La ricerca Agrumi e Fondazione per lo sviluppo è riconosciuto per il finanziamento. Grazie ad Angelo Hoyte e Michael Flores per lo svolgimento di test biologici.

<ol><li> Montaggio di un design personalizzato, due porte divisa T-olfattometro precedentemente descritto Mann et al. 10 è mostrato in Figura 1. Il olfattometro costituito da un tubo di vetro 30 centimetri che si biforca in due porte separate con una striscia di Teflon formando una T-labirinto. Ogni mezzo è analogo a un braccio di un 2-scelta olfattometro stile consentire al soggetto di prova per scegliere tra due campi odore potenziali. <ol><li> Saggi per il montaggio e la successiva deve avvenire all&#39;interno di un ambiente a temperatura controllata o camera ambientale. </li><li> Mount vetro T-maze olfattometro verticalmente come mostrato in Figura 1 e posizionarlo sotto una lampadina fluorescente 900 lux. </li><li> Per la diffusione della luce ottimale, il gruppo deve essere montato all&#39;interno di un 1,0 x 0,6 x 0,6 m contenitore opaco per massimizzare la diffusione uniforme della luce. </li><li> Collegare le braccia olfattometro a fonti di odore che saranno alloggiati in fase solida micro-estrazione fonte chamb azienda / odoreer (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville, FL) attraverso teflon, vetro connettori dei tubi. Ogni SPMEC comprende un tubo di vetro diritto (17,5 cm x 3,5 cm) supportata con un ingresso e valvola di scarico per i flussi d&#39;aria in entrata e in uscita (Figura 1). </li><li> Collegare il sistema di erogazione di aria ad una sorgente esterna di aria umidificata e carbonio-purificato che è sotto pressione costante (il sistema di erogazione dell&#39;aria ha sia un filtro interno di carbonio per la purificazione dell&#39;aria e di un gorgogliatore per umidificazione dell&#39;aria fonti esterne se non sono disponibili). </li><li> Sciogliere campioni chimici desiderati entro appropriato diluente (solvente) e pipetta su un substrato di rilascio lento come uno stoppino di cotone (Petty John Packaging, Inc., Concord, NC). Il trattamento di controllo dovrebbe consistere di uno stoppino di cotone impregnato di solvente solo. </li><li> Per prevenire la contaminazione significativa del vetro, avvolgono gli stoppini di cotone trattati e di controllo del tessuto (laboratorio Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) e il luogo nei due bracci SPMEC (ARS, Inc., Gainesville, FL). Nel caso di campioni vegetali vivi, una camera di raccolta volatili ghigliottina può essere attaccato al olfattometro contenente trattamenti in luogo del SPMEC (Figura 1). </li><li> Fornire purificata e umidificata attraverso il SPMEC (o camera ghigliottina volatile) tramite due pompe collegate ad un sistema di erogazione di aria (Figura 1). Mantenere la velocità del flusso dell&#39;aria a 0.1 L / min per mezzo di entrambi i rami del olfattometro. </li></ol></li><li> Impiegando olfattometro per testare la risposta degli artropodi di repellenti putativi. Nella presente descrizione, un insetto hemipteran, psilla agrumi asiatica, Diaphorina citri, è stato utilizzato come test di artropodi. Risposta è stato testato a volatiles agrumi soli o in combinazione con un (dimetil disolfuro) repellente e aria pulita come fonti di odore. <ol><li> Condurre tutti gli esperimenti a temperatura e umidità relativa standardizzata. </li><li> Prima di tutti i test, esporre test soggetti per pulire l&#39;aria pulita dell&#39;aria in funzione del solvente o aria pulita rispetto al T-labirinto olfattometro per verificare l&#39;assenza di errori di posizionamento o un effetto di solvente sul comportamento del soggetto del test. </li><li> Assegnare una fonte di odore casualmente ad uno dei bracci della olfattometro all&#39;inizio di ciascun saggio biologico. Invertire questa posizione dopo ogni 10 soggetti di prova analizzati, come minimo, di eliminare il potenziale di errori di posizione. </li><li> Verificare la risposta da un minimo di 30 (e fino a 120) soggetti sottoposti al test per trattamento combinato. </li><li> Permette di prova soggetti 100-300 sec esporre una risposta comportamentale sulla base della risposta precedentemente stabilito (latenza) intervallo. </li><li> Record se il soggetto entra nel braccio di trattamento, braccio di controllo o rimane nel porto di rilascio o al di sotto della T-labirinto divisione. </li><li> Segna un braccio di trattamento o di controllo scelta quando un soggetto di prova attraversa la divisione T-labirinto e si muove in due bracci olfattometro. </li><li> Segna un braccio di rilascio scelta quando una prova sonformemente rimane nel porto di rilascio o sotto il T-maze divisione. </li><li> Pulire la olfattometro e tubi di collegamento accuratamente con soluzione di sapone 2% e cuocere i componenti di vetro a 200 ° F tra l&#39;uso di trattamenti diversi odori. </li><li> Per i saggi in cui sono presentati putativi trattamenti repellenti nel T-labirinto olfattometro con o senza un trattamento chimico contro aria pulita, confrontare il numero di soggetti di prova rimanenti nel punto di rilascio e non entrare olfattometro tra trattamenti da una analisi della varianza ( ANOVA) seguita dal test di Tukey HSD (α &lt;0,05). Nei casi in cui i soggetti del test lasciano il braccio di rilascio, confrontare il numero di scelta del braccio di controllo rispetto al braccio di trattamento con chi quadrato (χ 2) analisi a α &lt;0.05. </li></ol></li></ol>

