Gli autori ringraziano il Prof. Andrea Armani presso la University of Southern California per il supporto durante il periodo è stato sviluppato questo protocollo. I finanziamenti per lo sviluppo iniziale di questo lavoro è stato fornito dal National Science Foundation [085281 e 1028440] e il National Institute of Health tramite il programma New Innovator Award direttore del NIH [1DP2OD007391-01]. Ulteriori informazioni sono disponibili presso <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ hunthk ~ /</a> .

1. Fondo La biotina è attaccata alla superficie di questi dispositivi tramite un semplice processo in tre fasi (Figura 1). Per prima cosa, pulire la superficie e popolarlo con gruppi ossidrilici esponendo i dispositivi a uno plasma di ossigeno o di una soluzione piranha. In secondo luogo, usiamo deposizione di vapore per collegare l&#39;agente di accoppiamento di silano terminati con un&#39;ammina primaria ai gruppi ossidrilici mediante idrolisi e reazione di condensazione. In terzo luogo, ci attacchiamo biotina in superficie attraverso N-idrossisuccinimide (NHS) chimica estere. Noi indirizzare il lettore interessato al nostro lavoro precedente per ulteriori informazioni sullo sviluppo di queste tecniche, così come una spiegazione della nostra motivazione per la scelta di queste tecniche. 8 Il successo di queste reazioni può essere valutata mediante microscopia ottica e fluorescenza dopo l&#39;aggiunta di ammina primaria, così come dopo l&#39;aggiunta della biotina. Mentre m otticaicroscopy può essere utilizzato per determinare se i protocolli superficie funzionalizzazione provoca un danno alla superficie microsfere, o contaminazione, la microscopia a fluorescenza viene utilizzato per verificare la qualità ed uniformità di copertura della superficie della molecola biotina, come pure la capacità della biotina sulla la superficie di legarsi con (strept) avidina. Per valutare la copertura di ammine sulla superficie, abbiamo usato isotiocianato di fluoresceina (FITC) colorante fluorescente, che reagisce con ammine primarie per formare stabile, legame covalente tiourea al microsfere. Texas Red colorante fluorescente che è stato coniugato ad avidina viene utilizzato per etichettare i gruppi biotina sulla superficie attraverso l&#39;interazione biotina-avidina. In entrambi i casi, sono stati scelti coloranti che possono interagire (attraverso sia recettore-ligando interazioni o legame covalente) con i gruppi funzionali sulla superficie. Qui, l&#39;agente di accoppiamento silanico, che ha tre gruppi uscenti e un gruppo funzionale, fornisce la scommessa ponteWeen la superficie inorganica e sonda molecola organica. La funzionalità ammina primaria reagisce quantitativamente con gli esteri NHS di formare legami ammidici stabili. In questo caso, si utilizza una molecola sonda biotina cui catena laterale valerico è stato modificato con un gruppo estere NHS. Realisticamente, qualsiasi molecola sonda alla quale un gruppo estere NHS può essere aggiunto alla superficie mediante i seguenti protocolli. Inoltre, questi protocolli sono generale, e può essere utilizzato per funzionalizzare qualsiasi superficie periferica silice con biotina. Il problema principale con questi protocolli non è effettivamente nella stessa chimica, ma piuttosto nella gestione di microsfere di silice. Si prega di notare che, nel corso dei protocolli, le microsfere devono essere gestiti da grapsing loro steli leggermente con acuminati pinzette. Ciò mantiene le pinzette ben lontano dagli stessi microsfere, e consente un facile trasporto tra i passaggi. Molti passi nel protocollo di seguito sono specificamente progettate per affrontare questo fattoo. 2. Microsfera Fabrication <ol><li> Costruire l&#39;alloggiamento di archiviazione per le microsfere. <ol><li> Utilizzando un coltello exacto, tagliare un ¼ in grosso pezzo di cartone in un 1 in x 1 in piazza, su un nastro di questo di dimensioni regolari vetrino, e allegare un 1 nella sezione di nastro adesivo, con le sue estremità incontrano per formare un rotolo , al cartone. </li><li> Questo crea una piattaforma su cui il microsfere può essere elevata e isolato dall&#39;ambiente circostante, e previene i danni alla loro superficie. </li></ol></li><li> Utilizzando forbici, tagliare una sezione 3 pollici di fibra ottica da una bobina di fibra ottica. </li><li> Utilizzo di un n-Nik fibra-stripper, spelare il rivestimento protettivo polimerico dagli ultimi 0,5 pollici dalla fine del pezzo tagliato di fibra, lasciando solo il nucleo di silice. Pulire la superficie di un polimero rimanente con un Kimwipe inumidito con metanolo strofinando delicatamente la fibra con il Kimwipe. </li><li> Utilizzando una fibra nuda mannaia, tagliare l&#39;estremità in modo spogliato °a solo circa 1 millimetro di fibra spogliato rimane sulla estremità della fibra. </li><li> Posizionare l&#39;estremità scoperta della fibra ottica nel percorso di un laser CO 2, avendo cura di allineare verticalmente la fibra in modo tale che la sua fine così estratto è rivolto verso il basso. </li><li> Accendere il laser CO 2, e indirizzarla verso la superficie della estremità scoperta della fibra ottica. Il laser si scioglierà alla fine spogliato della fibra in una sfera con circa il 3,5% di potenza