Abbiamo migliorato il metodo RiboTag pubblicato in precedenza per ridurre significativamente lo sfondo. Ciò rende l'applicazione a modelli complessi come un sistema mutante più semplice dal punto di vista dell'analisi e molto meno costosa. Oltre alla generazione sperimentale di animali, il metodo RiboTag è considerevolmente più semplice e diretto di altri metodi per analizzare gli mRNA associati al ribosoma.
Come tutti gli esperimenti di RNA, le rigorose condizioni libere dalla RNasi sono fondamentali per il successo. Se hai un'esperienza limitata con l'RNA, controlla le tue condizioni eseguendo prima un'estrazione di RNA di base, quindi vai avanti. A dimostrare la procedura sarà Lauren Chukrallah, una studentessa laureata del mio laboratorio.
Per preparare il tampone di omogeneizzazione, aggiungere 2,5 millilitri di un tris molare a pH 7,4, cinque millilitri di un cloruro di potassio molare, 600 microlitri di un cloruro di magnesio molare e 500 microlitri di MP40 a un tubo da 50 millilitri. Aggiungere acqua trattata con pirocarbonato dietile al tubo per portare il volume a 50 millilitri e mescolare fino a quando tutti i componenti non sono incorporati. Per preparare tampone di lavaggio ad alto sale, aggiungere 2,5 millilitri di un tris molare a pH 7,4, 15 millilitri di un cloruro di potassio molare, 600 microlitri di un cloruro di magnesio molare e 500 microlitri di MP40 in un tubo da 50 millilitri.
Portarlo al volume di 50 millilitri in acqua trattata con pirocarbonato dietile e mescolare fino a quando tutti i componenti non sono incorporati. Pre-pesare tutti i tubi campione, registrare il peso e pre-raffreddare in azoto liquido. Mortaio sterile pre-raffreddato, pestello e spatola pesata sul ghiaccio secco.
Quindi, sul ghiaccio secco, utilizzare la malta sterile pre-raffreddata e il pestello per rompere i campioni di tessuto congelato flash in pezzi grandi e macinarlo lentamente in una polvere fine. Utilizzando la spatola pre-raffreddata, raschiare la polvere dalla malta in un tubo di raccolta pre-raffreddato facendo attenzione a tenere il ghiaccio secco quando possibile. Pesare il tubo con la polvere di tessuto.
Calcola la massa del tessuto sottraendo il peso iniziale del tubo dal peso del tubo con il campione in esso contenuto. Registrare questo valore per il calcolo successivo dei volumi del buffer di lysis. Preparare il tampone di lisi aggiungendo in 10 millilitri di ditiotriolo tampone di omogeneizzazione, inibitore della RNasi, cicloeximide, eparina e una compressa inibitore della proteasi.
Mescolare fino a quando tutti i componenti sono incorporati e tenere sul ghiaccio fino all'uso. Per ogni 100 milligrammi di campione, aggiungere un millilitro di tampone dilisi. Con la stessa pipetta utilizzata per aggiungere il tampone dilisi, pipettare con cura il risultante lysate su e giù per frammentare le cellule e mescolare.
Continuare la pipettazione per generalmente da 25 a 30 tratti fino a quando il campione non è più viscoso. Impostare i campioni sul ghiaccio per 10 minuti per la lyse. Quindi ruotare i campioni in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 10.000 volte g.
Un grande pellet torbido sciolto si forma nella parte inferiore del tubo. Facendo attenzione a non disturbare il pellet, raccogliere il lisato in un nuovo tubo e registrare il volume per ogni campione. Per evitare la degradazione del campione, assicurarsi che i campioni rimangano freschi per tutta la conservazione del protocollo rimanente sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius quando possibile.
Ora, calcola il volume richiesto di perline magnetiche accoppiate alla proteina legante anticorpale appropriata, la proteina G.Per un millilitro di lisato, usa 375 microlitri di perline proteiche G per raggiungere i 30 milligrammi per millilitro. Posizionare la soluzione di perline in un tubo da 1,7 millilitri su un rack a tubo magnetico. Rimuovere il solvente di perline e aggiungere un volume uguale di tampone di lysis fresco alle perline.
Su un rotatore del tubo da banco impostato su 20 giri/min a quattro gradi Celsius, ruotare il tubo cinque minuti per lavarlo. Posizionare il tubo sul rack del tubo magnetico e rimuovere il tampone di lavaggio. Dopo aver ripetuto il lavaggio altre due volte, aggiungere il tampone dilisi al volume originale per equilibrare le perline.