<ol>
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L&#39;autore ha ricevuto finanziamenti che sono state fornite dal Citrus Research e Development Foundation.

Qui, un dispositivo di saggio e il protocollo sono descritte per misurare la risposta di piccoli artropodi (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) a odoranti. Il metodo prevede un test a scelta, permettendo l&#39;insetto di fare una scelta tra due campi odoranti nel caso di saggi valutazione di un attrattivo putativo. Inoltre, il soggetto prova può visualizzare tre tipi di comportamenti lasciando il braccio di apertura e inserendo uno di due campi potenziali odore, o di rimanere nel braccio di apertura, nel caso di saggi di repellenza. Il olfattometro consente per la raccolta dei dati ad alta velocità in quanto si avvale della geotactic negativo (tendenza a muoversi verso l&#39;alto) e phototactic positivo (tendenza a muoversi verso la luce) naturale risposta comportamentale di molti artropodi. Sebbene la dimostrazione presente esempio utilizza un psyllid prova insetto, il dosaggio può essere facilmente adattato per artropodi in generale, sia quelli che utilizzano volo o camminare come modi predominanti di trasporto. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Olfactometers progettati per misurare la risposta degli insetti sono stati inizialmente sviluppati decenni fa e hanno svolto un ruolo importante nel chiarire attrattivi e repellenti insetti 12. I disegni specifici di tali olfactometers variare, tuttavia, variazioni sul tema generale della scelta due test qui descritto, così come, simili Y-tube saggi sono stati spesso utilizzati per misurare la risposta artropodi alle sostanze chimiche. Tunnel di volo più grandi che possono causare un volo prolungato di insetti 9 sono anche comportato la raccolta di dati innovativi chiarire i meccanismi fondamentali del volo degli insetti e di orientamento per semiochimici, così come, i dati informare utilizzo pratico di strumenti di controllo dei parassiti. Spesso è necessario per la progettazione su misura di un olfattometro e alla relativa strumentazione per la biologia del soggetto specifico test di artropodi. Tali olfactometers che possono essere utilizzati in un gruppo generale di insetti sono più utili di quelli specific a un piccolo gruppo, ma a volte l&#39;importanza economica di un piccolo gruppo di insetti determina la necessità di sviluppo di un olfattometro molto specifica e tecnica di dosaggio. Il progetto attualmente descritto si basa su tecniche di artropodi in precedenza familiari. Consente una più standard due scelte saggio di Y-tube saggi biologici in cui il sito sperimentale o di prova scelta prende la forma di un dispositivo a forma di Y vetro 7. Tipicamente, un braccio di un tubo a Y riceverà un odorizzante trattamento, mentre l&#39;altro sarà lasciato vuoto 13. Variazioni su olfactometers possono comprendere l&#39;aggiunta di più bracci radianti 14 e anche l&#39;aggiunta di un mezzo di suolo per saggiare il comportamento degli organismi spostano attraverso il suolo 15. Nello sviluppo di tali olfactometers e saggi associati, è importante considerare come strettamente condizioni naturali vengono replicati e quindi la reale rilevanza delle risposte comportamentali valutati in termini di biologia dei soggetti di prova. Per una lagrado rge, i dati raccolti verranno solo essere così utile come la rilevanza del biotest comportamentale rispetto alla ecologia comportamentale dell&#39;organismo 16. Il olfattometro attualmente descritta e biologico comportamentale è specificamente progettato per un insetto hemipteran che tende ad avviare volo come brevi &quot;salta&quot; 16. L&#39;orientamento verticale del olfattometro e la disposizione sorgente luminosa facilitare l&#39;inizio dell&#39;azione insetti e quindi la successiva chimicamente mediata comportamento orientamento può essere saggiata con efficienza e produttività elevata. Questa disposizione saggio comportamentale può probabilmente essere utilizzato per una vasta gamma di volare o camminare taxa artropodi o potrebbe essere facilmente modificato per adattarsi alla necessità di non-organismi artropodi.