in 2 secondi. </li><li> Con una pinzetta, accuratamente afferrare lo stelo (non-spoglia porzione della fibra ottica) della microsfera. Fissare lo stelo al rotolo di nastro sul corpo microsfere. Il vetrino può essere essa stessa immagazzinata in una capsula di Petri. Questo permette di memorizzare sicurezza della microsfera. </li></ol> 3. Popolare la superficie con gruppi idrossilici <ol><li> Con la soluzione di piranha: <ol><li> In un flacone in polipropilene da 60 ml con tappo a cerniera, preparare una soluzione piranha (70:30 in volume fumante H <sub&gt; 2 SO 4: H 2 O 2 (30% in peso)) aggiungendo 5 ml di perossido di idrogeno al flacone, seguiti da 11,6 mL di acido solforico fumante. ATTENZIONE: indossare guanti resistenti agli acidi. </li><li> Trasferire il vetrino, tenendo almeno 1 microsfere, nella fiala. La microsfera deve essere in contatto con il liquido, ma il liquido non deve toccare il cartone. Regolare il volume della soluzione, se necessario. </li><li> Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e inserirlo in un altro flacone di plastica contenente DDI H 2 O. Sia i campioni siedono nella soluzione per 5 minuti. </li><li> Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e posizionarlo un forno a 80 ° C per 10 minuti per asciugare la superficie. </li></ol></li><li> Utilizzando il trattamento di plasma di ossigeno: <ol><li> Trasferire il vetrino contenente almeno un microsfere alla camera di plasma di ossigeno. </li><li> Impostare la pressione di ossigeno di 200 mTorr, e la potenza di 120 W. esporre il campione al plasma di ossigeno per 2 minuti. </li><li> Rimuovere il vetrino dalla camera di plasma. </li></ol></li></ol> 4. Collegamento agenti di accoppiamento di silano alla superficie <ol><li> Posizionare il vetrino, contenente almeno un microsfere, in un essiccatore a vuoto in una cappa aspirante. </li><li> Anche nella cappa, aprire il flacone agente di accoppiamento silano (in questo caso, amminopropiltrimetossisilano (APTMS) è stato utilizzato), e posizionare la bottiglia aperta in un essiccatore. </li><li> Sostituire il coperchio sulla essiccatore a vuoto, e collegare la porta di uscita ad un aspiratore o sottovuoto linea di casa. </li><li> Accendere il vuoto casa o la linea di galleggiamento, e evacuare la essiccatore sotto vuoto. Una volta che una tenuta a vuoto è formata tra il coperchio e la base, la reazione inizia temporizzazione. Ciò depositare l&#39;agente di accoppiamento di silano sulla superficie come una pellicola sottile. </li><li> Dopo 15 minuti, spegnere il vuoto, e lentamente aprire la porta per far entrare aria in un essiccatore. Per questo agente di accoppiamento, 15 minuti è sufficiente per formare una uniform monostrato sulla superficie. Per gli altri agenti di accoppiamento, il tempo può essere necessario regolare. </li></ol> 5. Collegamento Biotin alla superficie <ol><li> Circa un&#39;ora prima di attaccare la biotina, preparare una soluzione 10 mM di N-hydroxylsuccinimide biotina (NHS-biotina) in dimetilsolfossido anidro (DMSO) in una fiala polipropilene 60 mL con un coperchio incernierato. <ol><li> Se l&#39;NHS-biotina è stato memorizzato bassa temperatura, lasciarla a temperatura ambiente prima di volumetrie fuori. </li><li> Sonicare la soluzione per 1 ora per dissolvere completamente il NHS-biotina polvere con il solvente. </li></ol></li><li> Trasferire il vetrino contenente microsfere in un&#39;altra fiala di plastica, con le microsfere in basso, e deriva in parte superiore del flacone. </li><li> Trasferimento, usando una pipetta di plastica, un volume appropriato di NHS-biotina soluzione lungo il lato del flacone, dietro il vetrino (quindi la soluzione non tocchi la microsfera mentre viene aggiunto alla fiala). Add soluzione sufficiente a coprire la superficie delle microsfere. </li><li> Posizionare le fiale contenenti ora le microsfere e NHS-biotina in soluzione di DMSO in un incubatore a dondolo (vassoio oscillante) per 30 minuti a temperatura ambiente, con la velocità e l&#39;angolo di inclinazione a 5 rpm e 5 gradi, rispettivamente. </li><li> Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e dolcemente scivolare in un altro flacone pieno di DDI H 2 O. Posizionare il flaconcino sul vassoio oscillante per altri 10 minuti alla stessa velocità e angolo di inclinazione come prima. Ripetere questa operazione due volte con acqua fresca ogni volta. Questo aiuta a rimuovere il DMSO in eccesso dalla superficie, e rimuove qualsiasi fisicamente adsorbito biotina che non ha in realtà innesto alla superficie. </li><li> Rimuovere il vetrino dalla fiala, e posizionarlo in un forno a 80 ° C per 10 minuti, o fino a quando tutte le goccioline d&#39;acqua vengono rimosse dalla superficie. </li></ol> 6. Marcatura fluorescente di ammino-terminato silice <ol><li> Per etichettare i gruppi amminici presenti dopo il trattament con APTMS, preparare la soluzione FITC in una stanza buia, sciogliendo FITC 1 mg in 1 ml di DMSO anidro. </li><li> Diluire la soluzione in 6,1 aggiungendo 50 pl della soluzione FITC ad 1 ml di tampone bicarbonato di sodio 0,1 M. </li><li> Posizionare la soluzione in un flacone polipropilene 60 mL con un tappo incernierato, e far scorrere il ammino-terminato microsfere, alloggiato nuovamente sul vetrino, nel