Questa ricerca è stata condotta sotto USDA-ARS CRIS Progetto 5325-42000-037-00D e con i risultati di CRADA 58-3K95-7-1198 e TFCA 58-5325-8-419. Gli autori ringraziano Suterra per il dono della (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, B. Higbee per le discussioni produttive, e J. Baker per l&#39;assistenza tecnica.

1. Preparazione di sostanze volatili Riconosciuto dalla pianta ospite per EAG Screening <ol><li> Dopo l&#39;identificazione e l&#39;autenticazione appropriato di tutti i volatili mediante GC-MS, eseguire l&#39;analisi EAG soffio di ogni volatili disponibili. Lo screening iniziale può essere un numero basso di replica risposte antennali (N = 3-5) per ciascun sesso, al fine di ottenere una indicazione di chemoreceptivity relativa in un breve lasso di tempo (Tabella 1). </li><li> Preparare una soluzione di ogni volatili ad una mg / mL concentrazione 5 in pentano. Sigillare ermeticamente e conservare in frigorifero fino al momento del campione per l&#39;uso immediato (ad esempio, acetofenone, densità = 1,03 g / mL, volume = (0,005 g/1.03 g / mL) x 1,000 = 4,85 microlitri di acetofenone in un pallone 1,0 ml e diluire a 1,0 mL con pentano). </li><li> Poco prima dell&#39;analisi EAG, rimuovere fiale contenenti il ​​5 mg / ml concentrazione di sostanze volatili da testare e permettono di riscaldare a temperatura ambiente. Nel frattempo, l&#39;etichetta del numero corretto di pipette Pasteurcorrispondono a ciascuna volatili da testare, e avvolgere un piccolo pezzo di parafilm (ca. 15 x 15 mm) sopra la punta della pipetta. Per i primi 10 pipette di screening di stimolo (N = 4 per ogni maschio e femmina) vengono caricati in caso di cattiva preparazione o altro ostacolo imprevisto. </li><li> Utilizzando un paio di pinzette, piegare leggermente il disco saggio biologico in mezzo per facilitare il posizionamento nella pipetta, poi parzialmente inserire il disco piegato nel grande fine della pipetta in modo che ca. 2-3 millimetri del disco sono esposti. Allineare le pipette etichettati e preparata in un contenitore rack. </li><li> Utilizzando una pipetta o siringa, caricare 10 L (50 pg) di soluzione volatile su ciascun disco e consentire 2 minuti prima di passare completamente inserire dischi nella pipetta. Una volta caricato, immediatamente sigillare l&#39;estremità della pipetta con parafilm (ca. 15 x 30 mm). La quantità di stimolo volatile per essere caricati e gonfio è molto probabile che variano a seconda delle specie di insetti. </li><li> Seguendo lo stesso protocollo notato sopra per preparare i controllicomprendono in ogni analisi. Per il carico negativo di controllo 10 microlitri di appena pentano su ogni disco, attendere 2 minuti, caricare nella pipetta etichetta e sigillo. Per il controllo positivo, caricare 10 L (50 mg) sul disco, attendere 2 minuti, il carico nella pipetta etichetta, e sigillare con parafilm. </li><li> La vitalità della preparazione insetto antennale molto probabile che variano a seconda delle specie, ma abbiamo scoperto che Amyelois transitella antenne tipicamente rimanere attivi e coerente per&gt; 30 minuti dopo l&#39;escissione utilizzando il protocollo descritto. Questa quantità di tempo generalmente consentire fino a 4-10 volatili campioni da valutare. Tabella 2 fornisce un esempio di tempi e sequenze. </li></ol> 2. Preparazione delle antenne degli insetti per l&#39;EAG Bioassay <ol><li> L&#39;obiettivo di questo esperimento è EAG analisi, quindi, l&#39;ipotesi che ogni investigatore avrà accesso a insetti allevati in modo appropriato. </li><li> Per questo esperimento studieremo 3-4 giorni olod, accoppiati falene maschio e femmina. Falene individuali vengono trasferiti in un piccolo, con coperchio, contenitore di plastica il giorno di analisi. Immediatamente prima della prova biologica, la falena da testare viene trasferito a capofitto in un apparato di supporto (ad esempio, a base di vari consigli pipettatori di plastica) e sicuro da dietro. La manipolazione del insetto può essere visto sotto un basso consumo stereo-microscopio per facilitare escissione. </li><li> Antenne sono preso in giro con filo di punta strumento. Il titolare forcella, con un piccolo film di gel dell&#39;elettrodo, viene posto in prossimità per il trasferimento rapido di antenne. La prima antenna viene asportato mediante forbici micro e sulla forcella, assicurando la base dell&#39;antenna è posto sul non-rosso porzione della forcella (l&#39;elettrodo di massa indifferente). Un set timer per 10 minuti viene avviato e la seconda antenna viene asportato e posizionato vicino alla prima antenna con le due basi sullo stesso lato della forcella. </li><li> In alternativa, le antenne possono essere lasciati sicurezza all&#39;interno del holdinTubo g, asportato, quindi delicatamente rimosso dal tra il tubo e l&#39;insetto con un filo a punta utensile con una piccola quantità di gel sul fondo. </li><li> Antenne vengono controllati per garantire la base e la punta sono immersi in gel dell&#39;elettrodo e bolle sono presenti nel gel. Le estremità / suggerimenti può essere tagliata per garantire la piena esposizione al gel per elettrodi. Si dovrebbe essere utilizzato per garantire che la parte restante di ciascuna antenna non è coperto con gel, garantendo così la massima area superficiale antennale è esposta al soffio. </li><li> La forcella adeguatamente trattata viene poi inserita nella sonda pre-amplificatore e mantenuto sotto un flusso costante di aria umidificata a 200 mL / min per