Ringraziamo Chandran Sabanayagam per il suo aiuto nello sviluppo del sistema, Joshua Edel per la consulenza sulla progettazione del dispositivo a microfluidi e lo staff del Rowland Institute presso la Harvard University per la lavorazione di pezzi di setup. Riconosciamo utili discussioni con i membri del gruppo Meller presso l&#39;Istituto Rowland e alla Boston University, e membri del gruppo T. Ha &#39;s a UIUC per ottenere informazioni utili. Infine, apprezziamo il sostegno finanziario della National Science Foundation (PHY-0701207) e l&#39;Istituto Nazionale della Salute (GM075893).

1 - Assemblaggio della cella microfluidica La cella microfluidica è costituito da fondendo una fantasia, 2 mm di spessore, polidimetilsilossano (PDMS) disco di una scivolata appena pulita copertura quarzo. Il disco contiene quattro PDMS 30 camere microlitri rettangolare a cui si accede da ingresso e uscita flessibile capillari collegato ad un serbatoio di buffer e una pompa a siringa, rispettivamente, per il flusso controllato di buffer. La cella di flusso è supportato dalla sua parte posteriore da una finestra di vetro e collocato su una misura titolare cella che contiene un elemento termoelettrico raffreddato ad acqua per regolare la temperatura. <ol><li> Per rendere la fantasia PDMS disco, miscelare 10 parti di base di silicone elastomero con 1 agente parte la cura, mescolate bene e lasciate degasaggio per 1 ora nel vuoto. </li><li> Delicatamente versare la miscela nello stampo elastomero cellula microfluidica. Nel nostro caso, questo è un 1 &quot;wafer di silicio con quattro strisce (1x10 1x10 4 x 3 x 300 micron) a base di photoresist negativo. Lasciare questo per la cura su un piatto caldo a 70 ° C per due ore. </li><li> Con attenzione buccia del disco curata PDMS dallo stampo usando una lama di rasoio. Fusibile il disco su un&#39;&#39;1 finestra di vetro (contenente 8 x 2 mm di diametro fori già predisposti alle due estremità dei canali) da plasma ossidanti entrambe le superfici per 30 secondi. Fondere le vetrate sul lato piatto del disco PDMS (il lato non contenente i canali). </li><li> Inserire un 2-pollice di lunghezza tubo flessibile capillare di silice fusa attraverso il foro di ogni finestra di vetro fino a quando non raggiunge il canale. Inserimento di un ago e poi segue con il capillare può facilitare questo processo. Sigillare i fori di vetro della finestra con un rapido indurimento composto colata di silicone come Kwik-Cast. </li><li> Sciacquare i canali con etanolo e acqua, e plasma-attivare la cellula insieme ad una appena pulita, da 1 pollice slittamento quarzo circolare copertura per 30 secondi. Si consiglia di pulire questo vetrino utilizzando piranha *. Fondere il vetrino sul lato della cella che contiene i canali, sigillando le camere. </li><li> Lasciare la cella assemblata a curare tutta la notte a temperatura ambiente. </li></ol> * Piranha è una soluzione di H 2 O 2 e H 2 SO 4 a 1:2.5 proporzioni. Per pulire il copri-oggetto, immergerle in piranha a 90 ° C per 20 min. 2 - Attivare la superficie di immobilizzazione molecola Per gli studi di acido nucleico, più semplice il regime di immobilizzazione superficie consiste in primo rivestimento un bicchiere o slittamento quarzo con copertura biotinilato albumina sierica bovina (BSA) e poi con streptavidina. Questo permette al campione biotinilato di essere immobilizzato con alta specificità per i giorni a temperatura ambiente. <ol><li> Collegare il tubo flessibile per i capillari per l&#39;iniezione del buffer facile utilizzando una siringa e l&#39;ago. </li><li> Iniettare una soluzione di 0,1 mg / ml di BSA biotinilati nel buffer A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, filtrata utilizzando filtri 0,02 micron), nel canale e incubare per almeno 30 min. </li><li> Flusso di 300-500 ml di tampone A di togliere qualunque BSA libera biotinilato dal canale, facendo attenzione a non intrappolare bolle d&#39;aria all&#39;interno della camera. </li><li> Iniettare una soluzione di 0,1 mg / ml di streptavidina nel buffer A e incubare per 15 min. Poi ripetere il passo 3. </li><li> Flusso attraverso una soluzione 3-5 pM del campione biotinilato. Eseguire una scansione della superficie per verificare la copertura di molecole fluorescenti. Se necessario, aumentare la concentrazione del campione per ottenere una migliore copertura. Incubare per 10 minuti e ripetere il passo 3. </li></ol> La cella microfluidica è montato su un palcoscenico motorizzata xy permettendo grossolane (fino a 25 mm) movimento utilizzando otticamente codificati motori DC, e fine (1 nm) utilizzando due moto a circuito chiuso attuatori piezoelettrici (Physik Instrumente modello M-014 o simili). Questo può essere fatto prima o dopo aver attivato la superficie per l&#39;immobilizzazione del campione. 