flacone. </li><li> Porre la fiala in un bagno di ghiaccio, e lasciare che il campione di reagire con la soluzione di FITC per un minimo di 4 ore al buio. </li><li> Rimuovere fluoroforo eccesso attraverso due risciacqui, 10 minuti di microsfere in tampone carbonato di sodio. Come prima, una cuvetta 60 mL di polipropilene con un tappo incernierato con il tampone, e far scorrere il vetrino nella soluzione, avendo cura che la soluzione copre solo il microsfere, e non l&#39;alloggiamento cartone. Coprire la fiala con un foglio di alluminio, e posizionare il flaconcino su un vassoio tilt fissato a 5 gradi e 5 giri, come prima. </li><li> Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e dolcemente scivolare in un altro flacone pieno di DDI H 2 O e coperto con un foglio di alluminio. Posizionare il flaconcino sul vassoio oscillante per altri 10 minuti alla stessa velocità e angolo di inclinazione come prima. Ripetere questa operazione due volte con acqua fresca ogni volta. Questo aiuta a rimuovere il colorante in eccesso dalla superficie. </li><li> Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e secco in un forno a 80 ° C per 10 minuti prima di imaging. </li></ol> 7. Marcatura fluorescente di biotina-terminato silice <ol><li> Preparare un 10 pg / mL di soluzione Texas Red-avidina in salina tamponata con fosfato. </li><li> Aggiungere la soluzione ad una fiala di polipropilene da 60 ml con un tappo incernierato, e far scorrere il vetrino contenente un biotina terminazione microsfere nella soluzione, in modo che la microsfera è appena coperto dalla soluzione. </li><li> Reagire per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Rimuovere fluoroforo in eccesso attraverso due, 10 minuti risciacquares delle microsfere in tampone PBS. <ol><li> Come prima, una cuvetta 60 mL di polipropilene con un tappo incernierato con il tampone, e far scorrere il vetrino nella soluzione, avendo cura che la soluzione copre solo il microsfere, e non l&#39;alloggiamento cartone. </li><li> Coprire la fiala con un foglio di alluminio, e posizionare il flaconcino su un vassoio tilt fissato a 5 gradi e 5 giri, come prima. </li></ol></li><li> Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e dolcemente scivolare in un altro flacone pieno di DDI H 2 O e coperto con un foglio di alluminio. Posizionare il flaconcino sul vassoio oscillante per altri 10 minuti alla stessa velocità e angolo di inclinazione come prima. Ripetere questa operazione due volte con acqua fresca ogni volta. Questo aiuta a rimuovere il colorante in eccesso dalla superficie. </li><li> Rimuovere delicatamente il vetrino dalla fiala, e secco in forno a 80 ° C per 10 minuti prima di imaging. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Microsfere correttamente funzionalizzatis possono essere identificati mediante microscopia ottica ea fluorescenza. Se la superficie funzionalizzazione viene eseguita correttamente, dovrebbe risultare in una copertura uniforme densa di molecole di biotina sulla superficie, e la superficie deve rimanere difetto-e-contaminante libero dopo funzionalizzazione al fine di mantenere la loro sensibilità elevata durante gli esperimenti di rilevamento. Microscopia ottica può essere usato per sondare quest&#39;ultimo, mentre microscopia fluorescente può sondare la qualità e l&#39;uniformità di superficie della copertura. Nella figura 2, mostriamo alcuni esempi di corretta funzionalizzata microsfere. Queste immagini dimostrano che non vi è alcun danno superficiale o contaminazione dovuta alla funzionalizzazione (Fig. 2a), e che le microsfere mostrano una uniforme, copertura coerente delle gruppi amminici (Fig. 2b) o gruppi biotina (Fig. 2c) sulla superficie . Se le microsfere non sono stati funzionalizzati correttamente, il microsfere ottico immagini will presentano contaminazione superficiale, la copertura aggregazione o non uniforme, e difetti evidenti nella superficie, come crepe superficiali (Figura 3). Qui vediamo un esempio tipico di contaminazione superficiale, derivante da aggregazione dei reagenti sulla superficie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> Figura 1. 3-step schema di reazione per attaccare molecole sonda sulla superficie di microsfere di silice. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> Figura 2. Microsfere di silice. a) micrografia ottica di microsfere di silice popolato con gruppi idrossilici attraverso l&#39;esposizione al plasma di ossigeno; b) Micrografia fluorescente di microsfere di silice popolato con ammine primarie e marcato con FITC colorante; c) Micrografia fluorescente di silice microsphere popolato con biotina ed etichettate con Texas Red-avidina coniugato. Ristampato con il permesso Soteropulos, CE, Hunt, HK &amp; Armani, AM Determinazione della cinetica di legame con sussurrano microcavità modalità galleria. Appl. Phys. Lett. 99., 103.703-103.703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics 17. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografia ottica della sfera impropriamente funzionalizzata. Qui, potete vedere la polvere sulla superficie in alto a destra, così come la contaminazione si estende dalla superficie. Inoltre, il lato destro della microsfera ottico mostra una zolla piccolo sulla superficie.