Artropodi (inclusi gli insetti e aracnidi) sono spesso definiti come parassiti, perché sia in concorrenza con l&#39;alimentazione umana in ambienti agricole o urbane o trasmettere agenti patogeni causali della malattia 1. Una grande quantità di investimento è fatto in sviluppo di strumenti di controllo per tali pesti. Questi strumenti possono variare ampiamente e notevoli progressi sono stati compiuti nello sviluppo di strumenti biorational che o modificano o sfruttare il comportamento naturale dei parassiti con l&#39;uso di esche comportamentali o repellenti 2,3. Parassiti artropodi spesso si basano su segnali olfattivi o spunti per accoppiarsi e / o l&#39;host posizione 4. Pertanto scoperta di attrattivi o repellenti efficaci per i parassiti possono spesso portare allo sviluppo di strumenti di controllo. Questo processo di scoperta prevede diversi passaggi. In primo luogo, il comportamento naturale del soggetto di prova deve essere compreso. Per esempio, si deve accertare se un sesso di una specie attira l&#39;oppostosesso per posizione di un accoppiamento. In caso affermativo, si deve determinare se questa attrazione è mediata da una sostanza chimica e dove la sostanza chimica viene prodotta. Ulteriori passi sono determinare quando la sostanza chimica viene prodotta e la sua identificazione finale. Tutta questa procedura, il soggetto stesso (insetti o acari) risposta comportamentale odoranti deve essere testato. Inizialmente, il comportamento del soggetto di prova saranno testati per il materiale naturale. Per esempio, una risposta falena maschio può essere testato a quella dell&#39;estratto della sua conspecific femmina ghiandola feromone. In alternativa, la risposta di un erbivoro per gli odori naturali della sua pianta ospite può essere provato. Mentre queste ricerche hanno spesso un orientamento pratico sullo sviluppo di strumenti di gestione 5,6, possono anche essere applicate alla ricerca che affronti questioni fondamentali, come speciazione 7. I passi successivi riguardano testare la risposta del artropode di versioni sintetiche di prodotti naturali identificati. Understanding artropodi come rispondere agli agenti chimici è necessario lo sviluppo di strumenti adeguati per misurare il loro comportamento. I dati generati da questi strumenti dipende dal modo in cui il ricercatore è in grado di misurare i comportamenti naturali in un ambiente controllato. Più di sei decenni fa, olfactometers volo prolungato e gallerie sono stati sviluppati per misurare la risposta degli insetti al 8,9 odoranti. Olfactometers variano in modo significativo nel design e sono spesso su misura per l&#39;insetto o problema specifico oggetto di indagine. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere la progettazione e l&#39;uso di un orientamento verticale, T-labirinto olfattometro per misurare la risposta insetto odori (Figura 1). L&#39;orientamento verticale olfattometro prende vantaggio dalla geotassi negativo (tendenza a spostarsi verso l&#39;alto) esposti da molti insetti. Una sorgente di luce posizionata direttamente sopra la olfattometro sfrutta la phototaxis positivo (tendenza a muoversi verso la fonte di luce) esibita da molti insetti. Il olfactommetro è particolarmente utile per gli insetti hemipteran che tendono a non esporre il movimento facilmente in olfactometers con orientamento orizzontale e che sono fortemente influenzati dalla intensità della luce in relazione all&#39;orientamento. Tuttavia, questo dispositivo può essere utilizzato per una vasta gamma di insetti volanti e striscianti, nonché aracnidi. Il olfattometro può essere impiegato per valutare sia attrattivi e repellenti. Nel caso di attrattivi, campo odore biforcato (Figura 1) è stabilito con la attractant putative rilasciato su un lato contro aria pulita rilasciato sul lato opposto. Una scelta viene registrata quando l&#39;insetto rilasciato alla base del olfattometro sceglie uno dei due campi odore. Nel caso di repellenti, un terzo comportamento è possibile. Oltre al movimento verso l&#39;alto in uno dei due campi odore, mancanza di movimento verso l&#39;alto può essere registrato indicando un non-reattivo stimolo o respingere stimolo da entrambi i campi odori.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Due porte diviso T-olfattometro </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> Nessuno (su misura) </td><td> Se non è disponibile da ARS, Southern scientifico (Gainesville, FL) anche attualmente produce e distribuisce tali apparecchiature. </td></tr><tr><td> In fase solida micro-estrazione azienda / sorgente camera odore di teflon, vetro connettori dei tubi. </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> RV-R3 </td><td> Vedi sopra un commento </td></tr><tr><td> Air sistema di erogazione </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> HADS-2AFM2C.4 </td><td> Vedi sopra un commento </td></tr><tr><td> Ghigliottina camera </td><td> Analitica Researco Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> L3GP3 </td><td> Vedi sopra un commento </td></tr></tbody></table>

