Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito attraverso la National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) e ORDA a SIUC. Ringraziamo NSF per una borsa di studio (CHE-0959568) per l&#39;acquisto di un FE-SEM. Vorremmo ringraziare il Prof. Matteo McCarroll per le discussioni utili. Julia Reyes si ringraziare Colciencias, Agenzia colombiano e Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia per la sua borsa di studio e sostegno finanziario.

A. Sintesi e caratterizzazione di liposomi PDA 4,5,6 Nota 1: Proteggere la soluzione dalla luce PDA utilizzando foglio di imballaggio di alluminio su ogni contenitore in tutte le fasi sperimentali. Nota 2: Due insiemi diversi di soluzione liposomi (B e C) sono stati preparati seguente procedura A (Sintesi e caratterizzazione di liposomi PDA). 1. Sintesi di N-idrossisuccinimmide Diacteylene (NHS-PCDA) <ol><li> Per preparare liposomi, un ingrediente essenziale PCDA-NHS è necessaria. Abbiamo sintetizzato PCDA-NHS utilizzando la seguente procedura: </li><li> Aggiungere acido 10,12-pentacosadiynoic (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-idrossisuccinimmide (0,0914 g, 0,786 mmol) e 1 - (3 - (dimetilammino) propil)-3-etilcarbodiimmide cloridrato (0,144 g, 0,713 mmol ) in secco CH 2 Cl 2 (20 ml). </li><li> Agitare la soluzione a temperatura ambiente per 2 h. </li><li> Rimuovere con cautela il solvente utilizzando revaporatore Rotary per produrre un film secco sottile. </li><li> Utilizzare imbuto separatore per estrarre il residuo con etere etilico (25 ml) e acqua (25 ml) tre volte. </li><li> Asciugare lo strato organico con MgSO 4 (1,0 g) per mezz&#39;ora. Filtrare e rimuovere il solvente mediante evaporazione a rotazione per ottenere una polvere bianca solido (0,24 g,&gt; 90%). </li><li> Analizzare composto finale in Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). </li><li> 1 H NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H). </li></ol> 2. Preparazione liposomiale 5,6,7 <ol><li> Sciogliere PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) :: 8: 1: 1 in 20 ml di diclorometano. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro di carta per rimuovere aggregati. </li><li> Evaporare completamente il solvente per produrre un film sottile di monomeri. </li><li> Asciugare il film sottile durante la notte in vacUum. </li><li> Idratare la pellicola con acqua deionizzata (50 ml) per ottenere una soluzione di liposomi concentrazione desiderata (0,65-1 mM). </li><li> Sonicare la sospensione risultante con un sonicatore sonda a 76 ° C per ~ 18 min. </li><li> Attentamente filtrare la soluzione attraverso un filtro di carta per rimuovere gli aggregati lipidici </li><li> Raffreddare la soluzione a 4 ° C per una notte a promuovere l&#39;auto-assemblaggio dei monomeri. La soluzione finale dovrebbe essere otticamente trasparente. </li><li> Polimerizzare i monomeri autoassemblati diacetylene (liposomi) mediante irradiazione con 254 nm di radiazione UV per ~ 2 min utilizzando una sorgente di raggi UV Pen (4,5 mW / cm 2) in aria. </li><li> La soluzione di liposomi è stabile a temperatura ambiente per almeno due settimane. La soluzione era più stabile quando refrigerato. </li></ol> B. Preparazione di rodamina-etichetta albumina sierica bovina (BSA-Rh) liposomi modificati PCDA 1. Legame di BSA-Rh alla superficie del liposoma <ol><li> Sciogliere BSA-Rh in PBS buffer (concentrazione ionica era 0.01M, pH 7,2) per rendere la concentrazione finale di 1,2 pM di BSA-rodamina soluzione. </li><li> Aggiungere 2 ml (1,2 pM) di BSA-rodamina a 10 ml di soluzione di liposomi preparati nel passo A.2. (Vedi sopra) a temperatura ambiente. </li><li> Classica reazione per il legame di gruppi amminici della lisina residui di proteine ​​acido carbossilico attivato da NHS gruppo è stato seguito (schema di reazione in Figura 2). NHS-PCDA è stato progettato (Figura 2, punto 1) per covalentemente molecole di legame con le proteine ​​liposomi con NHS-ammine reazioni (Figura 2, punto 2). NHS è un ottimo agente lasciando che guida l&#39;ammina-acido carbossilico reazione in avanti. La resa di questa reazione in condizioni appropriate devono essere quantitative. </li><li> Rimozione di libero BSA-Rh: Immergere un Spectra / Por Biotech Cellulosa Ester (CE) membrana (MW C O: 100.000) in acqua deionizzata water per 15 min. Questa membrana viene utilizzata per dialisi di non reagito BSA-rodammina (Molecular peso ~ 66.000 Da) in acqua deionizzata. </li><li> Trasferire accuratamente la soluzione per la membrana di dialisi. </li><li> Cambiare l&#39;acqua a 2 ore, 8 ore, 14 ore, 24 ore, e 36 ore durante la dialisi. </li><li> Raccogliere la soluzione finale in un flaconcino coperto con un foglio di alluminio. </li></ol> C. Preparazione di SR-diammina e biotina-tag Liposomi 1. Invece di utilizzare DMPC nel passo 2.1, useremo biotina-etichettato-(1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-phosphoethanolamine-N-(Biotinyl) (biotina-DOPE). <ol><li> Seguire tutti i passi da 2.2 a 2,9. </li><li> Invece di BSA-Rh nel passaggio B, utilizzare Diamine Sulphorhodamine tag (SR-diammina). </li><li> Seguire tutte le ulteriori iniziative in B. </li><li> I liposomi di questa preparazione conteneva biotina e SR-diammina sulle loro superfici. I passi successivi sono simili a A e B (vedi sopra) con una sola eccezione: streptavidina è stato aggiunto alla soluzione moltosulla indagare biotina-streptavidina interazioni