Ringraziamo T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut e I. Shestopalov per le discussioni. Supportato da parte dell&#39;Agenzia di Scienza, Tecnologia e Ricerca di Singapore (CC), NIH R01-R01-CA118750 e HG004361 (HYC), e la California Institute for Regenerative Medicine (HYC). HYC è uno scienziato inizi della carriera del Howard Hughes Medical Institute.

1. Sonda di progettazione Design anti-senso DNA piastrellatura sonde per il recupero selettivo di RNA bersaglio CHIRP. <ol><li> Progettazione anti-senso sonde oligo con il progettista in linea sonda <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Utilizzare questi parametri: numero di sonde sonda = 1/100 bp di lunghezza RNA, 2) sulla destinazione GC = 45; 3) la durata oligonucleotide = 20; 4) Lunghezza distanza = 60-80. Rompere RNA in segmenti, se troppo a lungo per il progettista. Omettere regioni di ripetizioni o di una ampia omologia. </li><li> Ordina anti-senso sonde di DNA con BiotinTEG a 3-prime. </li><li> Sonde etichetta secondo le loro posizioni lungo l&#39;RNA. Separarli in due gruppi in modo che il pool di &quot;anche&quot; contiene tutte le sonde di numerazione 2, 4, 6, ecc e la piscina &quot;dispari&quot; contiene sonde di numerazione 1, 3, 5, ecc Diluire pool di sonde a 100 micrometri e la concentrazione conservare a -20 ° C. </li><li> Tutti gli esperimenti devono essere eseguite usandoentrambe le piscine, che servono come controlli interni per l&#39;altro. Reale RNA-dipendente segnale sarebbe presente da entrambe le piscine, mentre la sonda specifici rumori sarebbe unico per ogni pool. Questo vale sia per CHIRP-qPCR e CHIRP-seq. </li></ol> 2. Raccogliere cellule Raccogliere cellule che verranno utilizzati per l&#39;esperimento CHIRP. <ol><li> Coltivare cellule in piastre di coltura di tessuto o di palloni confluenza. Risciacquo con tampone fosfato salino (PBS) e una volta Tripsinizzare. Quench tripsina con volume&gt; 2x dei mezzi di comunicazione, pipetta su e giù per staccare le cellule e risospendere in sospensione singola cella. Trasferire tutti i media e le cellule risospese in 50 ml provette Falcon. 20 milioni di cellule sono in genere sufficienti per un campione CHIRP. </li><li> Spin cellule a 800RCF per 4 min. Aspirare il terreno e risospendere 40 milioni di cellule in 40 ml di PBS, unire tubi se necessario. Spin cellule a 800RCF per 4 min. Decantare PBS, aspirare accuratamente in un angolo il liquido rimanente. </li></ol&gt; 3. Cross-Link Cells e raccogliere pellet cellulare Crosslink raccolte le cellule con glutaraldeide per preservare le interazioni RNA-cromatina e preparare pellet di cellule. <ol><li> Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente. </li><li> Preparare glutaraldeide 1% in PBS temperatura ambiente. Preparare 10 ml per 10 milioni di cellule (0,4 mL magazzino glutaraldeide 25% + 9,6 mL PBS). Glutaraldeide deve essere usato fresco. </li><li> Toccare fondo di tubi Falcon per rimuovere pellets. Risospendere il pellet cellulare in 1% glutaraldeide, a partire da un piccolo volume per evitare blocchi, poi ricaricare fino a tutto volume. Capovolgere. Crosslink per 10 minuti a temperatura ambiente su un end-to-end shaker o dei rotatori. </li><li> Raffreddare bruscamente la reazione di reticolazione con volume 1/10th di 1,25 M glicina a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Spin a 2000RCF per 5 min. Aspirare il surnatante e pellet lavaggio con 20 mL PBS volta raffreddato, filatura a 2000RCF per 5 min. </li><li> Aspirare e risospendere il wincenerito, cross-linked pellet con 1 ml di PBS refrigerata per 20 milioni di cellule. Trasferire ogni ml di una provetta Eppendorf e centrifugare a 2000RCF per 3 min a 4 ° C. Rimuovere il più possibile con PBS punta della pipetta accuratamente. </li><li> Flash-congelare i pellet cellulari in azoto liquido e conservare a -80 ° C a tempo indeterminato. </li></ol> 4. Lisi cellulare Lisare cellule reticolati per preparare lisato cellulare. <ol><li> Scongelare pellet cellulari surgelati a temperatura ambiente. Toccare difficili da rimuovere e miscelare il pellet di cellule. Rallenta il pellet a 2000RCF per 3 min a 4 ° C. Utilizzare una forte punta di 10 microlitri