il tempo rimanente del periodo di attesa di 10 minuti. Il tempo di accise e EAG tempi di inizio sono noti (Tabella 2) e 30 secondi prima del soffio primo stimolo, la pipetta contenente il controllo positivo viene sigillata e posta in cui il supporto viene regolata per dirigere aria / sfoglia flusso 2-3 mm dal il prepped antenne. </li><li> Dopo ogni esperiiment, le falene di prova sono sacrificati in un ambiente di ghiaccio secco e ben disposti. </li><li> Falene femminili sono sezionati per verificare lo stato di accoppiamento. Maschi conviventi si presume che siano accoppiati. </li></ol> 3. EAG protocollo per i singoli componenti <ol><li> Risposte antennali sono registrati tramite il software incluso AutoSpike con lo strumento EAG Syntech. La configurazione nella scheda Proprietà AutoSpike per il canale con la sonda EAG è impostato su una frequenza di campionamento di 106,7, NO alla rettifica, e un filtro di 0-42 Hz. Per la scheda Filter, il filtro EAG è acceso e il basso-cutoff è impostata a 0,1 Hz. </li><li> Sbuffi di stimolo sono 1-2 secondi di durata. Un timer impostato per 1 minuto viene avviato dopo ogni puff. </li><li> La pipetta prossimo test volatile è sigillata e posta nel supporto. La sequenza di volatili prove, randomizzati fra corre per garantire che non composti di prova costante seguire un altro test volatile, viene quindi seguita (ad esempio, Tabella 2) accuratamente allowing 1 minuto tra sbuffi. </li><li> Per facilitare la facilità di leggere le risposte EAG, porzioni di governanti sono posti sullo schermo del computer e il livello di base all&#39;apice del segnale di deflessione verso il basso viene misurata in mm e registrato su un foglio di dati (ad esempio, per l&#39;impostazione 5 mV, 33 mm = 2,5 mV). Il software ha la capacità di riproduzione delle registrazioni salvate per analisi future. Conversione di millimetro a uno mV o mV di ampiezza viene eseguita in un secondo momento l&#39;analisi dei dati. </li><li> Dopo la sfoglia finale controllo positivo (ad esempio, record # 12) viene somministrato, le antenne sono rimossi, la forcella viene pulita con un etanolo saturo pulire e lasciati asciugare prima dell&#39;uso successivo. </li><li> Per aumentare il throughput dei saggi, l&#39;asportazione della prossima serie di antenne può essere avviato da un personale di laboratorio secondo circa 10 minuti prima della fine della sperimentazione in corso - dopo il quarto soffio, la seconda prova volatile l&#39;esperimento in corso, come da tabella 2. Ciò consentirà for l&#39;inizio del successivo esperimento direttamente dopo la fine dell&#39;esperimento attuali. </li><li> Maggiore il numero di repliche (su antenne differente) possono essere eseguite su composti di interesse per fornire ulteriore validazione statistica. </li></ol> 4. Un esempio di analisi EAG di miscele o di altre matrici (Tabella 3) <ol><li> Successivamente, i rapporti e dei volumi delle due miscele terziarie (3 componenti miscele) sono calcolati per fornire un esempio di combinazione di sostanze volatili scatenanti risposte EAG elevati (Tabella 4). I calcoli sono per alcuni rapporti di base, un rapporto 1:1:1 molare di α-humulene: 2-undecanone: 2-feniletanolo e quindi confrontando ad un rapporto seconda miscela di 1:2:4. </li><li> Utilizzando protocolli simili descritto in precedenza, le miscele vengono preparate e etichettati pipette Pasteur vengono caricati insieme con i necessari controlli positivi e negativi. </li><li> I campioni di volatili sono gonfiati attraverso antenne maschile e femminile e le risposte vengono misurate e loggatoun foglio di dati (Tabella 3). </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Per orangeworm ombelico femminile le impostazioni vengono utilizzati i seguenti: 2 sbuffi secondo, 10 volte seconda registrazione, 10 seconda finestra, e 5 di scala mV. Una flessione negativa è la risposta tipica, ma il valore assoluto viene registrato (ad esempio, -3400 mV deflessione viene registrato come 3400 mV). Una risposta relativamente debole della preparazione per il controllo positivo viene scartato. Figura 1 fornisce una rappresentazione grafica di una scarsa risposta al controllo positivo orangeworm ombelico. Ad esempio di un risultato scarso controllo, la risposta media femmina antenne a acetofenone è tipicamente ca. 2600 mV (figura 2), se la preparazione solo ha dato una risposta di ca. 1300 mV si sarebbe essere scartato e un&#39;altra coppia di antenne prepped. Allo stesso modo, la risposta media maschile (Z, Z) -11,13-hexadecadienal era Typically 3000 mV, quindi, qualsiasi risposta meno di 1.500 mV è stato scartato in genere. Il controllo positivo all&#39;inizio e alla fine di ciascun esperimento fornisce inoltre informazioni relative alla condizione delle antenne. Una regola pratica seguiamo per lo screening rapido è se la risposta antennale al soffio del post-controllo (record # 12, tabella 2) o è inferiore al 75% del 1 ° soffio del pre-controllo (record # 1 , Tabella 2) o inferiore al 2 ° soffio del pre-controllo (record # 2, Tabella 2) allora l&#39;esperimento non viene utilizzato nell&#39;analisi dei dati a causa di possibile degradazione del prep (Figura 3). Un esempio della prima regola del pollice sarebbe record # 1 = 2730 mV e record # 12 = 1680 mV, e la seconda regola del pollice se il record # 2 = 2350 mV e record # 12 = 1680 mV, In ciascuno di questi casi , i risultati dell&#39;esperimento preparazione e sarebbero scartati. Aesempio rappresentativo di correggere