Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH CA141009 e GM39067. Ringraziamo E. Parnell e R. Yarrington per i commenti sulla parte scritta.

1. Isolamento del mouse CD4 naïve splenica cellule T <ol><li> Sacrifica il mouse in maniera umana coerente con Institutional Animal Care e utilizzo Comitato protocolli (IACUC). Sezionare la milza e posizionarlo nella capsula di Petri contenente 10 ml di DMEM con 10% FBS. </li><li> Schiacciare la milza con estremità glassati di due vetrini per liberare le splenociti. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg (~ 1.200 rpm per una centrifuga clinica con un diametro tipico rotore) per 5 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 2 ml di tampone di lisi ACK globuli rossi, 1 min a temperatura ambiente (RT). Arrestare la reazione aggiungendo 8 ml di DMEM con FBS. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 5 ml di DMEM contenente FBS e passare attraverso un filtro a maglia di 70 micron (BD Falcon, Cat # 352350). Contare le cellule e procedereper l&#39;isolamento di cellule CD4 T naive CD4 cellule utilizzando un kit di isolamento (Miltenyi, Cat # 130-095-248) utilizzando le istruzioni del produttore. Raccogliere le cellule T CD4 naive per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in 10 ml di DMEM con FBS. </li></ol> 2. Preparazione della cromatina <ol><li> Aggiungere 37% di formaldeide ad una concentrazione finale di 1% alla sospensione cellulare in DMEM e agitare delicatamente a TA (esempio usando un nutator) per 15 min di cross-link DNA: complessi proteici. </li><li> Arrestare reticolazione aggiungendo 1 M glicina ad una concentrazione finale di 125 mM. Continuare al rock per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule da risospendere in 5 ml di ghiacciata PBS contenenti inibitori della proteasi. Lavare in PBS freddo inibitori della proteasi contenenti totale 3 volte e raccogliere le cellule per centrifugazione a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 1 mltampone ghiacciato lisi cellulare contenente inibitori di proteasi. Incubare in ghiaccio per 15 min. L&#39;efficienza di lisi cellulare può essere determinato da risospendere una piccola aliquota di cellule in soluzione 0,4% trypan blue (Sigma, Cat. # T8154) e osservando con un microscopio. </li><li> Raccogliere i nuclei mediante centrifugazione a 200 xg (tipicamente ~ 1.200 rpm) per 5 min a 4 ° C. Scartare con attenzione il surnatante. </li><li> Risospendere i nuclei in 500 microlitri di tampone di lisi contenente inibitori delle proteasi nucleare. Incubare in ghiaccio per 15 min. </li><li> Sonicare le cellule utilizzando un Sonicator Misonix 3000, sonda formato 1.6 mm: Livello di uscita 4, 15 sec scoppio, 4 volte su ghiaccio. Ogni campione deve essere raffreddato in ghiaccio per 1-2 min prima sonicating nuovamente per evitare il surriscaldamento dei campioni. Il surriscaldamento può causare l&#39;inversione dei collegamenti trasversali. </li><li> Centrifugare la cromatina sonicato a 16.000 g (circa 13.200 rpm in una microcentrifuga) per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Prendete un 20 microlitri aliquota di chiara supernatant, aggiungere DNA colorante carico e controllare il DNA sonicato tramite elettroforesi su gel di agarosio al 2% (dimensione ideale del DNA sonicato per la maggior parte delle applicazioni è 200-500 bp). </li><li> Determinare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro UV. Cromatina tosata può essere utilizzato immediatamente per impostare reazione cromatina immunoprecipitazione o conservato a -80 ° C. Tipicamente si ottiene 7,5-10 DNA mcg 2-3 x 10 6 cellule T CD4 purificate per topo. </li></ol> 3. Immunoprecipitazione della cromatina (Tutte le operazioni devono essere effettuate a 0-4 ° C) <ol><li> Diluire cromatina sonicato ad una concentrazione di DNA ug / ml 5-10 (volume totale = 1 ml) in tampone di diluizione chip con inibitori della proteasi. </li><li> Salvare 100 microlitri (10%) come input. Conservare in ghiaccio. </li><li> Aliquota 450 ml ciascuno in due 1,7 ml provette per microcentrifuga con etichetta come controllo isotipico (mouse o coniglio IgG) e anticorpi di interesse. Se vengono utilizzate più anticorpi dello stesso isotipo, un singolo contr isotipoolo sarà sufficiente effettuare questa analisi. Avrete bisogno di più controlli isotipo se vengono utilizzati gli anticorpi di origine animale o isotipo diverso. </li><li> Aggiungere 