pipetta per rimuovere ogni residuo PBS. </li><li> Su una bilancia elettronica (precisione di 1mg) tarare la massa di un tubo vuoto Eppendorf (i nostri tubi pesano 1.060 grammi molto coerente). Pesare ciascuna pellet e registrare il suo peso. Un piatto completo di 15 cm di cellule HeLa reticolati pesa in genere 100 mg. </li><li> Supplemento Lysis Buffer (10 volte la massa di pellet, ad esempio, 1 ml per 100 mg) con Fresh inibitore della proteasi, PMSF e Superase-in (vedi elenco allegato buffer). Mescolare bene. </li><li> Aggiungi 10X tampone di lisi del volume integrata in ogni provetta e risospendere il pellet. Per le piccole palline &lt;25 mg, risospendere in 250 microlitri di buffer di lisi integrato. Sospensione deve essere liscia. In caso contrario, dividere la sospensione in 500 pl aliquote e utilizzare un mixer motorizzato pellet per rompere grumi. Procedere immediatamente a sonicazione. </li></ol> 5. Sonicazione Shear DNA da lisati cellulari sonicazione reticolati. <ol><li> Sonicare lisato cellulare in Bioruptor in 15 ml provette Falcon. Utilizzare &lt;1,5 ml di lisato in ciascuna provetta, e per una più rapida sonicazione, sonicare non più di due tubi per volta. </li><li> Sottoporre ad ultrasuoni in un bagno di acqua 4 ° C alla massima impostazione con 30 secondi, 45 secondi OFF intervalli di impulso. Controllare lisato ogni 30 min. Continuare sonicazione finché il lisato cellulare è più torbida. Questa operazione potrebbe richiedere un minimo di 30 min e fino a 4 ore. Il numerodi tubi, il volume del campione, la temperatura del bagno, e il periodo di tempo sonicazione che influenzano la durata del processo richiede. Tubi probabilmente ultrasuoni a velocità differenti, in modo da mettere in comune tra loro ogni 30 min e ridistribuire in tubi originali per assicurare l&#39;omogeneità. Nota: glutaraldeide-reticolato cellule richiedere molto più tempo per sonicare equivalenti di formaldeide. </li><li> Quando lisato diventa chiaro, cedere il 5 ul lisato in una nuova provetta Eppendorf. Aggiungere 90 ul DNA proteasi K (PK) Buffer (vedi elenco buffer) e 5 PK ul. Vortex per miscelare e centrifugare brevemente. Incubare per 45 min a 50 ° C. </li><li> Estrarre DNA con il kit di purificazione PCR Qiagen. DNA Eluire in 30 microlitri Buffer Elution Qiagen (EB) e controllare le dimensioni del DNA su gel di agarosio 1%. Se massa della striscio DNA è 100-500 bp, sonicazione è completa. In caso contrario, continuano ad ultrasuoni. </li><li> Centrifugare i campioni sonicati a 16100RCF per 10 minuti a 4 ° C. Combina surnatanti, le aliquote in 1 ml di campioni e flash-congelamento in azoto, liquidon. Conservare a -80 ° C. </li></ol> 6. CHIRP Ibridano sonde di DNA a RNA biotinilati e isolare cromatina legata. <ol><li> Scongelare i tubi della cromatina a temperatura ambiente. </li><li> Preparare il tampone di ibridazione (vedi elenco buffer, preparare 2 ml per ml della cromatina). Vortex per mescolare. </li><li> Per un esempio tipico CHIRP utilizzando 1 ml di lisato, 10 L per rimuovere INPUT RNA e 10 L per INPUT DNA e posto in provette Eppendorf. Tenere in ghiaccio fino al successivo utilizzo. </li><li> Trasferire 1 cromatina mL a 15 mL provetta Falcon. Aggiungere 2 Tampone di ibridazione mL in ciascun tubo. Per volume totale &lt;1,5 ml, utilizzare provette Eppendorf. </li><li> Scongelare sonde a temperatura ambiente. NanoDrop sonde per controllare importo, se non lo avete utilizzato in un tempo lungo (100 sonde pM dovrebbe spec ~ 500-600 ng / ul utilizzando singola impostazione filamento di DNA). Aggiungere il volume appropriato di sonde per tubi specifici (sonda 100 pmol per 1 mL cromatina, 1 ml di 100 pmol / ul sonda per 1 mL cromatina).Mescolare bene. Incubare a 37 ° C per 4 ore con agitazione. </li><li> Con 20 min rimanente per ibridazione, preparare le perline magnetiche C-1 (conservato a 4 ° C). Utilizzare 100 pl per 100 pmol di sonde. Lavare con 1 mL di tampone di lisi senza supplementi per tre volte, utilizzando il DynaMag-2 striscia magnetica di perline separate da buffer. </li><li> Risospendere le sfere in volume originale di tampone di lisi e Supplemento fresca PMSF, PI e Superase-in. Dopo 4 ore reazione di ibridazione è completa, aggiungere 100 microlitri perline in ciascun tubo. Mescolare bene. Incubare a 37 ° C per 30 minuti con agitazione. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio (5 mL per campione). Vortex per mescolare. Pre-riscaldare a 37 ° C. Aggiungere PMSF prima dell&#39;uso. </li><li> Lavare perline con 1 mL di tampone di lavaggio cinque volte. Al primo lavaggio, utilizzare DynaMag-15 nastro magnetico a grani separati, decantare, e risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio. Trasferire il volume di 1,5 ml provetta Eppendorf. Incubare a 37 ° C con agitazione per 5 min. </li><li> Il lavaggi successivi, spin down ogni tubo su un minicentrifuge, Set di prova sulla DynaMag-2 striscia magnetica per 1 min. Campione di decantare, asciugare eventuali gocce con un Kimwipe, risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio. Incubare a 37 ° C con agitazione per 5 min. Ripetere l&#39;operazione per cinque lavaggi totali. </li><li> In ultimo lavaggio, risospendere le sfere bene. Togliere 100 pl e mettere da parte per l&#39;isolamento di RNA. Riserva 900 microlitri per frazione di DNA. Posizionare tutte le provette su DynaMag-2 banda magnetica e rimuovere il tampone di lavaggio. Centrifugare tutte le provette premuto brevemente, metterli su striscia magnetica. Rimuovere l&#39;ultimo bit di tampone di lavaggio completamente con un netto 10 puntale ul. </li></ol> 7. RNA isolamento Estratto frazione di RNA da campioni CHIRP per quantificare da qRT-PCR. <ol><li> Prendete 100 campioni ul tallone e 10 L campione di input RNA. Aggiungere 85 ul RNA PK Buffer pH 7,0 a RNA INPUT. Risospendere le sfere in 95 microlitri di buffer pH 7,0 RNA PK. Aggiungere 5 K ul Proteinease e incubare a 50 ° C per 45 min con end-to-end agitazione. </li><li> In breve lo spin-down tutti i tubi ecampioni bollire per 10 min in blocco di calore a 95 ° C. </li><li> Raffreddare i campioni sul ghiaccio, aggiungere 500 microlitri TRIzol, mescolare vigorosamente nel vortex per 10 sec. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. Conservare a -80 ° C o di procedere al punto 4. </li><li> Aggiungere 100 ul al cloroformio Trizol campioni trattati. Energicamente per 10 sec. Spin a 16100RCF su una centrifuga da banco per 15 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere ~ 400 microlitri surnatante acquoso, evitando organico e interfaccia. </li><li> Aggiungere 600 microlitri (1,5 volume) 100% di etanolo e mescolare bene. Spin campione attraverso MIRNeasy colonne mini. Lavare 1x RWT (MIRNeasy mini kit), 2x con RPE al protocollo del produttore. Eluire con 30 microlitri priva di nucleasi H 2 O (NFH 2 O). </li><li> Trattare l&#39;eluato RNA con DNA-free per protocollo del produttore. Dopo la reazione è completa, riscaldare il campione per 15 minuti a 65 ° C per inattivare completamente qualsiasi residuo DNasi. </li><li> Utilizzare 1 RNA ul isolato per bene per qRT-PCR per confermare lncRNArecupero. GAPDH viene spesso utilizzato come controllo negativo. </li></ol> 8. DNA Isolation Estratto frazione di DNA da campioni CHIRP mediante sequenziamento per identificare o quantificare da qPCR. <ol><li> Preparare il tampone di eluizione del DNA (vedi elenco buffer), 150 ml per campione, con ingresso DNA. </li><li> Aggiungere 1 0μL RNasi A (10 mg / ml) e 10 L RNasi H (10 U / pl) per ml di tampone di eluizione DNA, e vortex per miscelare. </li><li> Risospendere ogni campione di perle in 150 microlitri di tampone di eluizione del DNA con RNasi. (DNA INPUT risospendere in 140 pl) incubare a 37 ° C per 30 minuti con agitazione. </li><li> Perle separate e il surnatante DynaMag-2 striscia magnetica. Rimuovere il surnatante e aggiungere ai tubi etichettati. </li><li> Preparare una seconda aliquota di tampone di DNA eluizione con 10 L RNasi A (10 mg / mL) e RNaseH (10 U / mL) esattamente come fatto in 8,2). Aggiungere 150 ul di ogni campione (comprese INPUT DNA), incubare e rimuovere il surnatante. Raccogliere tutte le surnatante (spallad essere ~ 300 mL). </li><li> Aggiungere 15 PK ul a ciascun campione. Incubare a 50 ° C per 45 minuti con agitazione. </li><li> Pre-spin down giallo phase-lock tubi di gel (5PRIME). Trasferimento campioni di DNA di