alla luce LED blu o viola per uno a cinque minuti. Registrare l'assorbanza di 516 nanometri per rilevare il formazan, che è prodotto dalla reazione fotochimica di NBT.
Inoculare una colonia di Staphylococcus aureus in 10 millilitri di brodo lisogenico in una provetta con tappo a vite da 15 millilitri. Coltiva la cultura a 37 gradi Celsius per 16 ore in uno shaker. Trasferire 0,5 millilitri della coltura in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.
Diluire la coltura a una densità ottica di 0,5 a 600 nanometri aggiungendo acqua sterilizzata. Quindi, trasferire 0,5 millilitri della coltura in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare a 14.000 G per 10 minuti e decantare il surnatante.
Aggiungere un millilitro di soluzione tamponata FMN al pellet e al vortice della cellula. Per il controllo irradiato, aggiungere un millilitro di tampone fosfato. Trasferire un millilitro di soluzione cellulare batterica contenente 30 micromolari FMN e tampone fosfato in tubi di vetro.
Posizionali per una radiazione sotto la luce viola a 10 watt per metro quadrato per 30 minuti. Quindi, trasferire un millilitro di soluzione cellulare batterica contenente 30-60 e 120 micromolari FMN e tampone fosfato in tubi di vetro. Irradiare con luce blu per 120 minuti a 20 watt per metro quadrato.
Inoltre, irradiare un tubo contenente un millilitro di FMN 120-micromolare per 60 minuti. Dopo l'irradiazione, aggiungere 0,2 millilitri della soluzione di reazione su una piastra di agar luria. Stendere la soluzione utilizzando una bacchetta di vetro a forma di L e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, calcolare il conteggio delle piastre vitali e il tasso di inattivazione di Staphylococcus aureus. Preparare i campioni di stafilococco aureo come descritto in precedenza per ottenere un pellet cellulare. A 75 millilitri di tampone fosfato aggiungere 0,1093 grammi di L-metionina, 0,1 grammi di NBT e 25 millilitri di soluzione FMN.
Aggiungere un millilitro di ciascuna soluzione di reagente con concentrazioni di FMN variabili ai pellet cellulari e al vortice. Irradiare le soluzioni sotto luce viola a 10 watt per metro quadrato per 10 minuti. Centrifugare la miscela a 14.000 G per 10 minuti e decantare il surnatante.
Risospendere il pellet in un millilitro di dimetilsolfossido per estrarre l'NBT ridotto. Registrare l'assorbanza a 560 nanometri. L'irradiazione di FMN con luce verde e rossa non ha mostrato alcun effetto sui picchi a 372 e 444 nanometri rispetto al controllo scuro, mentre la riduzione dell'assorbanza di FMN a 444 nanometri è stata osservata sotto luce blu e viola, indicando un aumento della fotolisi.
La rilevazione dei radicali superossido formati durante la fotolisi FMN sotto luce blu o viola è stata effettuata utilizzando la riduzione NBT. L'effetto fotochimico della FMN dipendeva dal tempo di irradiazione. La fotolisi FMN mediante irradiazione di luce blu o viola ha determinato una significativa inattivazione dello Staphylococcus aureus.
L'inattivazione dose-dipendente è stata osservata per l'irradiazione con luce blu, con un'inattivazione del 97% raggiunta per FMN a 120 micromolari. Sotto luce viola, è stato raggiunto un tasso di inattivazione del 96% per lo stafilococco aureo, con 30 micromolari FMN che hanno mostrato una maggiore efficacia per l'inattivazione batterica. La riduzione dell'NBT ha mostrato che l'effetto fotolitico dell'FMN sotto luce violetta nello Staphylococcus aureus era proporzionale alla concentrazione di FMN.
In condizioni non trattate, una minore abbondanza di radicali superossido è stata indicata da una bassa assorbanza a 560 nanometri, mentre valori di assorbanza più elevati nel trattamento FMN hanno mostrato un'abbondante produzione di radicali superossido, con conseguente aumento dell'effetto fotochimico. È fondamentale avere una buona sorgente luminosa a LED. La larghezza spettrale del regime di luce viola deve essere stretta per evitare qualsiasi sovrapposizione con l'assorbimento UV, poiché la radiazione UV può essere pericolosa.
Dopo la procedura, altri composti chimici come tetraciclina, doxiciclina, catechina e possono essere testati per la fotolisi simile a FMN.