i valori di risposta EAG misurati al controllo positivo sarebbe il seguente. <table border="1"><tbody><tr><td> Esegui # </td><td> EAG (mV) </td><td> Esegui # 2 </td><td> EAG (mV) </td><td> Run # 3 </td><td> EAG (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2800 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2420 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> A Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> A Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 530 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 755 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2770 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2400 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> Utilizzando i valori sopra indicati per uno = N 3 esperimento, la risposta controllo negativo è sottratto da tutti i valori all&#39;interno di ciascun esperimento assumendo il controllo negativo è la risposta di base antennale al soffio meccanica e di solvente residuo. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> EAG (mV) </td><td> Esegui # 2 </td><td> EAG (mV) </td><td> Run # 3 </td><td> EAG (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2270 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1665 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> A Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2240 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1645 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> I controlli positivi per ogni esperimento sarebbe quindi essere mediati e corretti a 1.000 mV, notando il rapporto per la correzione a 1.000 mV. Un foglio di dati (ad esempio, Excel) possono essere facilmente strumentalizzate per convertire le risposte ai dati utilizzabili. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> Avg (mV) </td><td> Esegui # 2 </td><td> Avg (mV) </td><td> Run # 3 </td><td> Avg (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2255 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1655 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> Moltiplicando per il rapporto di correzione all&#39;interno di ciascun esperimento, i valori di composto A e B composto vengono poi regolati. <table border="1"><tbody><tr><td> Run # 1 </td><td> Adj. EAG (mV) </td><td> Esegui # 2 </td><td> Adj. EAG (mV) </td><td> Run # 3 </td><td> Adj. EAG (mV) </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> Le medie (mezzi) per ciascun composto sono quindi determinate insieme ad altri dati statistici pertinenti e le risposte EAG per i composti testati possono essere valutatiper la candidatura per ulteriori indagini. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> EAG (mV) </td><td> No. Funziona, N = </td></tr><tr><td> A </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> Figura 1. EAG Rappresentante per i maschi la risposta antennale (1.180 mV) al pre-controllo (1 sfoglia st controllo positivo) che verrebbero scartati a causa di una scarsa risposta antennale dopo aver assicurato le antenne hanno un buon contatto con il gel. Barre blu in Windows fondo rappresentano il soffio due secondi di volatile. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <s<html> Trong&gt; Figura 2. EAG Rappresentante per la risposta femminile antennale (3.400 mV) al 1 ° sfoglia pre-controllo che dovrebbero essere considerati tali. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> Figura 3. EAG Rappresentante per la risposta femminile antennale (1.680 mV) per il controllo a posteriori (ultimo controllo positivo per ciascun esperimento) che potrebbero essere considerati poveri, e suggestivo delle antenne degradazione (&lt;75% del 1 ° pre-controllo o &lt; 2 ° puff valore di pre-controllo). Per questo esempio, il 1 ° pre-controllo è stato puff 2730 mV e 2 ° pre-controllo è stato puff 2350 mV. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . dflinebreak &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentante EAG per la risposta femminile antennale (3.800 mV) al soffio di una miscela candidato volatile e le misure successive la deformazione massima iniziale (3800 mV), la pendenza iniziale per tutta la durata soffio (0,3 mV = s/1.2 0.25 s / mV), e la pendenza per la durata rimanente sfoglia (1,6 mV s/1.9 = 0.84 s / mV). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> Figura 5. Piccola imbarcazione modificato contenente una matrice di campione e volatili associati per essere soffiato in A. transitella antenne. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" /> Tabella 1. In sITU emissioni volatili di mandorle impareggiabile (2007) e le risposte EAG determinati da una configurazione diversa e meno sensibile nel programma Autospike. <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> Tabella 2. Esempio di un modulo per la registrazione delle risposte antennali maschili e femminili ai singoli componenti volatili. <img alt="Tabella 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> Tabella 3. Esempio di un modulo per la registrazione delle risposte antennali maschili e femminili alle miscele volatili e / o bouquet. <img alt="Tabella 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> Tabella 4. Esempi di preparazione di 10 mL di 5 mg / mL di soluzione per due diversi rapporti di miscele. <img alt="Tabella 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> Tabella 5. Esempio di modulo per la registrazione due conseguenzesbuffi consecutivi di singoli componenti volatili attraverso antenne maschile e femminile.