attraverso cambiamenti nel FRET efficienza. </li></ol> D. Rappresentante Risultati <img alt="Titolo Figura" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Figura titolo. Un cartone spiegare la reazione e FRET processo si verificano in superficie del liposoma (preparata seguendo passo B). A. Controllo dei attaccamento proteina di liposomi mediante FRET 1 Controllo di FRET tra rodamina e liposomi PDA preparati al punto B. Spettri di eccitazione e di emissione di BSA-Rh e spettro di assorbimento del PDA sono prese (Figura 3A). Si può vedere chiaramente che lo spettro di emissione di BSA-Rh sovrappone con lo spettro di assorbimento del PDA. Questo soddisfa il requisito di risonanza per il meccanismo di FRET. BSA-Rodamina liposomi tag prima e dopo la polimerizzazione sono stati analizzati con UV-Vè e spettroscopia di fluorescenza. Per il donatore e accettore isolato, l&#39;efficienza di FRET dipende fortemente donatore-accettore distanza (r) e J 1 (j-value). La tempra in dell&#39;emissione si osserva (Figura 3B) a causa di FRET tra rodamina e PDA a causa della comparsa di spettro di assorbimento elettronica di PDA blu dopo fotopolimerizzazione. Nel nostro caso, l&#39;efficienza FRET è zero per liposomi non polimerizzato e rodamina perché J = 0 per liposomi non polimerizzato nella regione del visibile. Abbiamo eseguito esperimenti simili con solo liposomi PDA che non contenevano NHS sulla loro superficie. In questi casi, BSA-Rh non è stato etichettato alla superficie dei liposomi. In tal caso, la distanza media tra rodamina e PDA (r media) era molto maggiore del raggio Forster (R 0 = 2,8 nm). Quindi, non abbiamo osservato una forte diminuzione l&#39;intensità di fluorescenza. Questa osservazione unaLSO suggerisce che l&#39;estinzione della fluorescenza è dominante quando r &lt;2.8 nm. J e R 0 valori sono stati calcolati usando le formule seguenti: [1] J (λ) = ∫ D F (λ) A ε (λ) dλ λ 4 R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6 Il coefficiente di estinzione (ε) di blu-PDA è nell&#39;intervallo 2000-10000 ~ M -1 cm -1 prima dell&#39;aggiunta di streptavidina. Il coefficiente di estinzione del blu-PDA dipende dal foto-polimerizzazione condizione. [2] Ad esempio, i valori ε sarà maggiore di una soluzione che è stata polimerizzata un tempo più lungo. Inoltre, l&#39;auto-assemblaggio dei monomeri diacetylene possono influenzare i valori ε. La J calculzioni tener conto di questi cambiamenti, e riflettono i cambiamenti nei coefficienti di estinzione a causa di PDA biotina-streptavidina interazioni molecolari. valori di J sono calcolati utilizzando l&#39;assorbimento sperimentale PDA e SR-101 dati sulle emissioni. I cambiamenti nei valori J sono dovute a spostare nello spettro di assorbimento elettronica del PDA dopo l&#39;aggiunta della soluzione di streptavidina (Figura 4C). L&#39;unità di valori di J è M -1 cm -1 nm 4. B. Monitoraggio di FRET con aggiunta di streptavidina-biotina al etichettato soluzione liposomi Nota 1: Controllo di FRET tra rodamina e liposomi PDA preparati al punto C sopra. Spettri di eccitazione e di emissione di Sulphorhodamine-etichettato diammina (SR-diammina) e spettro di assorbimento del PDA sono prese (Figura 4A). Liposomi non polimerizzato e polimerizzato biotina contrassegnati sono stati analizzati utilizzando UV-Vise spettroscopia di fluorescenza. L&#39;emissione di rodamina (SR-101) è diminuita di circa il 45% dopo la polimerizzazione (Figura 4B) suggerendo quenching emissione causa FRET. Aggiungere 40 aliquote da 1 ml (pM) di soluzione di streptavidina a 2 ml di soluzione di liposomi. Con l&#39;aggiunta di streptavidina alla soluzione, cambiamenti di valore J è osservato (Figura 4C). Come biotina si lega alla streptavidina, l&#39;intensità del picco di blu PDA liposoma (~ centrato a 645 nm in figura 1) è diminuita, mentre un aumento del picco di assorbimento a 540 nm è osservato (F IGURA 1S). Figura 4D mostra cambiamenti del FRET efficienza. Il FRET efficienza è diminuita con l&#39;aumento della concentrazione di streptavidina è inoltre coerente con la nostra previsione. Registrare l&#39;emissione SR dopo ogni aggiunta un&#39;aliquota 40 microlitri di streptavidina. Abbiamo osservato un costante aumento delle emissioni rodamina dopo l&#39;aggiunta di streptavidina (Figura 5). Questo aumento di emissioni rodamina è dovuto ad una diminuzione del valore di J per lo spettro di emissione Sulphorhodamine e spettro di assorbimento PDA seguendo biotina-streptavidina interazioni. A livello molecolare, biotina-streptavidina interazioni portare a sottili cambiamenti nella lunghezza effettiva coniugazione del PDA che si traduce in una diminuzione del blu-PDA forma ad una più termodinamicamente stabile red-PDA modulo 2. Questa è la base delle variazioni dei valori J. È interessante notare che le sottili differenze nelle interazioni molecolari per covalentemente o non covalentemente biotina legato al liposoma PDA possono essere esaminati utilizzando il nostro test di rilevazione 4. Abbiamo anche eseguito esperimenti di controllo sono monitorati e l&#39;emissione dei campioni di controllo nelle stesse condizioni sperimentali, come quelli per streptavidina-biotina sistema. Gli esperimenti di controllo sono costituiti da: (1) Liposomi soluzioni che contenevano biotina sulla lorosuperficie sono stati aggiunti soluzione tampone stesso volume e concentrazione, e (2) soluzione di liposomi senza biotina recettori sulla loro