Questo protocollo descrive un metodo che consente l'identificazione sito-specifica dei residui di cistina ossidati delle proteine. Il metodo consente di generare dati quantitativi e sito-specifici dei residui di cistina ossidati da vari tipi di campioni. Per iniziare la procedura di cattura assistita, lavare i pellet proteici precipitati due volte con acetone centrifugando a 20.500 G, in quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi decantare l'acetone e rimuovere l'acetone rimanente con una micro pipetta. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro aggiungere tre millilitri di acetone ghiacciato fresco al tubo e mescolare bene invertendo il tubo più volte. Dopo il secondo lavaggio, lasciare asciugare i pellet all'aria per uno o due minuti senza lasciarli asciugare troppo.
Aggiungere un millilitro di tampone B al pellet proteico essiccato. Per solubilizzare la proteina, sonicare ripetutamente il pellet in un sonicatore da bagno con una potenza di 250 watt per 15-30 secondi alla volta, insieme a un breve vortice. Eseguire il test dell'acido bicinconinico o BCA per misurare la concentrazione proteica.
Per standardizzare le concentrazioni proteiche, trasferire 500 microgrammi di campione proteico in un filtro centrifugo da 0,5 millilitri, 10 kilodalton, e aumentare il campione a 500 microlitri con tampone di risospensione. Centrifugare la miscela tampone proteica a 14.000 G a temperatura ambiente, fino a quando il volume nel filtro centrifugo è inferiore a 100 microlitri. Raccogliere il campione capovolgendo il filtro in una provetta di raccolta.
Centrifugare il campione a 1000 G per due minuti e aggiungere tampone C per ottenere un volume finale di 500 microlitri. Per ridurre i tioli proteici, aggiungere 20 microlitri di ditiotreitolo 500 millimolare o DTT, al campione per ottenere una concentrazione finale di 20 millimolari e incubare i campioni per 30 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione a 850 giri / min. Dopo la riduzione, centrifugare i campioni in filtri centrifughi da 0,5 millilitri da 10 kilodalton a 14.000 G a temperatura ambiente, fino a quando il volume nel filtro centrifugo è inferiore a 100 microlitri.
Aggiungere il tampone D per portare il volume a 500 microlitri e ripetere la centrifugazione. Dopo la quarta centrifugazione, raccogliere i campioni capovolgendo il filtro in una provetta di raccolta per centrifugare a 1000 G per due minuti. Quindi misurare la concentrazione proteica utilizzando il test BCA.
Quindi, posizionare le colonne di rotazione su un collettore a vuoto e, utilizzando una micro pipetta, trasferire 500 microlitri del liquame di resina di affinità tiolica appena preparato su ciascuna colonna. Applicare il vuoto per la rimozione dell'acqua. Ripetere la procedura una volta per ottenere 30 milligrammi di resina per colonna.
Lavare la resina cinque volte con 500 microlitri di acqua ultrapura, applicando un vuoto per rimuovere l'acqua e poi cinque volte con 500 microlitri di tampone E.In una nuova provetta, aggiungere tampone C a 150 microgrammi del campione proteico ridotto fino a quando il volume finale è di 120 microlitri. Trasferire la soluzione proteica in una colonna di spin tappata contenente la resina. Posizionare il tappo sulla colonna e incubare per due ore a temperatura ambiente agitando a 850 giri / min.
Lavare la resina come descritto nel manoscritto. Sostituire la spina. Per eseguire la digestione triptica su resina, aggiungere 120 microlitri di soluzione di tripsina appena preparata ai campioni e incubare la colonna durante la notte a 37 gradi Celsius, con agitazione a 850 giri / min.
Il giorno successivo, lavare la resina più volte come descritto nel manoscritto e sostituire il tappo. Utilizzando una micro pipetta, aggiungere 40 microlitri di tampone bicarbonato di trietilammonio da 100 millimolari alla resina lavata. Quindi aggiungere 70 microlitri del tag di massa tandem disciolto o del reagente di etichettatura TMT e incubare per un'ora a temperatura ambiente agitando a 850 giri / min.
Conservare il reagente TMT rimanente a meno 80 gradi Celsius. Lavare la resina e sostituire la spina. Eluire i peptidi marcati con TMT aggiungendo 100 microlitri di tampone bicarbonato di ammonio 100 millimolari a pH 8,0, contenente 20 millimolari DTT, alla colonna e incubando la colonna su un miscelatore termico a temperatura ambiente per 30 minuti a 850 RPM.
Dopo l'incubazione, eseguire l'eluizione posizionando la colonna su un collettore sottovuoto, applicando il vuoto e facendo eluire i campioni in una provetta da microcentrifuga da cinque millilitri. Ripetere il passaggio una volta, quindi aggiungere 100 microlitri di 80% acetonitrile con acido trifluoroacetico allo 0,1% alla colonna. Dopo aver incubato la colonna per 10 minuti a temperatura ambiente, eluire il campione nella stessa provetta da centrifuga da cinque millilitri.
Porre i campioni eluiti in un concentratore di vuoto fino a quando non sono asciutti. Quindi conservare i peptidi secchi a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. L'analisi qualitativa dei campioni di peptidi da cellule RAW 264.7 è stata effettuata con SDS-PAGE, in cui i campioni sono stati confrontati determinando diversi livelli di ossidazione dovuti ai trattamenti.
Le proteine separate sono state successivamente sondate da western blot per studiare ulteriormente i livelli di ossidazione delle singole proteine. Le intensità ioniche riportate dei peptidi contenenti cistina sono state analizzate mediante spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida. Sono state quantificate la stechiometria di ossidazione tiolica di iTRAQ, peptidi arricchiti e ossidati marcati a livello di sito di cistina.
Rimuovere con cura l'acetone senza disturbare il pellet proteico. Assicurarsi che il pellet proteico sia completamente solubilizzato e quantificato con precisione e che la resina sia accuratamente assegnata alle colonne di rotazione. Assicurarsi di risospendere la resina durante le fasi di lavaggio.
Un'ulteriore valutazione di proteine e peptidi arricchiti può essere eseguita mediante SDS-PAGE e colorazione, western blotting e spettrometria di massa.