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L&#39;autore dispone di una cooperativa e di ricerca già esistente accordo di sviluppo con l&#39;azienda agricola Paramount, una società con legami con Suterra LLC.

Uso delle registrazioni electroantennogram come un saggio biologico per determinare le risposte chemorecezione di un insetto bersaglio è abbastanza comune e numerosi studi che utilizzano EAG come rivelatore per effluenti da un cromatogramma gas (GC-EAD) possono essere trovati nella letteratura. 9,10 Il metodo illustrato fornirà uno screening rapido di quantità equivalenti di componenti volatili con le repliche di alta fiducia per l&#39;assegnazione della relativa risposta. Il programma AutoSpike nel softwa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Acetofenone </td><td> Alfa Aesar- </td><td> A12727 </td><td> Female controllo positivo </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-Hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> Maschio controllo positivo </td></tr><tr><td> α-Humulene </td><td> Aldrich </td><td> 53675 </td><td> Sesquiterpene </td></tr><tr><td> 2-Undecanone </td><td> Aldrich </td><td> U1303 </td><td> Derivato di acido grasso </td></tr><tr><td> 2-feniletanolo </td><td> Aldrich </td><td> 77861 </td><td> Benzonoidi </td></tr><tr><td> Pentano </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> 4 canali di acquisizione di controllo </td><td> Syntech </td><td> IoDAC-4 </td><td></td></tr><tr><td> EAG sonda, pre-amplificatore </td><td> Syntech </td><td> PRG di tipo-2 </td><td></td></tr><tr><td> Antenna titolare </td><td> Syntech </td><td> Per PRG-2 </td><td> Fork elettrodo </td></tr><tr><td> Stimolo di controllo </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> Del flusso d&#39;aria e sbuffi </td></tr><tr><td> Spectra elettrodi Gel </td><td> Parker </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Saggi biologici dischi </td><td> Whatman </td><td> 2017-006 </td><td> 6 millimetri </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 ¾ &quot;(14,6 cm) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> PM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