2-5 mg di anticorpo specifico, a seconda della specificità dell&#39;anticorpo utilizzato o controllo isotipico alle rispettive provette. </li><li> Roccia i tubi usando una nutator notte a 4 ° C per permettere la formazione di complessi cromatina-anticorpo. </li><li> Aggiungere 25 ml di proteina G biglie magnetiche (01:01 slurry di perline in sospensione) alla miscela sopra e permettere al rock per almeno 2 ore a 4 ° C. Perline da nostro fornitore possono essere utilizzati direttamente. </li><li> Posizionare i tubi microcentrifuga su un supporto magnetico e consentono di raccogliere le perline sul lato magnetizzato. </li><li> Rimuovere con cura la soluzione per aspirazione senza disturbare le perline. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione a basso sale lavare e far oscillare delicatamente per 5 minuti su una nutator. Raccogliere le perle utilizzando un supporto magnetico e rimuovere la soluzione di lavaggio. Ripetere una volta.</li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di alto sale lavare e consentire al rock per 5 minuti su una nutator. Raccogliere le perline utilizzando il supporto magnetico e rimuovere la soluzione di lavaggio. Ripetere una volta. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di lavaggio cloruro di litio e consentire al rock per 5 minuti su una nutator. Raccogliere le perline utilizzando il supporto magnetico e rimuovere la soluzione di lavaggio. Ripetere una volta. L&#39;uso di LiCl migliora l&#39;effettiva rimozione di interazioni cromatina non specifiche con le perline. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di TE e consentire al rock per 5 minuti su una nutator. Raccogliere le perline utilizzando il supporto magnetico e rimuovere la soluzione di lavaggio. </li><li> Eluire il DNA dalle perline aggiungendo 250 microlitri di tampone di eluizione. Roccia per 15 minuti a temperatura ambiente. Pipettare off l&#39;eluato e salvare questo materiale in un nuovo 1,7 ml microcentrifuga. Ripetere ancora una volta e di combinare entrambi i eluizioni. Scartare le perline. </li><li> Per invertire i legami incrociati aggiungono 5 M NaCl ad una concentrazione finale di 0,3 M e 1 ml di RNase A (20 m<html> g / ml) per il DNA eluito. Aggiungere 400 microlitri di tampone di eluizione agli ingressi salvate nel passo 3.2, per fare un volume 500 microlitri. Agli ingressi aggiungere NaCl allo 0,3 M, 1 ml di RNasi A, 10 ml di 0,5 M EDTA, 20 ml di 1 M Tris-HCl pH 6.5 e 1 ml di proteinasi K (20 mg / ml). </li><li> Incubare le provette notte a 65 ° C in un blocco di riscaldamento a secco. Per evitare l&#39;evaporazione di campioni, sigillo o posizionare un peso sui tubi per impedire loro di apertura. Un forno di ibridazione può anche essere usato. </li><li> Lasciate raffreddare le provette a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100% e incubare 2 hr-notte a -80 ° C al DNA precipitato. </li><li> Centrifugare le provette a 16.000 xg per 15 min a pellet il DNA. Lavare il pellet di DNA una volta che con il 70% di etanolo e asciugare il pellet. Risospendere il pellet di DNA in 100 ml di acqua distillata autoclavato. </li><li> Purificare DNA usando Qiaquick spin column ed eluire in volume totale di 50 microlitri di tampone di eluizione. Questo DNA è pronto all&#39;uso per la PCR. </li></ol>&quot;&gt; 4. Preparazione della reazione PCR (Tutte le operazioni devono essere eseguite su ghiaccio) <ol><li> Raccogliere tutti i campioni di DNA da campioni di chip di ingresso e corrispondenti. Inoltre, raccogliere tutti i reagenti PCR e primer per regione mirata e una regione di controllo. Utilizzare un &quot;hotstart&quot; Taq DNA polimerasi. Useremo un saggio di verde a base di SYBR per quantificare l&#39;amplificazione del DNA in questa procedura, ma i kit qPCR MasterMix può essere utilizzato se necessario. </li><li> Effettuare una diluizione seriale di DNA input per generare una curva standard nell&#39;analisi qPCR: per esempio 10%, 1%, 0,1% e 0,01% in tampone di eluizione (dalle colonne di spin QIAquick a passo 3.18). L&#39;intervallo di concentrazione e di incremento di questo modello di set di curva standard possono variare in base ai livelli attesi di arricchimento di chip, ecc Dispensare 10 ml di campioni di DNA di ingresso nella rispettivi pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (Genemate, cat # T-3182-1 ), in duplice copia. </li><li> Pipettare 10 ml DNA chip dal controllo