vertical t-maze choice assay for arthropod response to odorants

Data l&#39;importanza economica di insetti e aracnidi come parassiti delle colture agricole, ambienti urbani o come vettori di impianti e malattie umane, diverse tecnologie sono in fase di sviluppo come strumenti di controllo. Un sottoinsieme di questi strumenti si concentra sulla modifica del comportamento di artropodi di attrazione o repulsione. Pertanto, artropodi sono spesso al centro delle indagini comportamentali. Vari strumenti sono stati sviluppati per misurare il comportamento degli artropodi, tra cui gallerie del vento, mulini volo, servospheres, e vari tipi di olfactometers. Lo scopo di questi strumenti è quello di misurare la risposta di insetti o aracnidi di segnali visivi o più spesso olfattiva. Il labirinto verticale T-oflactometer qui descritto le misure scelte operate da insetti in risposta a attrattivi o repellenti. Si tratta di un dispositivo ad alta velocità saggio che si avvale della fototassi positiva (attrazione per la luce) e negativi (geotassi tendenza a camminare o volare verso l&#39;alto) presentati dai molti artropodi. Il olfactometer è costituito da un tubo di vetro 30 cm che è divisa a metà con una striscia di Teflon formando una T-labirinto. Ogni metà funge da braccio del olfattometro consentire ai soggetti di prova a fare una scelta tra due campi odore potenziali test che coinvolgono attrattivi. In saggi coinvolgono repellenti, mancanza di risposta normale attractants noti possono anche essere misurata come una terza variabile.

Attrazione di agrumi asiatici psilla (Diaphorina citri) adulti agli odori dei loro volatili natali di piante ospiti (agrumi) è illustrata nella figura 2A. Adulti significativamente (α &lt;0,05) più scelto il braccio del T-maze olfattometro ricezione odori da piante di agrumi viventi come rispetto ad una forma (aria pulita) di controllo. Un esempio di repulsione è illustrato nella figura 2B. In questo caso, gli insetti sono stati esposti a un braccio di T-maze volatili agrumi ricezione, mentre il secondo braccio ricevuto volatili da un impianto di agrumi che è stato trattato con il noto repellente, disolfuro di dimetile 11. In questo caso, tre tipi di comportamenti sono stati osservati. Il numero di psille arrestati al braccio di apertura e non risponde non differiva statisticamente dal numero di entrare nel braccio ricevente gli odori da piante di agrumi solo (figura 2B). Tuttavia, non psille entrato nel braccio contenente tha pianta ospite volatili quando co-presentato con il repellente (Figura 2B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50229/50229fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma schematico di orientamento verticale T-maze olfattometro unito al sistema di erogazione di aria e odori sblocco trattamento. Lo schema è un adattamento di figura 1 in Mann et al. 10. Un soggetto in esame viene posto singolarmente nella camera di rilascio del 2-port diviso T-olfattometro. Si muove verso gli odori attraverso una valvola a saracinesca che permette di controllare il movimento verso l&#39;alto nella olfattometro e impedisce l&#39;insetto di eseguire la scansione di nuovo in zona punto di rilascio. Il tubo biforca 10 centimetri dopo il valore cancello. Una risposta positiva a un odore viene registrato una volta l&#39;insetto si muove 0,5 centimetri in una parte specifica della divisione. La camera di raccolta volatili ghigliottina può essere usato al posto di un solido PHAe micro-estrazione azienda / fonte camera di odore (SPMEC) come fonte di odore. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50229/50229fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50229/50229fig2.jpg" /> Figura 2. Risposta di agrumi asiatici psilla (Diaphorina citri) adulti di volatili da piante ospiti di agrumi rispetto di controllo aria pulita (A) o volatili agrumi contro volatili agrumi co-rilasciati con un repellente (dimetil disolfuro) (B) in un orientamento verticale T -maze olfattometro Figura 2A:. Solo l&#39;analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test di Tukey HSD (α &lt;0,05) è stata eseguita per confrontare il numero di psilla una scelta tra due bracci (2 trattamenti, n = 120). Colonne indicate da lettere diverse sono significativamente diversi tra loro (α &lt;0,05) Figura 2B:. Unidirezionali analysè di varianza (ANOVA) seguita dal test di Tukey HSD (α &lt;0,05) è stata eseguita per confrontare il numero di psilla fare una scelta fra braccio o rimanente nel punto di rilascio (3 trattamenti, n = 120). Colonne indicate da lettere diverse sono significativamente diversi tra loro (α &lt;0,05).