superficie sono stati aggiunti di streptavidina stesso volume e concentrazione. L&#39;intensità della biotina-etichettato soluzione liposomi dopo l&#39;aggiunta di streptavidina mostrato intensità maggiore, ma l&#39;intensità della soluzione liposoma degli esperimenti di controllo (per esempio, vedere Figura 2S), invece, mostra una diminuita in intensità di emissione. Ciò è attribuito alla diluizione della soluzione. Questi esperimenti indicano chiaramente che l&#39;emissione maggiore della soluzione era dovuto a specifiche interazioni molecolari. Raggio di Forster (R 0) per la coppia rodamina e PDA si calcola (Eq.2) di essere ~ 2.80 nm. Ciò significa che per isolati PDA-rodammina coppie, il 50% delle molecole eccitate rodammina statali avranno la loro energia trasferita al PDA quando r è 2,80 nm. Abbiamo obs<html> erved che quando biotina è covalentemente attaccata alla spina dorsale PDA, l&#39;aumento di emissione era 2-3 volte maggiore di quella dei non-covalentemente legato alla biotina liposomi. 4 Questi risultati suggeriscono che il nostro sistema proposto è sensibile a distinguere le sottili differenze nelle interazioni al trasduttore (linker tra biotina e bilayer liposomiale) dovuta ai recettori legati covalentemente e non covalente a liposomi. Seconda funzionalità di acquisizione dei dati di scansione e del, spettrofotometro monitoraggio in tempo reale (in millisecondi in scala seconda volta) di interazioni proteina (nella spettroscopia UV-Vis) sono possibili con questo sistema di rilevamento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Figura 1. Spettri di assorbimento di soluzioni PDA blu e rosso. (Interno) al microscopio ottico scattate con una fotocamera digitale. g &quot;/&gt; Figura 2. Schema di reazione per la sintesi PCDA-NHS (passo 1). Reazione di PCDA-NHS al sostituente amminico delle proteine ​​(step 2). Fase 2 è la base del legame di residuo di lisina delle proteine ​​ad acido carbossilico di PCDA monomero. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire figura</a> . <img alt="Figura 3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> Figura 3A. VARIAZIONE osservata FRET efficienza è dovuta ai cambiamenti nello spettro di assorbimento del PDA. Prima di polimerizzazione non vi è alcuna sovrapposizione tra BSA-Rh di emissione e di assorbimento PDA ma dopo sovrapposizioni di assorbimento di polimerizzazione PDA con BSA-Rh di emissione, che è il requisito di FRET. Rodamina è un donatore (rosso) e liposomi polimerizzati PDA agire come accettore (blu). <img alt="Figura 3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Figura3B. Spettri di fluorescenza di BSA-Rh liposomi etichetta prima (blu) e dopo PCDA polimerizzazione (rosso). Una forte diminuzione delle emissioni rodamina è stato osservato a causa di FRET tra rodamina e PDA. <img alt="Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> .. Figura 4A sovrapposizione spettrale (J) per cambiare PDA (blu o rosso) spettro di assorbimento e spettro di emissione Sulphorhodamine (arancione) Figura 4A è lo spettro rappresentativo per condizioni estreme, cioè quando un eccesso di streptavidina è stato aggiunto alla soluzione. La figura 4A mostra una quasi completa blu-rosso trasformazione PDA dopo l&#39;aggiunta di un eccesso di streptavidina. Si vede chiaramente che J (sovrapposizione spettrale) aumenta con blu-shift dello spettro di assorbimento PDA <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> Figura 4B. Spettri di fluorescenza prima (blu) e dopo (red) polimerizzazione liposoma. <img alt="Figura 4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> Figura 4C Condizione per FRET:. Cambiamento J tra donatore (Sulphorhodamine) e accettore (PDA) con l&#39;aggiunta streptavidina alla soluzione di liposomi. <img alt="Figura 4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> Figura 4D. FRET cambiamento efficienza tra il donatore (Sulphorhodamine) e accettore (PDA) con l&#39;aggiunta streptavidina alla soluzione liposoma. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Figura 5. Spettro di emissione Rhodamine dopo l&#39;aggiunta di aliquote streptavidina alla soluzione PDA liposoma. Inset mostra una vista più ampia di variazioni delle emissioni nel SR-101 spettri.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo effettuato legame selettivo di residuo di lisina della proteina sulla superficie del liposoma con NHS-ammina reazione. Questo metodo basato FRET è capace di fare monitoraggio in tempo reale di biotina-streptavidina vincolanti e proteine ​​(BSA) di legame alla superficie del liposoma. Analoga procedura può essere applicata per studiare la dinamica di legame di proteina diversi con i loro recettori selettivi. C&#39;è flessibilità nella scelta fluorofori che forniranno cambiamenti nei valori J seco...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic acido (PCDA) </td><td> GFS sostanze chimiche </td><td> 3261 </td><td> Sensibile alla luce </td></tr><tr><td> N-idrossisuccinimmide (NHS) </td><td> Acros organici </td><td> 157270250 </td><td> Umidità sensibile </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimetilammino) propil)-3-etilcarbodiimmide cloridrato (EDC) </td><td> Chem-Impex International </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina-tagged Ser Bovinium Albumina (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-phosphoethanolamine-N-(Biotinyl) (biotina-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