isotipico, così come anticorpo specifico nella rispettivapozzi, in triplice copia. </li><li> Fare un &quot;master mix&quot; che contiene sia primer bersaglio o primer di controllo (0.1 mM concentrazione finale di ciascun primer) ed erogare 10 microlitri in rispettivi pozzetti. Per esempio, nel modello di seguito dispensare Master Mix-primer contenente mirate nei pozzi marcato verde e dispensare master mix con primer di controllo in pozzetti contrassegnato rosso. </li><li> Coprire la piastra PCR con ottica film plastico e centrifugare a 500 xg in una centrifuga clinica (~ 1.200 rpm) per 1 min a RT per raccogliere tutto al fondo del pozzo. </li><li> Avviare la reazione di PCR. Useremo il LightCycler 480 II (Roche) operativo LightCycler 480SW 1.5 del software per eseguire il qPCR in questo esempio. </li></ol> Pre-incubazione: 1 ciclo: 95 ° C / 5 min. Amplificazione: 40-45 cicli: 94 ° C / 5 sec, 60 ° C / 5 sec, 72 ° C/10 sec (ricottura temperatura dovrebbe essere di 2-3 ° C inferiore alla temperatur fusionee dei primer). Curva di fusione: 1 ciclo. Raffreddamento: 1 ciclo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 10% Input </td><td> 10% Input </td><td> Isotipo </td><td> Specifico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1% Input </td><td> 1% Input </td><td> Isotipo </td><td> Specifico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C </td><td> 0,1% Input </td><td> 0,1% Input </td><td> Isotipo </td><td> Specifico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td> 0,01% Input </td><td> 0,01% Input </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10% Input </td><td> 10% Input </td><td> Isotipo </td><td> Specifico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td> 1% Input </td><td> 1% Input </td><td> Isotipo </td><td> Specifico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td> 0,1% Input </td><td> 0,1% Input </td><td> Isotipo </td><td> Specifico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> 0,01% Input </td><td> 0,01% Input </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Verde: Utilizzare regione primer mirati. Rosso: Utilizzare il controllo regione primer. 5. Analisi <ol><li> Programmare il software qPCR per la quantificazione della quantità assoluta di DNA. Importante, l&#39;uso di una curva standard per interpolare i valori di DNA nei campioni specifici e isotipo sconosciuti consente la valutazione e la congruenza della qualità e l&#39;efficienza di tutti Primer tramonta oltre l&#39;intervallo di concentrazioni riscontrate nei campioni. Inoltre, fornisce anche una more affidabile metodo per convertire i valori Cq (C t o C p) ai risultati di arricchimento volte rispetto finali di usingΔΔCq e relativi metodi. </li><li> Andare all&#39;editor campione e segnare i pozzetti contenenti campioni di ingresso di varie diluizioni (10%, 1%, 0,1% e 0,01%) con i loro valori della curva standard. Etichettare anche i pozzetti con campioni di chip sconosciuti, esattamente come la piastra PCR è disposto. Nel software equivalente utilizzato in altre macchine qPCR, designare sottoinsiemi, corrispondenti alle reazioni per ogni coppia di primer, valore curva standard e sperimentali e isotipo campione di controllo di conseguenza. </li><li> Nel software LightCycler, andare all&#39;editor sottoinsieme e segnare i sottoinsiemi tra cui i pozzetti con i campioni di ingresso, nonché i campioni di chip sconosciuti. I campioni sconosciuti saranno quantificati utilizzando la curva standard generata dalle concentrazioni note di campioni di ingresso per l&#39;analisi. Nel software equivalente utilizzato in altre macchine qPCR, designato sottoinsiemi corrisponding a tutte le reazioni per ogni coppie di primer. </li><li> Dopo l&#39;amplificazione PCR è completa, eseguire l&#39;analisi con &quot;Abs Quant/2nd Derivata Max&quot; e selezionare il sottoinsieme di analisi e premere il tasto OK. Nel software equivalente utilizzato in altre macchine qPCR, convertire il valore Cq alla quantità di DNA in ciascuna sezione. </li><li> Premere il tasto &quot;Calcola&quot; che genererà la curva standard utilizzando le concentrazioni note di campioni di ingresso e visualizza la quantità assoluta di DNA presente nei campioni sconosciuti. </li><li> Se la qualità del DNA tranciata è buona, e se i primer si legano specificamente alla regione mirata, efficienza della PCR dovrebbe essere vicino a 2. </li><li> Effettuare una analisi della curva di