<ol>
	<li>Datar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cantilever+Sensors:+Nanomechanical+Tools+for+Diagnostics.">Cantilever Sensors: Nanomechanical Tools for Diagnostics.</a> MRS Bull. 34, 449-454 (2009).</li><li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biological+and+chemical+sensors.">Label-free biological and chemical sensors.</a> Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).</li><li>Sundberg, F., Karlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+characterization+of+immune+responses+using+label-free+biacore+immunoassays.">Rapid detection and characterization of immune responses using label-free biacore immunoassays.</a> Immunology. 120, 46-47 (2007).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (2008).</li><li>Bernards, M. T., Cheng, G., Zhang, Z., Chen, S. F., Jiang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonfouling+polymer+brushes+via+surface-initiated,+two-component+atom+transfer+radical+polymerization.">Nonfouling polymer brushes via surface-initiated, two-component atom transfer radical polymerization.</a> Macromolecules. 41, 4216-4219 (2008).</li><li>Fan, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+optical+biosensors+for+unlabeled+targets:+A+review.">Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 620, 8-26 (2008).</li><li>Qavi, A. J., Washburn, A. L., Byeon, J. Y., Bailey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+technologies+for+quantitative+multiparameter+biological+analysis.">Label-free technologies for quantitative multiparameter biological analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 121-135 (2009).</li><li>Hunt, H. K., Soteropulos, C., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugation+Strategies+for+Microtoroidal+Optical+Resonators.">Bioconjugation Strategies for Microtoroidal Optical Resonators.</a> Sensors. 10, 9317-9336 (2010).</li><li>Kalia, J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Bioconjugation.">Advances in Bioconjugation.</a> Curr. Org. Chem. 14, 138-147 (2010).</li><li>Matsko, A. B., Savchenkov, A. A., Strekalov, D., Ilchenko, V. S., Maleki, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Applications+of+Whispering-Gallery+Mode+Resonators+in+Photonics+and+Nonlinear+Optics.">Review of Applications of Whispering-Gallery Mode Resonators in Photonics and Nonlinear Optics.</a> IPN Progress Report. , 42-162 (2005).</li><li>Armani, A. M., Kulkarni, R. P., Fraser, S. E., Flagan, R. C., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+single-molecule+detection+with+optical+microcavities.">Label-free, single-molecule detection with optical microcavities.</a> Science. 317, 783-787 (2007).</li><li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+single+nanoparticle+detection+and+sizing+by+mode+splitting+in+an+ultrahigh-Q+microresonator.">On-chip single nanoparticle detection and sizing by mode splitting in an ultrahigh-Q microresonator.</a> Nat. Photon. 4, 122-122 (2010).</li><li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip.">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispering-gallery-mode+biosensing:+label-free+detection+down+to+single+molecules.">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering+gallery+mode.">Single virus detection from the reactive shift of a whispering gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20701-20704 (2008).</li><li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+microcavity+optical+biosensors.">Recycling microcavity optical biosensors.</a> Opt. Lett. 36, 1092-1094 (2011).</li><li>Soteropulos, C. E., Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+binding+kinetics+using+whispering+gallery+mode+microcavities.">Determination of binding kinetics using whispering gallery mode microcavities.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Come descritto nei protocolli, abbiamo creato una piattaforma alloggiamento per cui il trasporto di silice microsfere dai gambi durante il processo di funzionalizzazione. Questa piattaforma alloggiamento è stato creato come una soluzione per la contaminazione superficiale e danni che il risultato della microsfera venire in contatto con le pareti dei vari contenitori utilizzati durante il processo di funzionalizzazione. Ci siamo resi conto della difficoltà principale nasce dalla sempre attaccare e staccare i singoli mi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Pescatore </td><td> 67-56-1 </td><td> ACS grade </td></tr><tr><td> Acido solforico </td><td> Pescatore </td><td> 8014-95-7 </td><td> Fumante </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno </td><td> Pescatore </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30 wt% </td></tr><tr><td> Aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Pescatore </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-biotina EZ linker </td><td> Perforare </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfossido </td><td> Pescatore </td><td> 67-68-5 </td><td> Anidro </td></tr><tr><td> Fluoresceina isotiocianato </td><td> Perforare </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> Pescatore </td><td> 7647-14-5 </td><td> Polvere concentrato </td></tr><tr><td> Bicarbonato di Sodio Buffer </td><td> Pescatore </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red - Avidin coniugato </td><td> Perforare </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra Ottica </td><td> Newport </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> Fiber Stripper </td><td> Fibra strumento di vendita </td><td> NN-175 </td><td> No-Nik 175 um stripper </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Pescatore </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> Bare Fiber Cleaver </td><td> Ilsintech </td><td> Cl-03A </td><td></td></tr><tr><td> Vetro vetrini </td><td> Pescatore </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> Vials in polipropilene </td><td> Pescatore </td><td> 03-341-75A </td><td> 60 ml, tappo a cerniera </td></tr><tr><td> Incubazione Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuum Essiccatore </td><td> Pescatore </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