FRET è un processo in cui l&#39;energia non è radiativamente trasferita da una molecola donatrice eccitato ad un stato fondamentale molecola accettore a lungo raggio attraverso interazioni dipolo-dipolo 1. Nel saggio di rilevamento presente, utilizziamo una proprietà interessante di PDA: blu-shift in UV-Vis spettro di assorbimento elettronica PDA (figura 1) dopo un analita interagisce con i recettori collegati al PDA 2,3,4,7. Questo spostamento nello spettro di assorbimento PDA fornisce cambiamenti nelle sovrapposizione spettrale (J) tra PDA (accettore) e rodamina (donatore) che porta a variazioni del FRET efficienza. Pertanto, le interazioni tra analita (ligando) e recettori vengono rilevati tramite FRET tra fluorofori donatori e PDA. In particolare, ci mostra il rilevamento di un modello di streptavidina molecola proteica. Abbiamo inoltre dimostrato il legame covalente-di albumina di siero bovino (BSA) alla superficie del liposoma con FRET meccanismo. Queste interazioni tra tegli liposomi bistrato e molecole proteiche possono essere rilevati in tempo reale. Il metodo proposto è un metodo generale per il rilevamento chimico piccole e grandi molecole biochimiche. Poiché fluorescenza è intrinsecamente più sensibile colorimetria, il limite di rilevazione del test può essere in sub-nanomolare gamma o inferiore 8. Inoltre, PDA può agire come accettore universale FRET, il che significa che più sensori possono essere sviluppati con PDA (accettore) funzionalizzato con donatori e recettori diversi attribuiti sulla superficie dei liposomi PDA.