melting con &quot;Tm Calling&quot; per lo stesso sottoinsieme, se disponibile. Un picco singolo indica che solo un prodotto specifico è stato amplificato. L&#39;amplificazione di DNA specifica può essere provato elettroforesi il prodotto di PCR insieme con scaletta DNA attraverso un gel di agarosio. </li><li> Esportare i dati come una scheda-file di testo delimitato, che può essere aperto in Microsoft Excel per ulteriori analisi. </li><li> Utilizzo di Microsoft Excel, dividere la quantità di DNA per l&#39;anticorpo specifico con il controllo isotipico per fondi mirati. Ripetere questo passaggio per la Regione primer di controllo. Se più anticorpi dello stesso isotipo sono utilizzati per diverse immunoprecipitazione, normalizzare ciascuna di queste con i valori dello stesso isotipo di controllo. Inoltre, se si utilizzano più coppie di primer mirati, le quantità di DNA da un controllo singolo innesco pair set dovrebbero essere utilizzati per la normalizzazione di ciascun target (figure 1 e 2). I valori di uscita rappresentano lo specifico anticorpo immunoprecipitazione arricchimento piega in ogni posizione rispetto al non-specifico fondo immunoprecipitazione anticorpo. </li><li> Dividere l&#39;arricchimento piega (a isotipo di controllo) per i primer mirate con l&#39;arricchimento piega (a isotipo di controllo) per il controllo regione primer per ottenere l&#39;arricchimento rispetto ad unaregione non legato di controllo (Figura 1). È importante sottolineare che, notare che a causa della generazione di curve standard con il DNA totale di ingresso per ogni campione, ciascuno dei valori di cui sopra immunoprecipitazione interpolati dalle curve standard sono già normalizzato a, ed espressa come, la frazione del totale di ingresso dal software della macchina. </li><li> Se la severità delle buffer utilizzati per immunoprecipitazione o lavaggio è troppo alta, è possibile che l&#39;amplificazione robusta da campioni immunoprecipitati con anticorpi specifici sarà osservato, mentre l&#39;amplificazione dal controllo isotipico immunoprecipitato non saranno osservati campioni. In un tale scenario, è meglio sottrarre la quantità di chip di controllo isotipo da ChIP anticorpo specifico sia per la regione di destinazione e la regione non legato. Arricchimento relativa può essere calcolata dividendo la differenza per la regione di destinazione per differenza per regione non associato (Figura 3). </li></ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo di cui sopra fornisce un metodo robusto di quantificare con precisione l&#39;arricchimento del DNA da linfociti primari che utilizzano chip. Un importante motivo per la robustezza in questo protocollo è l&#39;inserimento di biologico replica. Il protocollo precedente utilizza tre repliche, l&#39;arricchimento per il quale viene calcolato in modo indipendente. Le uscite vengono quindi mediati per fornire un grado di arricchimento e deviazioni standard calcolate per fornire una misura della variabilità. Per ogni campione, tre repliche tecnico vengono eseguiti anche per eliminare variazione nella manipolazione dei campioni, amplificazione PCR, ecc La quantità di variazione nelle ripetizioni tecniche è in genere molto inferiore a quello osservato tra diversi campioni biologici. Una seconda ragione per robustezza è l&#39;inclusione di più controlli tecnici, compresi anticorpi isotipo-matched controllo, l&#39;uso di una curva standard di DNA di ingresso, e l&#39;uso di un amplicone di controllo corrispondente ad una regione genomica non specifico. <p class= &quot;&quot;&gt; Jove_content Limiti del metodo di cui sopra sono simili a quelle incontrate in genere utilizzando chip. Il metodo soffre alquanto scarsa risoluzione spaziale, il fattore limitante essendo la tranciatura di frammenti di DNA mediante sonicazione. Pertanto, il potere risolutivo del metodo è solo di circa 500 bp di DNA. Gli esperimenti che richiedono la risoluzione più alta possibile fare uso di nucleasi micrococcica digestione 8, o exonuclease digestione dei frammenti recuperati (ChIP-exo) 9,10. Inoltre, i preparativi ChIP sopra descritti accoppiato a high-throughput sequencing dei frammenti recuperati (ChIPseq, ChIP-seq o ChIP-Seq) 11,12 al posto di qPCR, produce un campionamento di diverso tranciati frammenti arricchiti, l&#39;intersezione dei quali possono essere preso come un luogo in buona fede di interazione. Tuttavia, il metodo qui presentato fornisce un modo affidabile di cura e precisione quantificando associazione DNA con fattori di trascrizione, componenti nucleosomi, modficati istoni e di altre proteine ​​in siti specifici di interesse.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-8775</td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30256.01</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor tablets</td>