phase-lock tubi di gel, e aggiungere 300 ml PhOH: Cloroformio: isoamile per campione. Agitare vigorosamente per 10 min, e girare su una centrifuga da banco a 16100RCF per 5 min a 4 ° C. Prendere acquoso dalla parte superiore (~ 300 pl). Aggiungere 3 GlycoBlue uL, NaOAc 30 uL, e 900 microlitri EtOH 100%. Mescolare bene e conservare a -20 ° C per una notte. </li><li> Spin campioni a 16100RCF per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante con cura. Aggiungere 1 ml di EtOH 70% e vortex per miscelare. Spin a 16100RCF per 5 min. Rimuovere il surnatante con la pipetta. Lasciare asciugare all&#39;aria per 1min. Risospendere in 30 ul EB. </li><li> Campioni di DNA sono pronti per l&#39;analisi mediante qPCR o nella preparazione di high-throughput sequencing librerie per protocollo Illumina. </li></ol> 10. Risultati rappresentativi Figura 1 </strong&gt; descrive il flusso di lavoro CHIRP. Un esperimento CHIRP successo arricchisce tipicamente RNA bersaglio significativamente nel non-specifici RNA. Figura 2 mostra arricchimento della telomerasi RNA umano (TERC) da cellule HeLa oltre GAPDH, un RNA abbondanti cellulari che serve come controllo negativo. La maggior parte degli RNA TERC (~ 88%) presenti nella cellula sono state abbattute eseguendo CHIRP, mentre solo il 0,46% del GAPDH RNA è stato recuperato, dimostrando un fattore di arricchimento di circa 200 volte. Le sonde non specifici quali sonde di targeting LacZ RNA, che non è espressa in cellule di mammifero (Figura 2), può essere usato come addizionali controlli negativi. Regioni di DNA prevede di impegnare la lncRNA destinazione sono in genere arricchiti sulle regioni negativi quando misurata dal qPCR. La figura 3 mostra la convalida qPCR di quattro Hotair-bound siti primari fibroblasti del prepuzio umano che siamo determinati eseguendo CHIRP-seq nella linea stessa cella, mentre TERC e GAPDH DNA siti di sérve come regioni di controllo negativo. Sia &quot;anche&quot; e la sonda &quot;dispari&quot; imposta arricchimento prodotto comparabile attesi Hotair-bound siti su regioni negativi, un segno distintivo di veri lncRNA siti di legame. High-throughput sequenziamento del DNA CHIRP arricchito produce una mappa globale di lncRNA siti di legame. La Drosophila lncRNA roX2 è noto per interagire con il cromosoma X in un modo che è necessaria la compensazione del dosaggio. Figura 4 mostra roX2 profilo di legame su una sezione del cromosoma X. Sia &quot;anche&quot; e &quot;dispari&quot; i campioni sono stati sequenziati e le loro unici rumori sono stati eliminati per produrre una traccia di segnali sovrapposti. Ogni &quot;picco&quot; indica qui un sito di forte roX2 vincolante. La pista e la lista delle roX2 geni bersaglio sono stati descritti in Chu et al. 2011 17. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso della procedura CHIRPdure. La cromatina è reticolata ad lncRNA: addotti proteici in vivo Biotinylated sonde piastrelle sono ibridate per indirizzare lncRNA e complessi della cromatina sono purificati utilizzando perline streptavidina magnetici, seguiti da lavaggi stringenti.. Noi eluire DNA legato lncRNA o proteine, con un cocktail di RNasi A e H. è schematizzata Una sequenza putativa lncRNA vincolante in arancione. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Figura 2. Arricchisce CHIRP per l&#39;uomo TERC RNA. TERC-asDNA sonde recuperare ~ 88% dei cellulari TERC RNA non rilevabile e GAPDH. LacZ-asDNA sonde vengono utilizzati come controlli negativi e recuperare né RNA. Media + sd vengono visualizzati. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Figura 3. Hotair CHIRP-qPCR in umana primaria perfibroblasti Eskin. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 e ABCA2 sono regioni che interagiscono con Hotair. TERC e GAPDH serviti come controlli negativi. Media + sd vengono visualizzati. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Figura 4. CHIRP-seguenti dati di roX2 SL2 RNA in cellule di Drosophila. &quot;Anche&quot; e &quot;dispari&quot; sono stati sequenziati separatamente, i loro dati si fondono in modo da riflettere solo picchi comuni in entrambi. La pista è mostrato unito. Precedentemente pubblicato in Chu et al. 2011 17.

