Questo protocollo per la produzione di vettori virali AAV è conveniente e produce AAV di elevata purezza, alto titolo, grado di ricerca per l'uso in modelli preclinici di grandi animali. Questa tecnica utilizza cellule HEK293 aderenti nelle camere di coltura cellulare, che è efficiente in termini di tempo e meno pratica, consentendo meno interruzioni alle cellule. Questo protocollo può essere di grande aiuto nella produzione di vettori virali per il campo della terapia genica e può anche essere utilizzato per la produzione di altri sierotipi AAV che legano anche il solfato di eparan.
Per iniziare, raccogliere le cellule HEK293 dalla coltura quando raggiunge l'80% di confluenza. Aspirare il fluido prima di lavare delicatamente la piastra di coltura cellulare con tre millilitri di PBS. Quindi aspirare PBS e aggiungere tre millilitri di tripsina.
Incubare le piastre per due minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, neutralizzare la tripsina, aggiungendo sette millilitri di DMEM completo alla piastra, e raccogliere il surnatante in tubi conici da 50 millilitri. Invertire delicatamente i tubi per garantire che le cellule siano omogenee.
Per determinare la densità cellulare, mescolare 10 microlitri dei campioni cellulari con 10 microlitri di tripano blu. E aggiungi la miscela a un vetrino di conteggio delle celle da analizzare nel contatore delle celle. Mescolare la sospensione cellulare con un litro di DMEM completo preriscaldato per vedere la camera di coltura.
Ruotare delicatamente la camera per distribuire le cellule in modo uniforme. Incubare la camera a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Oltre alla camera di coltura cellulare, le cellule di coltura da 10 a quarte cellule per centimetro quadrato in una piastra di 15 centimetri come riferimento per la confluenza.
Dopo 65 ore di incubazione, quando le cellule sono confluenti all'80-90%, aggiungere lentamente la miscela polietileneimina-DNA e DMEM nella porta della camera di coltura cellulare. Distribuire il liquido uniformemente su tutte le file prima di incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 72 ore. Dopo l'incubazione, agitare vigorosamente la camera di coltura cellulare per rimuovere le cellule fino a quando il mezzo appare torbido e versarlo in quattro o 500 tubi di centrifuga da 500 millilitri.
Pellet le celle per centrifugazione a 18.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Versare il surnatante chiarificato in una bottiglia di PETG da un litro e risospescere i pellet di cella in 50 millilitri di tampone autorizzato in tubi di centrifuga da 500 millilitri. Incubare i tubi per 60 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, centrifugare i tubi a 18.000 volte G per 30 minuti e trasferire il surnatante nella stessa bottiglia di PETG da un litro. Conservare a meno 80 gradi Celsius. Scongelare il lisato grezzo a quattro gradi Celsius durante la notte.
Una volta scongelato, filtrarlo utilizzando un filtro da 0,22 micron. Immediatamente prima delle fasi di purificazione, passivare il concentratore centrifugo aggiungendo quattro millilitri di tampone di pretrattamento del filtro per ogni colonna di eparina-sefarosio utilizzata. Posizionare il tubo in una pompa peristaltica.
Eseguire in sequenza le soluzioni e i supporti. Prepararsi per la cromatografia attaccando una colonna di eparina-sefarosio da cinque millilitri al tubo e facendo scorrere 25 millilitri di Bazell DMEM attraverso la colonna. Quindi caricare 0,2 micromolari del lisato grezzo filtrato sulla colonna ad una portata di una o due gocce al secondo.
Lavare la colonna in sequenza per eluire cinque millilitri cinque volte con 300 millimolari di cloruro di sodio HBSS, con magnesio e calcio, ed etichettare le cinque eluizioni come da E1 a E5. Quando è pronto, ruotare il concentratore centrifugo contenente il tampone di pretrattamento a 900 volte G per due minuti. Scartare il flusso attraverso. Lavare il filtro concentratore centrifugo con quattro millilitri di HBSS con magnesio e calcio ruotando a 1000 volte G per due minuti.
Quindi aggiungere l'eluizione E2 al concentratore centrifugo e ruotare a 1000 volte G per cinque minuti. Scartare il flusso attraverso. Allo stesso modo ruotare l'eluizione E3 nel concentratore centrifugo fino a quando il virus concentrato è di circa un millilitro.
Rimuovere il virus concentrato dal concentratore centrifugo utilizzando una punta filtrata P200 e raccoglierlo in un tubo centrifugo sterile da 1,5 millilitri. Dopo la raccolta del virus, sciacquare il concentratore centrifugo con 200 microlitri di HBSS con magnesio e calcio. Pipettare su e giù vigorosamente per 30 secondi per rimuovere qualsiasi virus aderente alla membrana e raccogliere il virus concentrato nello stesso tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.
Mescolare bene il tubo. Lavare la colonna e saturare con etanolo al 20% prima di conservarla a quattro gradi Celsius. Conservare il tubo della pompa in un idrossido di sodio molare.
L'efficienza di trasduzione del capside AAV6.2FF è stata confrontata in topi, criceti e agnelli per 28 giorni dopo la somministrazione intramuscolare. I topi hanno somministrato cinque volte 10 al 12 ° genoma vettoriale per chilogrammo di IgG umane AAV6.2FF, espresso tra 171 e 237 microgrammi per millilitro di IgG umane nel siero. Il criceto viene somministrato a due volte 10 al 13 ° genoma vettoriale per chilogrammo di IgG umane AAV6.2FF, espresso livelli molto più elevati di IgG umane rispetto ai topi.
Mentre il modello animale di grandi dimensioni è stato in grado di esprimere una media di 35 microgrammi per millilitro di livelli di IgG umane nel plasma. Grandi modelli animali possono determinare l'espressione del transgene AAV in vivo e determinare se i transgeni hanno un effetto terapeutico contro il disturbo o la malattia di interesse. Lo studio ha mostrato la grande capacità di trasduzione di AAV6.2FF, un nuovo vettore sierotipo AAV 6 nel muscolo scheletrico, nonché la bassa immunogenicità dei vettori virali AAV in vivo.