electroantennographic bioassay as a screening tool for host plant volatiles

Volatili vegetali svolgono un ruolo importante in pianta-insetti interazioni. Gli insetti erbivori utilizzare sostanze volatili vegetali, noti come cairomoni, per individuare la loro pianta ospite. 1,2 Quando una pianta ospite è un importante agronomica danni alimentazione merce da insetti in grado di infliggere gravi perdite economiche ai produttori. Di conseguenza, cairomoni può essere utilizzato come attrattivi per adescare o confondere questi insetti e, quindi, di offrire un&#39;alternativa ecologica ai pesticidi per il controllo degli insetti. 3 Purtroppo, le piante in grado di emettere un vasto numero di volatili con composizioni diverse e rapporti di emissioni dipendenti dalla fenologia della merce o del momento della giornata. Questo rende l&#39;identificazione di componenti biologicamente attivi o miscele di componenti volatili un processo faticoso. Per aiutare ad identificare i componenti bioattivi delle emissioni degli impianti ospitanti volatili che utilizziamo il laboratorio-based electroantennography biotest screening (EAG). EAG è uno strumento efficace per valutare e regid elettrofisiologicamente le risposte olfattive di un insetto attraverso i loro recettori antennali. Il processo di screening EAG può aiutare a ridurre il numero di volatili sottoposti a test per individuare promettenti componenti bioattivi. Tuttavia, test biologici EAG solo forniscono informazioni sull&#39;attivazione dei recettori. Esso non fornisce informazioni sul tipo di comportamento degli insetti del composto provoca, che potrebbe essere uno attrattivo, repellente o altro tipo di risposta comportamentale. Volatili che provochino una risposta significativa da EAG, rispetto a un controllo adeguato positivo, sono in genere assunto per ulteriori test di risposte comportamentali della peste di insetto. Il disegno sperimentale presentato in dettaglio la metodologia utilizzata per lo screening a base di mandorle volatili piante ospiti 4,5 attraverso la misurazione delle risposte elettrofisiologiche antennali di un adulto dell&#39;ombelico orangeworm insetto parassita (Amyelois transitella) ai componenti singoli e semplici miscele di componenti tramite EAG biotest. Il metodo utilizza due exantenne cised nel mezzo di una porta &quot;fork&quot; elettrodo. Il protocollo ha dimostrato qui presenta un rapido, high-throughput metodo standardizzato per volatili di screening. Ogni volatile è in un determinato, costante per standardizzare il livello stimolo e quindi consentire risposte antennali indicativa del chemoreceptivity relativa. Il controllo negativo aiuta ad eliminare la risposta elettrofisiologico sia forza di solvente residuo e meccanica della sfoglia. Il controllo positivo (in questo acetofenone esempio) è un composto singolo che ha suscitato una risposta coerente da maschio e femmina ombelico orangeworm (NOW) falena. Uno standard semiochemical supplementari che fornisce risposta coerente e viene utilizzato per studi di saggio biologico con il maschio NOW tignola è (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, un componente aldeide dalla femmina prodotta feromone sessuale. 6-8