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C. Chu e HY Chang sono denominati come inventori su una domanda di brevetto basato su questo metodo.

Qui abbiamo descritto CHIRP-seq, un metodo di mappatura in vivo i siti di legame lncRNA genome-wide. I parametri chiave per il successo sono le piscine separate di piastrelle sonde oligonucleotidiche e reticolazione glutaraldeide. Il disegno di sonde per affinità è semplice data la sequenza di RNA e non richiede alcuna conoscenza preventiva della struttura del RNA o domini funzionali. Il nostro successo con roX2, TERC e Hotair - tre RNA piuttosto differenti in due specie - suggerisce che CHIRP-seq è probabile generalizzabile a molte lncRNAs. Come per tutti gli esperimenti, i controlli per la cura e propria sono tenuti a interpretare i risultati. LncRNA diversi possono richiedere la titolazione delle condizioni, giudizioso e il cambiamento delle condizioni, come la selezione di sonde affinità diverse o reticolanti, può mettere in luce aspetti diversi di interazioni RNA-cromatina. Come ChIP-seq, non tutti gli eventi vincolanti sono necessariamente funzionali, e sono necessari ulteriori studi per accertare le conseguenze biologiche di RNA occupancy sulla cromatina. Tuttavia, si prevede molte interessanti applicazioni di questa tecnologia per i ricercatori di altri cromatina associate lncRNAs, che ora si contano a migliaia 8,9. Proprio come ChIP-seq ha aperto la porta per la genome-wide esplorazioni di interazioni proteina-DNA, CHIRP-seq studi della &quot;RNA interattoma&quot; può rivelare molte nuove vie della biologia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Buffer List:</td></tr><tr><td colspan="4">Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Lysis Buffer:</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;10 mM EDTA&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads</td></tr><tr><td colspan="4">Proteinase K Buffer (for DNA)</td></tr><tr><td colspan="4">100 mM NaCl&lt;br/&gt;10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use</td></tr><tr><td colspan="4">Hybridization Buffer</td></tr><tr><td colspan="4">750 mM NaCl&lt;br/&gt;1% SDS&lt;br/&gt;50 mM Tris-Cl pH 7.0&lt;br/&gt;1 mM EDTA&lt;br/&gt;15% formamide (store in the dark at 4 &amp;deg;C)&lt;br/&gt;Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use</td></tr><tr><td colspan="4">Wash Buffer</td></tr><tr><td colspan="4">2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)&lt;br/&gt;0.5% SDS&lt;br/&gt;Always add PMSF fresh before use</td></tr><tr><td colspan="4">DNA elution Buffer</td></tr><tr><td colspan="4">50 mM NaHCO3&lt;br/&gt;1% SDS</td></tr><tr><td colspan="4">Table of specific reagents and equipment:</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (EM grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10x10ml</td><td></td></tr><tr><td>Motorized pellet mixer</td><td>VWR international</td><td>V8185-904</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Roche Group</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Superase-in</td><td>Ambion</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696&quot;&gt;AM2696&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes (for sonication)</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>C-1 magnetic beads</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15 magnet</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>MIRNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>R0601K</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy</td><td>5 PRIME</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Ricca</td><td>RSOC0020-1C</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>JT Baker</td><td>4057-06</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Elution Buffer (EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-027</td><td></td></tr><tr><td>DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Buffer kit</td><td>Ambion</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>15515-026</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin isolation by rna purification (chirp)

