Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica come quante modifiche cromatiche sono regolate in modo specifico in un tipo di cellula insieme ai genomi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo isolare la cromatina dalle cellule prese di mira e poi seguire la tipica zingara a valle. Quindi questo metodo può fornire informazioni sul trimincil specifico dei neuroni, lysinc 4, opisoncilly.
Può anche essere applicato ad altre modifiche istono, altri tipi di cellule e quindi altri organismi modello. A dimostrare la procedura sarà Mari Mito, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, usa le forbici a molla fini per sezionare il tessuto di interesse in piccoli pezzi.
Aggiungere i frammenti di tessuto a un contenitore pulito pieno di azoto liquido. Quindi, trasferire i frammenti di tessuto in due tubi millilitro riempiti con azoto liquido. Conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius per cinque minuti con il tappo aperto per evaporare l'azoto liquido.
Posizionare i tubi contenenti i campioni di tessuto su una griglia di ghiaccio metallica refrigerata. Quindi, posizionare un proiettile metallico in un tubo da 1,5 millilitri e raffreddarlo con azoto liquido. Posizionare il proiettile metallico refrigerato su uno dei tubi campione.
Chiudere il tappo e impostare il tubo nel supporto del tubo di una smerigliatrice criogenica. Immediatamente, immergere il supporto del tubo assemblato in azoto liquido per un minuto. Inserire il portatubi congelato nella cassetta esterna della smerigliatrice criogenica.
E scuotilo vigorosamente per 30 secondi, 60 volte. Dopo questo, smontare la smerigliatrice criogenica, rimuovere il proiettile metallico. E posizionare il tubo in un dispositivo di raffreddamento del campione pre-refrigerato.
Conservare il dispositivo di raffreddamento a -20 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere quindi 900 microlitri di formaldeide all'1% al tubo e alla pipetta da mescolare. Trasferire la sospensione su un nuovo tubo da due millilitri con 900 microlitri di formaldeide all'1%.
Quindi, fissare la sospensione per 10 minuti con una rotazione delicata a 23 gradi Celsius. Per interrompere la reazione di fissazione, aggiungere 100 microlitri di glicina molare 2.5 al tubo. E centrifugare a 3.000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo questo, scarta il super supernatante. Aggiungere un millilitro di PBS al tubo e al vortice da mescolare. Centrifuga a 3.000 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Ripetere questo passaggio di lavaggio, altre due volte. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi uno al pellet e alla pipetta da mescolare. Centrifugare il tubo per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante.
Aggiungere un millilitro di tampone dilisi due al pellet e al vortice da mescolare. Quindi, centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Successivamente, aggiungere 800 microlitri di tampone di asssay di immunoprecipitazione radio con cocktail inibitore della proteasi al pellet e pipetta da mescolare.
Centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi al pellet. Quindi, centrifugare la sospensione per cinque minuti a 3.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante.
Aggiungere un millilitro di tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi. Immediatamente dopo aver aggiunto il tampone RIPA con cocktail inibitore della proteasi, trasferire il lysate su un tubo sonicatore. E posizionare il tubo su un ultrasonicatore.
Utilizzando le impostazioni delineate nel protocollo di testo, tagliare la cromatina. Quindi, trasferire il campione in un tubo a basso legame proteico da 1,5 millilitri. E centrifugarlo per cinque minuti a 20.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius.
Raccogliere il supernatante dal campione e trasferirlo in un nuovo tubo proteico a basso legame. In questo protocollo è stato introdotto e dimostrato il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina tandem. Durante la procedura, la qualità del DNA è stata testata in più fasi.
Subito dopo la sonicazione, il DNA tranciato è stato isolato e testato con la macchina per l'elettroforesi microfluidica. Dopo aver usato anticorpi anti-FLAG e anticorpi anti-H3K3me3 per eseguire la purificazione dell'affinità, la qualità del DNA è stata nuovamente controllata. La specificità della purificazione immunitaria del DNA su H2B-FLAG è stata confermata con campioni di controllo negativi.
Dove sono state rilevate quantità trascurabili di DNA. Più avanti nel protocollo, è stata verificata la qualità della libreria di sequenziamento. Il ChIP e il T-ChIP di successo sono stati evidenziati attraverso l'analisi dell'arricchimento utilizzando primer rivolti alla regione promotrice del gene GAPDH.
Sono state ottenute ridistribuzioni rappresentative lungo tre geni neuronali. E l'arricchimento delle letture alle cinque estremità principali dei geni da parte del neurone T-ChIP cerca su tutto il cervello ricerca T-ChIP è stato osservato. Dopo una stabilizzazione, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo epigenetico per esplorare la modifica specifica dell'istono del tipo di cellula ampiamente nei neuroni nei topi.
Non dimenticare che lavorare con la formaldeide può essere estremamente pericoloso e prendere precauzioni come indossare indumenti e occhiali di gomma dovrebbe sempre essere preso durante l'esecuzione di questa procedura.
