Seguendo questo protocollo, l'utente sarà in grado di produrre vettori AAV ad alta purezza e resa adatti ad applicazioni in vitro o in vivo. Questo protocollo può essere utilizzato per produrre e purificare una gamma di sierotipi AAV con differenze nelle configurazioni. La combinazione di questi due elementi può essere utile per ottenere il tipo di cellula e l'espressione specifica del tessuto.
La produzione di alcuni sierotipi può dare a una resa inferiore. Questa è la produzione in cui ci sono sierotipi stretti e dovrebbe essere valutata su base individuale. A dimostrare queste procedure sarà Shelly Fripont, un tecnico del nostro laboratorio.
Dopo aver fatto crescere le cellule HEK, mescolare 360 microgrammi di plasmide aiutante, 180 microgrammi di plasmide che codificano il capsid vettoriale e 180 microgrammi di plasmide contenente il transgene in 18 millilitri di cloruro di sodio millimolare per preparare il mix di DNA. Distribuire questa miscela su tre tubi conici da 50 millilitri. In un nuovo tubo conico, mescolare 840 microgrammi di PEI e sei millilitri di cloruro di sodio millimolare per preparare il mix PEI per sei piatti di coltura cellulare.
Quindi, aggiungere sei millilitri del mix PEI, goccia a goccia, a uno dei tubi conici contenenti il mix di DNA. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi, rimuovere sei piatti di coltura cellulare dall'incubatrice.
In un cappuccio a flusso laminare, aspirare completamente il mezzo da ogni piatto. Risciacquare i piatti con cinque millilitri di DPBS pre-riscaldato per rimuovere le tracce del mezzo. Inclinare delicatamente ogni piatto per garantire che DPBS sia distribuito uniformemente su tutta la superficie.
Quindi, aspirare delicatamente il DPBS. Aggiungere lentamente 12 millilitri di DMEM a ogni piatto, con una pipetta posta sul bordo del piatto. Mescolare la miscela PEI e DNA pipettando su e giù da tre a cinque volte.
Aggiungere due millilitri di questa miscela a ciascuno dei sei piatti di coltura cellulare in modo drop by drop, assicurandosi di distribuirlo con cura su tutta la superficie. Ripeti questo processo usando sei piatti di coltura cellulare alla volta fino a raggiungere 18 piatti di coltura cellulare. Agitare delicatamente i piatti di coltura cellulare per distribuire la miscela di DNA PEI.
Incubare le cellule trasfette a 37 gradi Celsius con il 95% di umidità e il 5% di anidride carbonica per cinque ore. Successivamente, aggiungere altri 12 millilitri di DMEM 10 a ciascuno dei 18 piatti senza rimuovere il mezzo preesistente. Continuare a incubare le cellule trasfette nelle stesse condizioni.
A 72 ore dopo la trasfezione, utilizzare un raschietto cellulare per staccare accuratamente le cellule da ogni piatto di coltura. Raccogliere il mezzo e le cellule di due piatti di coltura in un tubo conico da 15 millilitri, tenuto sul ghiaccio. Centrifugare i tubi a 420 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti con l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga impostate al massimo.
Scartare con cura il supernatante da ogni tubo versandolo delicatamente in un contenitore per lo smaltimento dei rifiuti. Quindi, posizionare i tubi contenenti i pellet cellulari sul ghiaccio. Sospendiamo ogni pellet in due millilitri di tampone di lisi e mescoliamo tubazione su e giù da cinque a 10 volte.
Estrarre l'AAV da tre tubi, insieme. Per iniziare, congelare le cellule ri-sospese posizionandole in un secchio contenente ghiaccio secco mescolato con etanolo. Quindi scongelare le cellule posizionandole immediatamente in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius.
Ripetere questo ciclo di congelamento e scongelamento tre volte per liscire le cellule e rilasciare le particelle AAV. Dopo la terza fase di scongelamento, centrifugare a 1167 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire con cura i supernatanti per pulire tubi conici da 50 millilitri.
Aggiungere nucleasi a ciascun tubo ad una concentrazione finale di 50 unità per millilitro di supernatante. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, mentre ruotare i tubi ogni 10 minuti per assicurarsi che la nucleasi sia accuratamente mescolata con il supernatante. Centrifuga a 13490 volte G e a quattro gradi Celsius per 20 minuti per chiarire il supernatante.