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Un metodo per rapidamente volatili ospitanti schermo vegetali mediante la misurazione della risposta elettrofisiologica dei orangeworm ombelico adulti (<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;) Antenne per singoli componenti e miscele tramite l&#39;analisi electroantennographic è dimostrata.

Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

electroantennographic-bioassay-as-screening-tool-for-host-plant

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Agricultural Research Service. Un metodo per rapidamente volatili ospitanti schermo vegetali mediante la misurazione della risposta elettrofisiologica dei orangeworm ombelico adulti ( Amyelois transitella) Antenne per singoli componenti e miscele tramite l'analisi electroantennographic è dimostrata.

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A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Un β-glucuronidasi (GUS) Sulla base di analisi morte cellulare

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Ricerca

Biologia

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Volatili Blueberry erbivori indotta e intra-impianto di segnalazione

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA Catalyst come reporter per lo screening dei farmaci contro l&#39;RNA Editing in tripanosomi

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Un saggio biologico semplice per la valutazione dei fattori di crescita dell&#39;endotelio vascolare

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Un test di competizione di piatto come una rapida valutazione preliminare di soppressione di malattia

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

This is an adapted method for identifying candidate insect colonization factors in a Burkholderia beneficial symbiont. The beetle host is infected with a random mutant library generated via transposon mutagenesis, and library complexity after colonization is compared to a control grown in vitro.

Sequenziamento trasposone-inserzione come strumento per chiarire i fattori di colonizzazione batterica in un simbionte gladioli Burkholderia di Coleotteri Lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran insects that have piercing-sucking mouthparts. During viral transmission, the insect saliva bridges the virus-vector-host because the saliva vectors viruses, and the insect proteins, trigger or suppress the immune response of plants from insects into plant hosts. The identification and functional analyses of salivary proteins are becoming a new area of focus in the research field of arbovirus-host interactions. This protocol provides a system to detect proteins in the saliva of leafhoppers using the plant host. The leafhopper vector Nephotettix cincticeps infected with rice dwarf virus (RDV) serves as an example. The vitellogenin and major outer capsid protein P8 of RDV vectored by the saliva of N. cincticeps can be detected simultaneously in the rice plant that N. cincticeps feeds on. This method is applicable for testing the salivary proteins that are transiently retained in the plant host after insect feeding. It is believed that this system of detection will benefit the study of hemipteran-virus-plant or hemipteran-plant interactions.

This protocol demonstrates how to use the plant host to detect salivary proteins of leafhopper and plant viral proteins released by leafhopper vectors.

Rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nell'ospite della pianta

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...