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Dimostriamo FRET tra polydiacetylene polimero coniugato (PDA) e fluoroforo attaccato alla superficie dei liposomi mobile per il rilevamento di biomolecole. Liposomi PDA conteneva anche molecole recettoriali sulle loro superfici di biomolecole da utilizzare come sonde. Interazioni ligando-recettore portare a cambiamenti nella FRET efficienza tra il fluoroforo e PDA che è alla base del meccanismo di rilevamento.

Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

real-time-monitoring-ligand-receptor-interactions-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Views.  Southern Illinois University. Dimostriamo FRET tra polydiacetylene polimero coniugato (PDA) e fluoroforo attaccato alla superficie dei liposomi mobile per il rilevamento di biomolecole. Liposomi PDA conteneva anche molecole recettoriali sulle loro superfici di biomolecole da utilizzare come sonde. Interazioni ligando-recettore portare a cambiamenti nella FRET efficienza tra il fluoroforo e PDA che è alla base del meccanismo di rilevamento.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Ricerca

Biologia

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Autonomamente bioluminescenti cellule di mammifero per la continua e monitoraggio in tempo reale di citotossicità

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Rilevazione di intracellulare genica in cellule vive di murini, umana e suina origine utilizzando nanoparticelle di fluorescenza marcata

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoraggio in tempo reale dell'attivazione dell'aurora chinasi A utilizzando biosensori FRET conformazionali in cellule vive

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...