 <td>Roche</td>
 <td>04693116001</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein G magnetic beads</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>101945</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase A (20 mg/ml)</td>
 <td>EMD Millipore</td>
 <td>556746</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K (20 mg/ml)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03115879001</td>
 <td>Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum Taq DNA Polymerase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10966-034</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Green I</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S7567</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Glycine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Prepare fresh</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Specific Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clay Adams Brand Nutator</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>Model: 421105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic Stand</td>
 <td>Promega</td>
 <td>Z5342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masonix Sonicator 3000</td>
 <td>QSonica</td>
 <td>Model: S3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Spectrophotometer</td>
 <td>NanoDrop Technologies</td>
 <td>ND-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13259-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>80085-692 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated bench top centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Model: Allegra X-12R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5415 D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Equipment </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un metodo ampiamente utilizzato per determinare le interazioni delle diverse proteine ​​con il DNA in cromatina delle cellule viventi. Gli esempi includono sequenza-specifici di DNA binding fattori di trascrizione, istoni ed i loro diversi stati di modifica, enzimi come la RNA polimerasi e fattori accessori e componenti di riparazione del DNA. Nonostante la sua ubiquità, vi è una mancanza di up-to-date, metodologie dettagliate per entrambi preparazione banco di materiale e per l&#39;analisi accurata permettendo metriche quantitative di interazione. A causa di questa mancanza di informazioni, e anche perché, come ogni immunoprecipitazione, le condizioni devono essere ri-ottimizzato per una nuova serie di condizioni sperimentali, il saggio di ChIP è suscettibile di risultati inesatti o mal quantitativa. Il nostro protocollo deriva in ultima analisi dal lavoro seminale sul fattore di trascrizione: interazioni DNA 1,2, ma incorpora una serie di miglioramenti per sensibività e riproducibilità per difficili da ottenere i tipi di cellule. Il protocollo è stato usato con successo 3,4, sia utilizzando qPCR per quantificare arricchimento DNA, oppure utilizzando una variante semi-quantitativa del sottostante protocollo. Questa analisi quantitativa di materiale amplificato per PCR viene eseguita computazionalmente, e rappresenta un fattore limitante nel saggio. Controlli importanti e altre considerazioni includono l&#39;uso di un anticorpo isotipo-abbinato, così come la valutazione di una regione di controllo del DNA genomico, come ad esempio una regione intergenica predetto di non essere vincolata dalla proteina in studio (o anticipato di non mostrare i cambiamenti in le condizioni sperimentali). Inoltre, una curva standard di materiali di input per ogni campione ChIP è usato per derivare i livelli assoluti di arricchimento nel materiale sperimentale. Utilizzo di curve standard aiuta a tenere conto delle differenze tra le serie di primer, indipendentemente da come sono progettati con cura, e anche l&#39;efficienza differirerenze in tutto il range di concentrazioni modello per un singolo set primer. Il nostro protocollo è diverso dagli altri che sono disponibili in 5-8 che coprono estensivamente la, fase successiva analisi.