3 - Preparazione del Buffer Imaging (IB) L&#39;IB consiste in un sistema enzimatico dell&#39;ossigeno scavenging e un quencher tripletta, come Trolox. Dal momento che l&#39;IB viene svuotata attraverso costantemente durante la notte, almeno 10 ml deve essere preparato in anticipo. <ol><li> Preparare 10 ml di 0,8% w / v D-glucosio, almeno 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 e 50 mM NaCl in acqua deionizzata. La maggiore concentrazione di buffer è importante per due motivi: Trolox dissoluzione sarà acidificare la soluzione, e la reazione enzimatica anche abbassare il pH della soluzione nel tempo. Dal momento che questa soluzione ha una lunga durata può essere memorizzato come soluzione stock. </li><li> Sciogliere 5 mg di Trolox nel buffer preparata nella fase 1 con il vortex per un paio di minuti e poi agitando per&gt; 10 min. Trolox non è molto solubile in acqua a pH&gt; 7, in modo da non correre questo passaggio. Filtrare la soluzione con un filtro di 0,2 micron e lasciare degasaggio nel vuoto per 10 minuti. </li><li> Preparare la soluzione &quot;gloxy&quot; enzimatica mescolando wate 60 microlitrir, 20 ml di tampone 5X A, 20 ml di catalasi, glucosio ossidasi 1 mg e 100 ml di 10 mg / ml BSA. Filtrare la soluzione con un filtro di centrifuga 0,22 micron. </li><li> Mescolare delicatamente il tampone dal Punto 2 con la soluzione &quot;gloxy&quot; dal punto 3 evitando la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Il flusso di IB attraverso il canale ad una velocità costante di 5 microlitri / min con una pompa meccanica siringa per controllare la velocità del flusso. Bolla di gas argon nel serbatoio IB per evitare che l&#39;ossigeno atmosferico da ri-sciogliendo nel buffer. </li></ol> La scansione della superficie, localizzazione molecola e l&#39;acquisizione di tracce singole intensità molecola è controllato da un programma LabView che permette la raccolta automatica dei dati 1. Il programma esegue la scansione 20x20 micron 2 aree risoluzione a 0,2 micron, con un tasso di 0,1 micron / ms. I dati vengono immediatamente lavorati per produrre intensità ponderata posizioni di tutti i pixel sopra i conteggi di fondo. Una volta che le molecole si trovano immobilizzate, vengono spostati uno per uno nel volume confocale e l&#39;intensità del donatore e fluoroforo accettore sono registrati in funzione del tempo fino a quando entrambi photobleach fluorofori. Il palco è poi programmato di passare a una nuova origine 100 micron di distanza, e il processo di scansione si ripete. 4 - Risultati Rappresentante Di seguito alcune immagini che mostrano la cellula assemblato microfluidica prima dell&#39;attivazione di superficie e dopo essere stato montato sul microscopio pronto per l&#39;immobilizzazione molecola. Se il canale è attivato con successo, le scansioni di superficie dovrebbe essere simile a quella illustrata qui sotto le scansioni che mostrano emissione del donatore colorante (verde) e accettore (rosso) dopo l&#39;eccitazione del donatore diretta. Queste molecole sono spostati uno dopo l&#39;altro nel volume di sondaggio e la fluorescenza viene registrata nel corso del tempo fino a quando entrambi photobleach coloranti, come indicato nella traccia singola molecola. Da tracce come queste si può ottenere la FRET efficienza che informa sul istantanea donatore-accettore di separazione, che a sua volta viene utilizzato per esplorare la struttura e la dinamica delle molecole di interesse biologico. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1: cella Microfluidic con quattro canali, ognuno con ingresso / uscita capillari. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Cell montato sul microscopio pronto per le misurazioni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /> Figura 3: Impostazione per sm-FRET misurazioni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /> Figure 4 e 5: il canale Rosso e verde di una scansione della superficie di immobilizzata FRET molecole eccitati con il laser verde. Clicca per vedere una versione più grande di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">figura 4</a> , o <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">figura 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figura 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figura 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figura 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figura 9" border="0" /> Figure 6, 7, 8 e 9: traiettorie Intensità del donatore (verde) e accettore (rosso) fluorofori etichettati per una molecola di DNA 8, 10, 16 e 18 paia di basi a parte. Clicca per vedere una versione più grande di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">figura 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figura 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figura 8</a> , o <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">figura 9</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