RNA non codificanti lunghi sono regolatori chiave degli Stati cromatina per importanti processi biologici quali la compensazione del dosaggio, imprinting, e l&#39;espressione genica di sviluppo 1,2,3,4,5,6,7. La recente scoperta di migliaia di lncRNAs in associazione con specifici complessi di modifica della cromatina, come Polycomb Complex repressiva 2 (PRC2) che media l&#39;istone H3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3), suggerisce i ruoli di massima per la gestione lncRNAs numerosi stati della cromatina in un gene specifico moda 8,9. Mentre alcuni lncRNAs sono pensati per lavorare in cis sui geni vicini, lncRNAs altri lavorano in trans per regolare i geni si trovano lontano. Per esempio, Drosophila lncRNAs roX1 e roX2 legano numerose regioni del cromosoma X delle cellule maschili, e sono fondamentali per la compensazione del dosaggio 10,11. Tuttavia, le posizioni esatte dei loro siti di legame non sono note ad alta risoluzione. Allo stesso modo, umano lncRNA Hotair può influire sulla occupazione PRC2 hundreds di geni genoma 3,12,13, ma come specificità si ottiene non è chiaro. LncRNAs può anche servire come strutture modulari di assumere l&#39;assemblaggio di complessi proteici multipli. Il classico trans-agente RNA scaffold è il TERC RNA che serve come modello e scaffold per la telomerasi complesso 14; Hotair può anche servire come impalcatura per PRC2 e H3K4 demetilasi complesso 13. Precedenti studi di mappatura occupazione RNA a cromatina hanno rivelato notevoli intuizioni 15,16, ma solo in un locus singolo gene alla volta. I siti di occupazione della maggior parte dei lncRNAs non sono noti, ei ruoli dei lncRNAs nella regolazione della cromatina sono stati in gran parte dedotta dagli effetti indiretti della perturbazione lncRNA. Proprio come immunoprecipitazione della cromatina seguita da microarray o sequenziamento profondo (ChIP-chip o ChIP-seq, rispettivamente) ha notevolmente migliorato la nostra comprensione di interazioni proteina-DNA su scala genomica, qui illustrare un RecenTLY pubblicato strategia per mappare lunga occupazione RNA genome-wide ad alta risoluzione 17. Questo, Isolamento metodo cromatina di purificazione dell&#39;RNA (CHIRP) (Figura 1), si basa sulla cattura affinità di bersaglio lncRNA: complesso cromatina allineando-oligo antisenso, che genera un mappa genomica di siti di legame ad una risoluzione di diverse centinaia di basi con alta sensibilità e basso background. CHIRP è applicabile a molti lncRNAs perché il progetto di affinità sonde è semplice data la sequenza di RNA e non richiede alcuna conoscenza della struttura del RNA o domini funzionali.

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Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

CHIRP è una tecnica innovativa e rapida mappa genomica siti di legame di RNA non codificanti lunghi (lncRNAs). Il metodo sfrutta la specificità di oligonucleotidi anti-senso di affiancamento per consentire l&#39;enumerazione di lncRNA-bound siti genomici.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

86.2K Views.  Stanford University School of Medicine. CHIRP è una tecnica innovativa e rapida mappa genomica siti di legame di RNA non codificanti lunghi (lncRNAs). Il metodo sfrutta la specificità di oligonucleotidi anti-senso di affiancamento per consentire l'enumerazione di lncRNA-bound siti genomici.

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Ricerca

Genetica

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Biologia

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

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