Successivamente, rimuovere lo stantuffo di una siringa da 10 millilitri, attaccare un filtro da 0,45 micrometri alla siringa e posizionarlo sopra un tubo conico pulito da 50 millilitri. Riempire con cura la siringa con il supernatante chiarificato. Utilizzare lo stantuffo per forzare il lisciviazione attraverso il filtro.
Successivamente, preparare ciascuna delle frazioni di iodixanolo in quattro tubi conici separati da 50 millilitri, come indicato nella tabella uno del protocollo di testo. Pipetta otto millilitri del 15% di iodixanolo in ciascuno dei tre tubi ultracentrifugo. Pipetta 5,5 millilitri di iodixanolo al 25% in un tubo conico pulito da 50 millilitri.
Utilizzando una pipetta Pasteur non graduata, stratalizza con cura 5,5 millilitri di soluzione di iodixanolo al 25% al di sotto della soluzione di iodixanolo al 15%. Aggiungere le soluzioni del 40% e del 60% come descritto nel protocollo di testo. Le frazioni di iodixanolo non devono intermix sulla stratificazione.
Utilizzando una pipetta Pasteur, sovrapporre il lisato grezzo sopra il gradiente di iodixanolo del 15%, goccia a goccia, per evitare di disturbare l'interfaccia tra il lisato grezzo e la soluzione di iodixanolo. Riempire ogni tubo di ultracentrifugazione con tampone di lisi fino a quando il menisco raggiunge la base del collo del tubo, per assicurarsi che il tubo non collassi sotto le forze molto elevate generate durante l'ultracentrifugazione. Chiudere i tubi utilizzando coperchi appropriati.
Utilizzando una bilancia digitale, assicurati che tutti e tre i tubi di ultracentrifugazione abbiano lo stesso peso. Regolazione del peso in base alle esigenze, aggiungendo più tampone dilisi sopra il llysato grezzo. Utilizzare un rotore in titanio ad angolo fisso per centrifugare i tubi a 301580 volte G e a 12 gradi Celsius per un'ora e 40 minuti utilizzando la massima accelerazione e decelerazione.
Quindi, attaccare un ago a una siringa da cinque millilitri. Rimuovere il distanziale dai tubi del rotore e recuperare i tubi dopo la centrifugazione. Aspirare solo la frazione iodixanolo al 40% che contiene le particelle vettoriali.
Elaborare il campione o memorizzarlo a quattro gradi Celsius. Qui, viene dimostrato un protocollo che può essere utilizzato per produrre vettori AAV con una varietà di capsidi, configurazioni del genoma, tipi di promotori e carichi transgeni. In questo esempio, abbiamo prodotto e purificato due diversi vettori AAV che hanno espresso la proteina fluorescente verde da un genoma auto-gratuito.
I due vettori si distinguono per diversi capsidi:PHPB e AAV9. Sono stati consegnati, tramite iniezione di vena della coda, in topi neri C57 adulti. Per valutare i livelli di espressione transgena tre settimane dopo l'iniezione, le sezioni sono macchiate di anticorpi primari contro la GFP con rilevamento utilizzando anticorpi secondari coniugati a un colorante fluorescente.
Le misurazioni dell'intensità della fluorescenza mostrano un aumento significativo dell'espressione GFP quando il vettore PHPB viene utilizzato rispetto all'AAV9. Aumenti della GFP sono stati osservati nel cerebro, nel cervelletto e nel tronco encefalico. La raccolta accurata del vettore contenente la frazione è fondamentale per questo protocollo.
Nel caso in cui ciò non avvenga correttamente, la resa vettoriale e la purezza vettoriale sono influenzate negativamente. Essendo in grado di produrre vettori AAV, piccoli laboratori saranno in grado di sfruttare numerose possibilità sperimentali per fornire geni nel sistema nervoso centrale. Questo protocollo richiede l'uso di un ultracentrifugo ed è importante ricevere una formazione adeguata prima di gestirlo al fine di evitare incidenti.
Inoltre, i vettori AAV sono spesso classificati come rischi biologici e, pertanto, è necessario consultare le normative locali prima di gestirli e gestirli.