Anche se il protocollo di cui sopra è stato ottimizzato per il nostro particolare sistema e per una precisa scelta di coloranti (TMR e ATTO647N), esso non è affatto l&#39;unico metodo provato. Recentemente, un sistema alternativo di ossigeno scavenging composto da acido protocatechuic (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-diossigenasi (PCD) ha mostrato di aumentare la fotostabilità di alcuni coloranti 4. Allo stesso modo, altri tripletta stato quenchers come il β-mercaptoetanolo (BME) può essere usato al posto di Trolox, anche se queste non possono sopprimere lunga durata lampeggiante di alcuni coloranti, in particolare Cy5 5. Anche se immobilizzazione tramite biotina-streptavidina-biotinilato albumina di siero bovino (BSA) è la scelta preferita per gli studi di acidi nucleici, un polietilene glicole (PEG)-superficie rivestita è più adatto per gli studi di proteine ​​in quanto impedisce ai non-specifica adesione 1. Inoltre, sub-diffrazione limitata vescicole formato può essere utilizzato per incapsulare le biomolecole di interesse nei casi in cui può essere influenzata dalle interazioni superficie 6. In questo articolo abbiamo utilizzato una configurazione confocale dotato di silicone fotodiodi a valanga per acquisire le tracce intensità di fluorescenza. Questo protocollo funziona altrettanto bene con microscopi a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) dotate di telecamere CCD. Indipendentemente dal microscopio usato, sm-FRET può informare sulle risoluzioni spaziali avvicinando al angstrom quando il donatore e il segnale accettore sono adeguatamente corretti 7.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopia è stata ampiamente utilizzata per studiare la struttura e la dinamica delle molecole di interesse biologico, come gli acidi nucleici e proteine. Singola molecola FRET (sm-FRET) misurazioni su molecole immobilizzate permettono lunghe osservazioni del sistema in modo efficace fino a quando entrambi i coloranti photobleach-con conseguente time-tracce che relazione sulla dinamica biomolecolare con una vasta gamma di tempi da millisecondi a minuti. Per facilitare l&#39;acquisizione di un gran numero di tracce per analisi statistiche, il processo deve essere automatizzato e l&#39;ambiente campione dovrebbe essere strettamente controllato nel tempo di misura intera (~ 12 ore). Questa operazione viene eseguita utilizzando un microscopio confocale a scansione automatica che permette l&#39;interrogatorio di migliaia di singole molecole durante la notte, e una cella microfluidica che permette lo scambio controllato di buffer, con contenuto di ossigeno limitato e mantiene una temperatura costante durante tutto il periodo di misura. Qui si mostrano come assemblare il dispositivo a microfluidi e come attivare la sua superficie per l&#39;immobilizzazione del DNA. Poi ci spiegano come preparare un buffer di massimizzare la fotostabilità e la durata della fluorofori. Infine, mostriamo i passi necessari per preparare il setup per l&#39;acquisizione automatica del tempo risolto singola molecola FRET tracce di molecole di DNA.

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Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

In questo articolo viene descritto come si ottiene FRET tracce di molecole di DNA individuale immobilizzato su una superficie utilizzando un microscopio a scansione automatica confocale.

Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

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12.8K Views.  Boston University. In questo articolo viene descritto come si ottiene FRET tracce di molecole di DNA individuale immobilizzato su una superficie utilizzando un microscopio a scansione automatica confocale.

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Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

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Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

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Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

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Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Isolamento e formazione immagine di fluorescenza per la ricostruzione di singola particella di Chlamydomonas centrioli

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

Ricostruzione delle firme di fluorescenza innata unicellulare mediante microscopia confocale

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...