attaching biological probes to silica optical biosensors using silane coupling agents

Al fine di interfacciarsi con ambienti biologici, piattaforme biosensore, come il sistema popolare Biacore (basata sulla superficie Plasmon Resonance (SPR) tecnica), utilizzare varie tecniche modificazione superficiale, che possono, per esempio, impediscono incrostazione superficie, sintonizzare l&#39; idrofobicità / idrofilicità della superficie, adattarsi ad una varietà di ambienti elettronici, e più frequentemente, inducono specificità verso un obiettivo di interesse. 1-5 Queste tecniche estendere la funzionalità dei biosensori altrimenti altamente sensibili per applicazioni reali in ambienti complessi, tale come il sangue, urine, e l&#39;analisi delle acque reflue. 2,6-7 Mentre biosensori piattaforme commerciali, come Biacore, hanno ben capito, le tecniche standard per l&#39;esecuzione di tali modifiche superficiali, queste tecniche non sono stati tradotti in modo standardizzato per altre etichette libere piattaforme di biosensori, come Whispering Galleria modalità (WGM) risonatori ottici. 8-9 &lt;<html> / P&gt; Risonatori WGM ottiche rappresentano una tecnologia promettente per l&#39;esecuzione di label-free rilevamento di una grande varietà di specie a ultra-basse concentrazioni 6,10-12 L&#39;elevata sensibilità di queste piattaforme è il risultato delle loro ottiche geometriche uniche:. Ottica risonatori WGM confine circolazione . luce a specifici, frequenze di risonanza integrali 13 Come il piattaforme SPR, il campo ottico non è completamente chiuso al dispositivo sensore, ma evanesces, questa &quot;coda evanescente&quot; può quindi interagire con specie nell&#39;ambiente circostante. Questa interazione provoca l&#39;indice di rifrazione efficace del campo ottico di cambiare, causando un leggero, ma rilevabile, spostare la frequenza di risonanza del dispositivo. Poiché il campo ottico circola, può interagire più volte con l&#39;ambiente, con conseguente amplificazione intrinseca del segnale, e altissima sensibilità alle minime variazioni nell&#39;ambiente. 2,14-15 tenda &quot;&gt; Per eseguire il rilevamento mirato in ambienti complessi, queste piattaforme deve essere abbinata a una molecola sonda (di solito una metà di una coppia di legame, ad esempio gli anticorpi / antigeni) attraverso la modifica della superficie. 2 Sebbene risonatori WGM ottici possono essere fabbricate in geometrie diverse da una varietà di sistemi materiali, la microsfere di silice è la più comune. Queste microsfere sono generalmente fabbricati sull&#39;estremità di una fibra ottica, che fornisce un &quot;gambo&quot; con cui le microsfere possono essere movimentato durante gli esperimenti di funzionalizzazione e di rilevamento. chimiche superficiali silice può essere applicato per attaccare molecole sonda alle loro superfici, tuttavia, le tecniche tradizionali generati per substrati planari spesso non sono sufficienti per queste strutture tridimensionali, eventuali modifiche alla superficie delle microsfere (polvere, contaminazione, difetti superficiali, e rivestimenti irregolari) possono avere gravi, conseguenze negative sulla loro capacità di rilevazione. Qui, dimostriamo un approccio facileper la funzionalizzazione superficiale di microsfere di silice WGM risonatori ottici che utilizzano agenti di accoppiamento silanici per colmare il superficie inorganica e l&#39;ambiente biologico, collegando biotina alla superficie della silice. 8,16 Sebbene usiamo silice risonatori WGM microsfere come il sistema sensore in questa relazione, i protocolli sono generale e può essere utilizzato per funzionalizzare la superficie di qualsiasi dispositivo di silice con biotina.

