Qui, abbiamo usato FRET a singola molecola e marcatura proteica sito-specifica tramite un'incorporazione naturale di amminoacidi per studiare la dinamica conformazionale di mGluR2. Questo permette di studiare la dinamica delle proteine senza perturbare la struttura proteica. La struttura atomica fornisce un'immagine statica di una proteina.
Tuttavia, la FRET a singola molecola ci consente di visualizzare l'intera gamma di movimento delle proteine in tempo reale e in soluzione. Questo metodo può essere applicato per studiare la dinamica di qualsiasi proteina. Inoltre, un'incorporazione naturale di aminoacidi può essere utilizzata per studiare le interazioni proteina-proteina e l'ingegneria dei recettori sintetici.
Il caricamento dei campioni e l'ottimizzazione dell'imaging richiedono pazienza e pratica. Per iniziare, segnare i fori da praticare sul vetrino con un pennarello. Utilizzare un Dremel per praticare piccoli fori sulla diapositiva mentre il vetrino è immerso nell'acqua.
Sonicare i vetrini e coprire le scivolate in acetone per 30 minuti in un sonicatore da bagno a 23 gradi Celsius. Smaltire l'acetone dal vetrino e coprire i barattoli. Risciacquare abbondantemente con acqua e sonicare in idrossido di potassio a cinque molari per 30 minuti.
Quindi, sciacquare i vetrini e coprire lo scivolo con acqua e sonicare in metanolo per due minuti. Lasciare i vasetti pieni di metanolo fino alla fase di salinizzazione dell'ammino. Versare la miscela di amminosalinizzazione appena preparata nel vetrino e coprire i barattoli.
Incubare, sonicare e nuovamente incubare i vetrini e i vetrini di copertura in una miscela di amminosalinizzazione prima di scartare la soluzione. Quindi, lavare i barattoli con metanolo prima di riempirli d'acqua. Quindi sciacquare i vetrini con acqua.
Asciugarli con un colpo d'aria e posizionarli nelle scatole di assemblaggio. Applicare 60 millilitri di soluzione di PEGylation sul vetrino e posizionare un vetrino di copertura sopra di esso. Contrassegnare il lato non PEGilato prima di riporlo.
Dopo l'incubazione, smontare delicatamente e sciacquare i vetrini e coprire gli slip con acqua. Quindi asciugarli soffiando aria e metterli in un tubo sterile da 50 millilitri con la superficie PEGilata rivolta l'una verso l'altra. Dopo aver passato le cellule HEK 293T con 0,05% tripsina-EDTA, seminare le cellule su poli-L / D-lisina vetrini di copertura.
Posizionare i terreni standard con AZP integrato per le cellule in crescita e il recettore metabotropico del glutammato 2 o l'espressione di mGluR2. Quindi trasfettare le cellule con un reagente di trasfezione e incubare per 24 ore prima di cambiare il terreno con nuovi mezzi integrati con AZP. 20 minuti prima dell'etichettatura con coloranti alchinicianici, lavare due volte i vetrini di copertina con Recording Buffer caldo, o RB, e metterli in un supporto standard caldo senza AZP.
Quindi rimuovere il supporto standard e lavare le celle con RB prima di aggiungere la soluzione di etichettatura appena preparata. Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di etichettatura.
Lavare due volte con il RB il vetrino contenente le cellule trasfettate e risospendere nello stesso mezzo. Quindi, pellettare le cellule ruotando a 1.000 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti e rimuovere il surnatante prima di sospendere nuovamente il pellet in 80-130 microlitri della soluzione di lisi. Rompere il pellet mediante pipettaggio.
Quindi avvolgerlo in un foglio e posizionarlo sul bilanciere a quattro gradi Celsius per 30 minuti a un'ora per lisare le cellule. Pellettare la frazione insolubile mediante centrifugazione a 20.000 g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Quindi trasferire il surnatante in un tubo freddo fresco e conservarlo sul ghiaccio.
Rimuovere il vetrino e il coperchio dal congelatore e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente al buio. Assemblare la camera inserendo le strisce di nastro biadesivo tra la slitta e la slitta di copertura, assicurandosi che le superfici PEGilate formino l'interno della camera di flusso. Utilizzando una punta per pipetta, premere il vetrino di copertina per assicurarsi che il nastro entri in contatto con il vetrino e lo scorrimento.
Applicare resina epossidica ai bordi della diapositiva. Applicare 40 microlitri di NeutrAvidin da 500 nanomolari su ciascuna corsia e incubare all'interno di una scatola scura umidificata. Dopo due minuti, lavare ogni corsia della camera con 100 microlitri di tampone T50.
Quindi aggiungere 20 soluzioni di anticorpi biotinilati nanomolari e incubare per 30 minuti prima di lavare con 200 microlitri di tampone T50 per corsia. Accendere il computer e il microscopio. Quindi accendere i laser per riscaldarsi.
Quindi, accendi la videocamera EMCCD e apri il software. Montare la camera del campione sullo stadio del microscopio e aggiungere gradualmente il campione proteico per ottenere circa 400 molecole per campo visivo. Lavare la camera con 100 microlitri di tampone di imaging integrato con 0,3 unità di protocatechuate 3, 4-diossigenasi.
Regolare il guadagno, la velocità di acquisizione e le potenze del laser per rilevare segnali di fluorescenza a singola molecola sia nel canale donatore che in quello di accettazione. Quindi eccitare il donatore e acquisire tracce temporali fino a quando l'80% delle molecole del donatore nel campo visivo sono fotosbiancate. Alla fine del film, accendi il laser a 640 nanometri per eccitare direttamente l'accettore fino a quando alcune delle molecole non vengono fotosbiancate.
Modificare il campo visivo e ripetere i passaggi per l'eccitazione del donatore e dell'accettatore per raccogliere tre filmati per condizione. Per selezionare tracce FRET a singola molecola di prelievo di particelle, selezionare le tracce in cui l'intensità totale delle tracce del donatore e dell'accettore è stabile nel tempo. Quindi selezionare le tracce con cambiamenti anti-correlati nelle intensità del donatore e dell'accettore.
Selezionare le molecole donatrici e accettanti che mostrano il fotosbiancamento in un'unica fase e tracce lunghe più di cinque secondi. Calcola la carenza di FRET. Infine, identificare lo stato conformazionale mediante Hidden Markov Modeling, o HMM, seguendo i passaggi descritti nel manoscritto.
La marcatura di AZP mediante coloranti di cianina è stata ottenuta mediante una reazione di cicloaddizione catalizzata dal rame e ha portato a un'efficace marcatura della membrana plasmatica di 548UAA con la popolazione di superficie cellulare marcata con fluorofori donatori e accettori. Nell'elettroforesi SDS-PAGE, è stata osservata una singola banda a 250 kilodalton nelle cellule HEK 293T che esprimono 548UAA, che ha coinciso con il dimerico a lunghezza intera mGluR2. Qui sono mostrate tracce selettive rappresentative per più eventi di sbiancamento di breve durata e di lunga durata per donatori e accettanti.
Gli stati conformazionali sono stati identificati utilizzando l'analisi HMM. Le transizioni tra stati FRET discreti sono state estratte dagli adattamenti idealizzati e tracciate come una mappa di calore della densità di transizione. Le tracce FRET idealizzate forniscono anche informazioni sul tempo di permanenza per ogni conferma identificata.
Le tracce della singola molecola con il canale donatore e accettore sono mostrate qui. Inoltre, la singola molecola FRET rivela quattro stati conformazionali del dominio ricco di cisteina mGluR2. Un'efficiente conservazione del picco è essenziale per il pull-down di singole molecole e occorre prestare attenzione durante questo processo.
Inoltre, l'agente di evacuazione dell'ossigeno deve essere aggiunto immediatamente prima dell'imaging. Questo metodo di etichettatura e gli esperimenti FRET a singola molecola sono stati applicati a più recettori e hanno fornito nuove informazioni sul meccanismo di attivazione dei recettori e sulla modulazione della funzione dei recettori.