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Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Una verticale, T-labirinto olfattometro è descritto per saggiare la risposta comportamentale degli artropodi. Il olfattometro permette allo sperimentatore di misurare le scelte effettuate da soggetti di prova quando è sottoposto a due campi odore potenziali. Sia attrazione e repulsione per da odoranti può essere misurata con questo dispositivo.

Verticale T-maze test di scelta per risposta artropodi di odori

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

vertical-t-maze-choice-assay-for-arthropod-response-to-odorants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Views.  University of Florida. Una verticale, T-labirinto olfattometro è descritto per saggiare la risposta comportamentale degli artropodi. Il olfattometro permette allo sperimentatore di misurare le scelte effettuate da soggetti di prova quando è sottoposto a due campi odore potenziali. Sia attrazione e repulsione per da odoranti può essere misurata con questo dispositivo.

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T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-labirinto alternanza forzata e sinistra-destra Attività discriminazione per la Valutazione di lavoro e la memoria di riferimento nel Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

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Neuroscienze

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification (RFID) readers built into artificial flowers that display various visual cues, and RFID tags (i.e., passive transponders) glued to the thorax of bumblebee workers. The novelty in our implementation is that RFID readers are built directly into artificial flowers that are capable of displaying several distinct visual properties such as color, pattern type, spatial frequency (i.e., &#8220;busyness&#8221; of the pattern), and symmetry (spatial frequency and symmetry were not manipulated in this experiment). Additionally, these visual displays in conjunction with the automated systems are capable of recording unrewarded and untrained choice behavior. The second method consists of recording choice behavior at artificial flowers using motion-sensitive high-definition camcorders. Bumblebees have number tags glued to their thoraces for unique identification. The advantage in this implementation over RFID is that in addition to observing landing behavior, alternate measures of preference such as hovering and antennation may also be observed. Both automation methods increase experimental control, and internal validity by allowing larger scale studies that take into account individual differences. External validity is also improved because bees can freely enter and exit the testing environment without constraints such as the availability of a research assistant on-site. Compared to human observation in real time, the automated methods are more cost-effective and possibly less error-prone.

This video describes Radio-Frequency Identification (RFID) and motion-sensitive video recording methods to monitor choice behavior by bumblebees.

Radio Frequency Identification e video sensibile al movimento in modo efficiente Automatizzare registrazione di ricompensa Scelta comportamento di bombi

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

Registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Drosophila</em&gt; Senso Trichoide in risposta a Odoranti di bassa volatilità

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

Acquisizione e analisi dei dati nel cervello evocato Audiometria di risposta nei topi

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional deficits. Numerous studies by our group and others have shown that mTBI stimulates cytokine expression and activates microglia, decreases cerebral blood flow and metabolism, and impairs cerebrovascular reactivity. Moreover, several works have reported an association between derangements in these neuroinflammatory and hemodynamic markers and cognitive impairments. Herein we detail methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic tissue response to mTBI in mice. Specifically, we describe how to perform a weight-drop model of mTBI, how to longitudinally measure cerebral blood flow using a non-invasive optical technique called diffuse correlation spectroscopy, and how to perform a Luminex multiplexed immunoassay on brain tissue samples to quantify cytokines and immunomodulatory phospho-proteins (e.g., within the MAPK and NF&#954;B pathways) that respond to and regulate activity of microglia and other neural immune cells. Finally, we detail how to integrate these data using a multivariate systems analysis approach to understand the relationships between all of these variables. Understanding the relationships between these physiologic and molecular variables will ultimately enable us to identify mechanisms responsible for mTBI.

This protocol presents methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic response to mild traumatic brain injury and to integrate these data as part of a multivariate systems analysis using partial least squares regression.

Analisi dei sistemi della risposta neuroinfiammatoria ed emodinamica alla lesione cerebrale traumatica

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...