L&#39;immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) protocollo presentato qui i controlli per le differenze, se del caso, nella quantità di DNA utilizzati in PCR mediante l&#39;utilizzo di una coppia di primer che amplifica una regione legata di genoma, quindi servire come un &quot;controllo del carico&quot;. Nell&#39;esempio illustrato nella figura 3, abbiamo utilizzato la regione codificante del gene ACTB topo come una regione non legato alla nostra proteina di interesse e del sito di legame NFAT fattore di trascrizione su topo Il2 promotore come regione bersaglio. In alternativa, una regione diversi kilobases monte oa valle della regione di destinazione nota per avere alcun legame della proteina di interesse possono essere scelti per questo scopo. Quando si progetta una coppia di primer per la regione di destinazione, la dimensione ideale del prodotto di PCR è di circa 100-200 bp. E &#39;anche importante verificare computazionalmente che questi primer non vincolano in nessun&#39;altra parte del genoma. Arricchimento relativo di una proteina legata alla differenti regioni del genoma possono essere confrontati se lo stesso insieme di isotipo di controllo e di anticorpi specifici sono scelti. Arricchimento delle varie proteine ​​sulla stessa regione bersaglio dipende dalla specificità ed affinità dell&#39;anticorpo utilizzato così come la quantità di proteina specifico legato al DNA. Per esempio, l&#39;arricchimento relativo nel caso di chip eseguite per istoni restituirà in genere un arricchimento valore più elevato rispetto ad un fattore di trascrizione che può legarsi al DNA in risposta a vari segnali cellulari. Se la specificità dell&#39;anticorpo è buona, di solito osserviamo una piega arricchimento 2-10 sulla regione di controllo non associato (figure 3 e 4). <img src="/files/ftp_upload/50064/50064fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50064/50064fig1highres.jpg"/> Figura 1. Layout Sperimentale descrivendo i calcoli per ottenere relaive arricchimento di chip per l&#39;anticorpo specifico al sito di destinazione. PCR quantitativa viene utilizzata per ottenere quantità di DNA nei campioni di chip immunoprecipitata utilizzando un anticorpo specifico e il suo controllo isotipico. PCR quantitativa viene effettuata utilizzando primer che abbracciano sequenza bersaglio e regione di controllo non associato genoma. Per ogni campione di chip, PCR viene eseguita in triplice copia, indicati come tecnico replica a, b, c, e relativo arricchimento viene calcolato per ogni replica, come spiegato nel protocollo. Vengono eseguiti i calcoli per i valori di output tecnici medi. Varianza può anche essere analizzato in questa fase, e idealmente dovrebbe essere basso. I calcoli errore tecnico però non sono inclusi nella formula finale per il calcolo di errore tra biologico replicati. Piuttosto, la variazione biologica misura in sé anche contiene intrinsecamente la variante tecnico. Tre sperimentale replica (in scatole di colore giallo, verde e viola) sono utilizzati per esperimenti di ChIP per ottenere un avsegnale ChIP erage e la sua deviazione standard (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50064/50064fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50064/50064fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50064/50064fig2highres.jpg"/> Figura 2. Metodi alternativi di calcolo di arricchimento chip. Nei casi in cui la quantità di DNA immunoprecipitata dal isotipo è estremamente basso e qPCR amplificazione è scarsa, questa quantità di DNA possono essere sottratti dalla quantità di DNA immunoprecipitati utilizzando un anticorpo specifico per ottenere la piega arricchimento per ogni replicare tecnica. Tale metodo di calcolo deve essere utilizzato in tutte e tre repliche sperimentali di ottenere un segnale medio del truciolo e la sua deviazione standard (SD), come descritto in Figura 1. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50064/50064fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50064/50064fig3highres.jpg"/> Figura 3. Istantanea di Microsoft Excel foglio di calcolo che mostra i calcoli per ottenere relativo arricchimento. Dati da tre repliche sperimentali (in scatole di colore giallo, verde e viola) con tre tecniche replicati ciascuno è stato utilizzato per calcolare l&#39;arricchimento piega. Utilizzo del protocollo di calcolo descritto nella figura 1 è rappresentato in questo foglio di calcolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50064/50064fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50064/50064fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50064/50064fig4highres.jpg"/> Figura 4. Arricchimento relativo di fattore di trascrizione NFAT in IL2promotore. CD4 convenzionali cellule T (TCON) e CD4 cellule T regolatorie (Treg) sono stati isolati da topi Foxp3EGFP. Una piccola frazione di cellule TCON è stata stimolata con PMA e ionomicina per 30 min. ChIP è stata eseguita come descritto nel protocollo sperimentale. I dati qui presentati sono da tre repliche sperimentali con tre tecniche replicati ciascuno. Arricchimento relativo di fattori di trascrizione NFATc1 e NFATc2 sul mouse IL2 promotore in questi tipi di cellule è raffigurato come arricchimento volte nel corso di una regione non legato 3.

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Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l&#39;efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

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Universidad San Sebastian

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JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  University of Utah School of Medicine. Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l'efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

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Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

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Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Immunoprecipitazione DNA metilato

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Completa l&#39;analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte I: lignina

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

Identificazione delle proteine ​​partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.