Conservare a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio fino all'uso. Aggiungere 50 microlitri delle perline equilibrate per ogni millilitro di lysate e ruotare a quattro gradi Celsius per un'ora. Quindi posizionare il tubo sul rack del magnete e raccogliere il lisato in un tubo fresco.
Scartare le perline usate. Al lysate, aggiungere 25 microlitri delle perline equilibrate per ogni millilitro e ruotare a quattro gradi Celsius per un'ora. Conservare le restanti perline G della proteina equilibrata a quattro gradi Celsius durante la notte.
Al mattino, posizionare il tubo sul rack del magnete e raccogliere il lisato in un tubo fresco. Scartare le perline usate. Dal lysate cancellato, conservare 50 microlitri come controllo di ingresso del campione.
Conservare a meno 80 gradi Celsius. Per ogni millilitro del lysato eliminato, aggiungere cinque microgrammi di anticorpo anti-HA. Per evitare la perdita del campione, sigillare il tappo del tubo con pellicola di laboratorio e ruotare i campioni da 16 a 18 ore a quattro gradi Celsius.
Per ogni millilitro del lysato sgombrato, aggiungere 300 microlitri di perline proteiche G. Rigillare il tappo del tubo con pellicola da laboratorio e ruotare per due ore a quattro gradi Celsius. Posizionare il tubo campione sul rack del magnete per consentire alle perline di separarsi dal lisato IPed.
Pipettare fuori dal lisato flow-through e scartare, mantenendo le perline. Aggiungere 800 microlitri di tampone di lavaggio ad alto sale alle perline. Posizionare il tubo su un rotatore per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Posizionare il tubo campione sul rack del magnete e lasciare che le perline si separino dal lavaggio. Rimuovere e scartare il lavaggio. Aggiungere altri 800 microlitri di tampone di lavaggio ad alto sale alle perline.
Chiudere il tubo e lasciare ruotare per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Posizionare il tubo campione sul rack del magnete e lasciare che le perline si separino dal lavaggio. Rimuovere e scartare il lavaggio.
Ripetere ancora una volta il lavaggio. Dopo il lavaggio, aggiungere 3,5 microlitri di 14,2 beta-mercaptoetanolo molare alle perline e mescolare con vortice per 15 secondi. Estrarre l'RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA commerciale secondo le istruzioni del produttore.
Elute il campione in 30 microlitri di acqua libera da RNasi. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius. In questo studio, pochissimo RNA è stato isolato dai campioni privi di Cre o Rpl22HA dimostrando l'efficacia di questo protocollo per ridurre lo sfondo IP e isolare gli RRNA ribosomiali con tag HA autentici.
Una serie di anticorpi nei protocolli di isolamento dell'RNA sono stati testati in campioni positivi Cre e Rpl22HA. Questi risultati dimostrano che la selezione dei reagenti può avere un impatto significativo sull'efficienza ip. È stata esaminata l'efficacia del sistema RiboTag per isolare l'RNA associato al ribosoma.
Sia per l'input di tipo selvatico che per i genotipi IP, la concentrazione di input era significativamente superiore alla concentrazione IP che indicava che c'era più RNA nel campione di input. Nei pool totali di RNA, i valori del numero di integrità dell'RNA dovrebbero essere vicini a 10 con un RIN più elevato correlato a una maggiore integrità e qualità del campione dedotto. Mentre i campioni IP avevano un RIN inferiore agli ingressi, i RIN erano ancora entro un intervallo accettabile e non dipendevano dal genotipo del campione.
Oltre ad allevare e mantenere le condizioni libere della RNasi, i ricercatori dovrebbero assicurarsi di raccogliere e conservare ogni campione suggerito. L'RNA di ingresso in particolare è fondamentale per più tipi di analisi a valle. Per il nostro laboratorio, generalmente eseguiamo il sequenziamento dell'RNA dopo l'immunoprecipitazione.
Questo ci consente di interrogare l'intera cupola di trascrizione per l'associazione ribosoma. Le alternative includerebbero l'analisi microarray o la RT-PCR quantitativa. Per noi, questo sistema ci permette di identificare i cambiamenti negli RNA associati al ribosoma con la mutazione di specifiche proteine leganti l'RNA.