Watch this Scientific Journal Video about Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents at JoVE.com

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Biosensori interfacciarsi con ambienti complessi e biologici ed eseguire il rilevamento mirato alla combinazione di sensori altamente sensibili con sonde altamente specifici collegati al sensore tramite modifica della superficie. Qui, dimostriamo il funzionalizzazione superficiale di silice sensori ottici con biotina mediante agenti di accoppiamento silanici per colmare il sensore e l&#39;ambiente biologico.

Collegamento sonde biologiche ai biosensori ottici che utilizza silice agenti di accoppiamento silanici

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

attaching-biological-probes-to-silica-optical-biosensors-using-silane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K Views.  University of Missouri. Biosensori interfacciarsi con ambienti complessi e biologici ed eseguire il rilevamento mirato alla combinazione di sensori altamente sensibili con sonde altamente specifici collegati al sensore tramite modifica della superficie. Qui, dimostriamo il funzionalizzazione superficiale di silice sensori ottici con biotina mediante agenti di accoppiamento silanici per colmare il sensore e l'ambiente biologico.

Video: Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Basso Peso Molecolare proteina di arricchimento sul film sottili di silice mesoporosi per la scoperta di biomarcatori

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

Inserimento di Flexible Neural Sonde Uso Rinforzi rigida collegata con Biodissolvable adesivo

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband rivelatore ottico di ultrasuono per applicazioni Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

L&#39;uso di biosensori ottici privi di etichetta per rilevare modulazione dei canali del potassio da G-recettori accoppiati a proteine

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l&#39;integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti