Il sostegno è stato fornito da Becton Dickinson Technologies. Le opinioni espresse in questa presentazione sono quelle degli autori e non pretende di riflettere la politica ufficiale del governo degli Stati Uniti. La ricerca è stata condotta nel rispetto della legge sulla protezione degli animali e di altre leggi federali e regolamenti in materia di animali ed esperimenti che coinvolgono animali e aderisce ai principi stabiliti nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, National Research Council, 1996. L&#39;impianto in cui è stata condotta questa ricerca è pienamente accreditata dall&#39;Associazione per la valutazione e accreditamento dei Laboratory Animal Care International.

1. Raccolta NALT e Culturing <ol><li> Euthanize topo, utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l&#39;uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. Trasferimento topi ad un asettico spazio di lavoro o di biosicurezza cabinet. Rimuovere la mascella inferiore del mouse e pulire la zona superiore palato con batuffoli imbevuti d&#39;alcol e iodio. </li><li> Utilizzare una lama chirurgica No. 11 nel manico del coltello per tagliare con cura chirurgica e delle accise il palato superiore, seguendo il contorno interno degli incisivi del mouse e dei denti molari. </li><li> Staccare delicatamente il palato con le pinze, facendo attenzione a non strappare il palato. </li><li> Questo passaggio è necessario per ridurre la contaminazione di culture ed è progettato per l&#39;elaborazione palati più. Inserire palati in pozzetti individuali nella prima colonna di una sterile 48-pozzetti pre-riempito con 250 pl di mezzo di coltura completo (37 ° C) costituito da RPMI 1640 integrato con 10% siero fetale bovino, 100 pg / ml streptomicina, 100 UI / ml penicillina, 50 ug / ml di gentamicinae 1 pg / ml fungizone / amfotericina. I media dovrebbero essere tamponata con carbonato di palati se vengono coltivate in una CO 5% 2/95% di aria umida incubatore (37 ° C), o in alternativa utilizzare HEPES 10 mM pH 7,4, per i non-CO 2 cultura. </li><li> Per lavare i palati, usare una pinza per spostare palati in ogni pozzetto successivo in una fila, con attenzione toccando la piastra tra un lavaggio e, fino a quando il palato ha subito un totale di otto lavaggi. </li><li> Trasferire il palato in una nuova sterile 48-pozzetti contenente 250 pl di fresco, mezzo di coltura completo (37 ° C) in pozzetti. </li><li> Collocare le piastre contenenti le palati in un incubatore a 37 ° C per coltura per tutta la durata dello studio. </li><li> Raccogliere campioni per analisi asetticamente trasferendo 100 pl di mezzo da pozzetti di coltura in provette Eppendorf ogni 24 ore, sostituendo con 100 pl di 37 ° coltura fresco C terreno. </li><li> Centrifugare i campioni coltura mezzi a 380 xg per 10 minuti, 4 ° C, a detriti pellet. </li><li> Trasferire il supernatante dal campione centrifugato a nuove provette Eppendorf e conservare a -20 ° C fino al momento analizzare. </li><li> Antigene-specifica IgG, IgM e IgA, o citochine secrete sono misurate in tessuto-coltura surnatanti mediante le normali metodica immunoenzimatica (ELISA). </li></ol> 2. Ablazione chirurgica delle NALT <ol><li> Femmina BALB / c topi, da 7 a 9 settimane di età, sono soggetti idonei, ma altri ceppi sono anche accettabili. Fornire gel-like cibo umido tre giorni prima della chirurgia per acclimatarsi sostituto del mouse per cibo e acqua, che sarà gestito post-operatorio. </li><li> Somministrare una goccia di sollievo dal dolore Metacam farmaco (1,5 mg / ml o 0,05 mg / drop) nella cavità orale prima dell&#39;intervento. </li><li> Anestetizzare topi usando approvato guida IACUC, per esempio, con ketamina, acepromazina, e miscela xilazina (KAX) e applicare una pomata Puralube Vet su occhi per prevenire l&#39;essiccazione. Evitare l&#39;uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. Anesthesia può essere confermata l&#39;assenza di risposta riflessa ad un pizzicotto dolce delle dita dei piedi. </li><li> Somministrare 1 ml di soluzione fisiologica (0,9% di cloruro di sodio USP di iniezione) per via sottocutanea tra le scapole utilizzando un 22-28 gauge e la siringa per prevenire la disidratazione potenzialità del mouse dopo l&#39;intervento. Anche amministrare 0,1 mL di Respiram per via sottocutanea tra le scapole utilizzando un 22-28 gauge e la siringa per promuovere la respirazione sana durante e dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Fornire supporto termico al mouse durante tutte le manipolazioni successive. </li><li> Posizionate il mouse anestetizzato in posizione supina, e utilizzare due anelli separati di sutura chirurgica circa gli incisivi superiori e inferiori a sollevare delicatamente aperto la bocca, esponendo il palato superiore. </li><li> Utilizzare un No. 11 lama chirurgica praticare un&#39;incisione di circa 3 mm di lunghezza lungo la linea mediana del palato superiore nel sito del NALT. </li><li> Inserire un microcurette 0,5 mm nel incisione e raschiare delicatamente sotto i bordi perinterrompere la NALT. </li><li> Cauterizzare l&#39;incisione per arrestare l&#39;emorragia con un ciclo dritto bene su un gruppo termico cauterio. </li><li> Continua supporto termico, mentre recupera il mouse verso la piena consapevolezza e l&#39;attività. </li><li> Fornire il mouse con soluzione salina per via sottocutanea fino a tre volte al giorno, 1 ml per iniezione tra le scapole, per prevenire la disidratazione, come farmaci per il dolore necessario, e per via orale una volta al giorno per 3 giorni post intervento chirurgico. Determinare la disidratazione eseguendo un test tenda di pelle per verificare turgore della pelle. Afferrare pelle e del pelo tra le lame spalle in modo che sia tented alto. Se la pelle ritorna rapidamente al normale, posizione precedente, il mouse non è disidratato. Se la pelle rimane elevata e si muove lentamente, il topo è in uno stato di disidratazione e richiede salina. Fornire cibo umido per almeno tre giorni dopo un intervento chirurgico per un tempo sufficiente per il recupero. </li><li> Prima di tutte le procedure sperimentali, osservare i topi per 8-10 giorni, monitorando l&#39;aumento di peso. Peso scarso recuperodi solito indica la guarigione incompleta palato, e questi topi dovrebbero essere ritirati dal ulteriori studi. </li></ol> 3. Preparazione NALT per l&#39;istologia e valutare il successo di Chirurgia NALT <ol><li> Il successo della chirurgia NALT deve essere accertata da istologia come descritto di seguito. Dopo aver completato tutti gli studi sperimentali, preparare i topi per le collezioni cranici da eutanasia utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l&#39;uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. </li><li> Afferrare la nuca del mouse eutanasia. Rimuovere la mandibola inferiore dal resto del cranio tagliandoli attraverso i processi condilari con forbici su entrambi i lati. </li><li> A partire dalla nuca, togliere la pelle e la pelliccia dal cranio lentamente pelatura e taglio verso il lato ventrale del cranio. </li><li> Rimuovere con cura la pelle intorno alla zona nasale e tagliare la pelle al largo della punta del muso per rimuovere completamente. </li><li> Staccare il cranio dalla wit vertebresnip ha delle forbici. </li><li> Inserire le forbici nel forame magno e tagliare a metà il cranio lungo la linea mediana per consentire la permeazione di formalina nei tessuti molli durante la fissazione. </li><li> Fissare cranio in 10% formalina tamponata neutra (NBF) per 24 ore a temperatura ambiente. </li><li> Per decalcificazione, posizionare il campione e la cassetta separata, avvolto in una garza per impedire Rexyn di toccare l&#39;osso, in bottiglia con la miscela di acido formico. Incubare per 12 ore a temperatura ambiente, poi lavare continuamente sotto acqua di rubinetto per circa 20 minuti. </li><li> Tagliare il campione al setto nasale e passate orbite l&#39;occhio con una lama di rasoio. </li><li> Campione e cassette possono essere conservati a breve termine nel 10% NBF. </li><li> Porre campione su un processore tessuto per l&#39;elaborazione notte. Questo viene fatto per rimuovere l&#39;acqua dal campione in preparazione per paraffina. </li><li> Rimuovere il tessuto trasformati, incorporare in un blocco di paraffina con il muso verso il basso, e lasciarlo raffreddare. </li><li> Trim rough 15 um sezioni trasversali del blocco con un microtomo automatizzato, avvicinando la posizione approssimativa del NALT, poi continuare il taglio in sezioni 5 micron per il montaggio su vetrini in un bagno di acqua 44,3 ° C. </li><li> Ematossilina ed eosina (H &amp; E) colorazione istologia dovrebbero essere utilizzati per valutare l&#39;ablazione NALT. </li></ol> 4. Raccolta di campioni biologici provenienti da topi 4,1 Siero <ol><li> Con attenzione elevando la temperatura corporea con una lampada di calore aumenta il flusso sanguigno. Prelevare il sangue per intaccare la vena laterale della coda con una lama chirurgica. Lasciare che il sangue gocciolare liberamente in un tubo separatore di siero Microtainer. </li><li> Applicare una leggera pressione al nick con materiale assorbente, come la garza o un asciugamano, per fermare il flusso di sangue. </li><li> Lasciare che il sangue coaguli nelle Microtainers per 30 minuti, quindi centrifugare tra 6-15 x 1000 g per almeno 90 secondi. </li><li> Commutazione separato dal siero Microtainer in una provetta pulita per Eppendorfconservazione a -80 ° C. </li></ol> 4,2 Saliva <ol><li> Tenete il mouse anestetizzato verticale durante il pipettaggio 20-30 fosfato ul sterile soluzione salina tamponata (PBS) tra la guancia e la gengiva. Raccogliere la saliva diluita dirigendo punta della pipetta tra la guancia e la gengiva. </li><li> Trasferire la saliva diluito in una nuova provetta contenente 10 L di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. </li></ol> 4.3 secrezioni nasali <ol><li> Eutanasia del mouse prima di raccogliere le secrezioni nasali, utilizzando approvato guida IACUC. Evitare l&#39;uso di anestetici inalatori che possono influenzare NALT. </li><li> Tenendo il mouse verticalmente, con attenzione pipettare 30 microlitri di PBS sterile in una narice e raccogliere risciacquo da altra narice. </li><li> Trasferimento risciacquo in una nuova provetta contenente 10 pl di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. </li></ol> 4.4 secrezioni vaginali <ol><li> Inserire la punta di una micropipetta nell&#39;apertura di thvulva e del mouse eutanasia, lavare la vagina con 50 microlitri di PBS sterile e raccogliere tutto il liquido dalla micropipetta. </li><li> Trasferimento risciacquo in una nuova provetta contenente 10 pl di inibitori della proteasi 2x e conservare a -20 ° C. </li></ol> 5. Anticorpi antigene-specifici o citochine nei campioni raccolti possono essere misurate mediante ELISA o un altro metodo quantitativo. 6. Risultati rappresentativi La Figura 1 fornisce una vista schematica generale di fasi coinvolte con l&#39;elaborazione del NALT contenente tessuto per l&#39;analisi ex vivo. In Figura 2 (A, B), la dimensione del palato è mostrato, così come la posizione del incisione ablazione durante l&#39;intervento chirurgico (A), come indicato dalla linea tratteggiata. La posizione di NALT sono indicati da frecce nella zona premolare su un asportato ematossilina-tinto palato in Figura 2 (C), mostra i tessuti paralleli. Figura 3presenta passaggi della chirurgia interruzione NALT, mostrando l&#39;esposizione del palato superiore per l&#39;accesso a NALT (A, B), ablazione (C), e la cauterizzazione finale della incisione (D). Un tipico EE sezione trasversale della zona del seno nasale circostante il NALT prima dell&#39;intervento chirurgico è mostrato in Figura 3E, mentre un&#39;immagine di perturbazione NALT dal microcurette direttamente dopo l&#39;intervento appare in figura 3F. Un tempo sufficiente per il recupero da un intervento chirurgico, le incisioni devono essere chiusi e la cavità nasale privo di NALT (Figura 3G). Tipici risultati sperimentali ottenuti con queste tecniche sono mostrati nella Figura 4, confrontando supernatanti di coltura dei tessuti e campioni biologici da uno studio di un vaccino a subunità stafilococco (STEBVax). I topi sono stati somministrati STEBVax da intranasale (IN) o intraperitoneale (IP) rotte. Il vaccino è stato formulato con un adiuvante che attiva il recettore Toll-like 4 percorso di 3,1<html> 4, e controlli sono stati dati solo soluzione salina o vaccino senza adiuvante. NALT Cultured ottenuti da gruppi sperimentali secreto antigene-specifiche immunoglobuline in mezzo che era misurabile con il metodo ELISA. In questo esempio (Figura 4A), i risultati indicano che le grandi quantità di IgA sono stati rilasciati dal NALT ottenuti da topi vaccinati con un vaccino a subunità combinato con adiuvante. I campioni biologici (come siero, saliva, secrezioni nasali, secrezioni vaginali) acquisiti dal controllo o NALT-topi senza può essere utilizzato per analizzare la risposta in vivo immunitaria agli antigeni nasali per confronto con i risultati delle colture tissutali. In figura 4b, IgA e IgG risposte nella vaccinazione erano significativamente ridotta senza NALT funzionale. I livelli di antigene-specifica IgA erano generalmente superiori IgG nelle secrezioni mucose (saliva, lavaggi nasali) dei topi vaccinati. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema di raccolta NALT e la coltura ex vivo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figura 2. Visualizzazione del palato topo che indica la posizione di incisione NALT e chirurgia. Dimensioni e posizione del palato superiore con incisione chirurgica indicata con linea tratteggiata (A); palato superiore escluso (B) o colorate in ematossilina (C) per visualizzare il NALT parallelo nella zona premolare del palato (tinto viola scuro sul lato anteriore del palato ). NALT indicato dalle frecce. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figura 3. NALT interruzione chirurgica. Le fasi principali della chirurgia interruzione NALT: vista supina del palato superiore del mouse prima dell&#39;intervento chirurgico (A); incisione sulla linea mediana fatta palato superiore per accedere al NALT (B); microcurette sonda inserita attraverso un&#39;incisione mediana per interrompere struttura in NALTgrità (C); cauterizzazione di incisione a conclusione dell&#39;intervento (D). Immagini al microscopio delle cavità nasali, colorati H &amp; E, prima della chirurgia (E), subito dopo l&#39;intervento chirurgico (F), e un successo guarito, NALT-free di topo (G). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figura 4. Vaccino anticorpi specifici da NALT colta, saliva e secrezioni nasali raccolti dai topi vaccinati. Topi di controllo NALT-free o normale sono stati vaccinati o IP con STEBVax e campioni biologici sono stati raccolti. I livelli anticorpali dei campioni in triplicato sono stati misurati usando ELISA. (A) NALT sono stati rimossi dai topi di controllo (non chirurgicamente manipolata) e messe in coltura per esaminare la risposta anticorpale. Il vaccino-specifica risposta di IgA in coltura per IN topi vaccinati era statisticamente differente da controlli (Student t-test, p ≤ 0,01, rispetto al non adiuvante o no vaccino). (B) interruzione NALT sostanzialmente ridotto risposte anticorpali specifichea IN vaccinazione. Ci sono state differenze significative tra i livelli di anticorpi specifici di NALT-and NALT + gruppi (non intervento chirurgico o di controllo) per tutti i confronti, tranne saliva risultati IgG (Student t-test, p ≤ 0,05).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Abbiamo presentato metodi collettivi per lo sviluppo di un modello animale, per ottenere campioni biologici e saggi per l&#39;esame delle risposte immunitarie NALT-associate 1-4. Ci sono altri fattori da considerare durante l&#39;esecuzione di questi metodi. Tecniche standard di sterili per la chirurgia e la cultura del tessuto devono essere seguite. Una combinazione di agenti antibatterici e antifungini utilizzati durante isolamento e la coltura, oltre a mantenere strumenti sterilizzati, zona di lavoro, e palati disinfettati ridurrà il rischio di contaminazione. Saliva, lavaggi nasali e simili campioni di secrezione mucosa dovrebbe essere ispezionata potenziale contaminazione con il sangue, come gli anticorpi sierici si trovano generalmente in concentrazioni più elevate. Inoltre, secrezioni mucose deve essere leggermente diluito in analisi per basse concentrazioni di anticorpi sono presenti in questi campioni rispetto al siero. I topi devono essere tenuti al caldo subito dopo l&#39;intervento chirurgico per presfogare la potenziale anestesia indotta l&#39;ipotermia. Alternate i topi riposano sul fianco durante il recupero post-intervento chirurgico per ridurre al minimo la respirazione irregolare. La procedura chirurgica è più efficiente con tre individui che lavorano insieme per completare questi compiti: uno di eseguire l&#39;intervento chirurgico, uno per aiutare a tenere la bocca aperta, e uno per fornire assistenza post-chirurgica, come i topi riprendersi dall&#39;anestesia. È necessario utilizzare la colorazione H e E di cranici sezioni trasversali al termine di tutte le procedure sperimentali o studi per verificare il successo della chirurgia per ciascun topo. Esiti di chirurgia possibili sono: NALT ablazione completa e bilaterale, ablazione incompleta o NALT intatto. Poiché non tutti gli interventi chirurgici comporta la perdita completa del NALT, animali con NALT residuo o intatto può essere utilizzato come controllo interno. Un altro risultato potenziale è che il palato non riesce a guarire completamente, lasciando un&#39;apertura che collega il naso e le cavità orali. Incompletoguarigione del palato si tradurrà in basso peso e ritardo della crescita, e questi individui dovrebbero essere rimossi dagli studi. Esaminando le risposte primo vaccino con il modello di topo servirà a stabilire un ruolo per NALT nel risultato di studio previsto (risposta anticorpale, la sopravvivenza, ecc.) Chirurgicamente rimuovendo il NALT facilita la determinazione dei contributi nasali per l&#39;immunità locale e sistemica. L&#39;approccio chirurgico qui descritto è il metodo più diretto per ottenere un modello murino privo di NALT. Selezionare knock-out modelli murini sono stati segnalati NALT mancanza, ma questi animali sono anche carenti di citochine e chemochine essenziali per lo sviluppo di altri tessuti linfatici secondari, e possono ospitare ulteriori difetti 12,13. Inoltre, i metodi descritti qui sono stati sviluppati per esaminare diversi aspetti della risposta immunitaria originari all&#39;interno dei passaggi nasali. I nostri risultati sperimentali si basano su studi che usano il palato tutta la parte superioree dal mouse per coltura tissutale, anche se è possibile che le sezioni possono essere utilizzati. Infine, il modello NALT coltivato è utile per eseguire esperimenti completamente in coltura tissutale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Lame in acciaio inossidabile chirurgico sterile, N. 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Knife Handle, No. 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48 e piastre di coltura cellulare </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino, inattivato al calore </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Conc. finale: 10% in volume in terreni di coltura </td></tr><tr><td> Streptomicina solfato </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Conc. finale: 100 pg / mL </td></tr><tr><td> Penicillina </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Conc finale: 100 UI / mL </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ML </td><td> Conc. finale: 50 ug / mL </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Conc. finale: 1 ug / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Conc. finale: 10 mM </td></tr><tr><td> Microcentrifuga Eppendorf Tubes </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel Cherry alimentare mouse Flavored Wet </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-VASSOIO </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> Una goccia di 1,5 mg / ml sospensione orale </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Co finalenc: 6,06 mg / mL </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Conc. finale: 0,061 mg / mL </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Conc. finale: 0,667 mg / mL </td></tr><tr><td> Puralube Vet Pomata </td><td> Pharmaderm Animal Health </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% cloruro di sodio USP di iniezione </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 millimetri Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Cautery unità termica </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Tip Replacement, Straight Loop fine </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% di formalina tamponata neutra </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Acido formico </td><td> Pescatore </td><td> A119P-4 </td><td> Mescolare 426 ml di acido formico in 1047 ml di acqua del rubinetto, quindi aggiungere 45 mL Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Pescatore </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microtomo Rotary </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina di Mayer </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina Gill No.1 </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Serum Separator </td><td> BD Medico </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2 PO 4, 140 mM NaCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Cocktail inibitori della proteasi, EDTA-free </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

I tessuti linforeticolari nasofaringeo-associati (NALT) che si trovano negli esseri umani, roditori ed altri mammiferi, contribuiscono a immunità nei seni nasali 1-3. Il NALT sono due parallele a forma di campana strutture localizzate nei passaggi nasali al di sopra del palato duro, e di solito sono considerati componenti secondari della mucosa-associato sistema linfatico 4-6. Situato all&#39;interno del NALT sono compartimenti distinti di linfociti B e T intervallati da cellule presentanti l&#39;antigene dendritiche 4,7,8. Queste cellule sono circondati da uno strato di cellule epiteliali intercalato con M-cellule che sono responsabili per il recupero antigene dalle superfici mucose delle vie respiratorie 9,10. Naive dei linfociti circolanti attraverso il NALT sono pronti a rispondere a primi incontri con agenti patogeni respiratori 7. Mentre NALT scompaiono negli esseri umani dall&#39;età di due anni, gli organi linfatici del Waldeyer Anello e, analogamente strutturato continuano a persistere °roughout vita 6. In contrasto con gli esseri umani, topi NALT mantenere per tutta la vita, fornendo così un modello animale conveniente per lo studio di risposte immunitarie originari all&#39;interno dei seni nasali 11. Colture di unicellulari sospensioni di NALT non sono pratici a causa di basse rese di cellule mononucleate. Tuttavia, biologia NALT può essere esaminato coltura ex vivo dell&#39;organo intatto, e questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo di mantenere la struttura del tessuto naturale. Poiché in studi in vivo, i modelli che presentano difetti genetici knockout limitati a NALT non sono attualmente disponibili a causa di una scarsa comprensione del percorso di sviluppo. Per esempio, mentre linfotossina-a topi knockout sono atrofizzati NALT, placche di Peyer, linfonodi periferici, cellule follicolari dendritiche e di altri tessuti linfoidi sono alterati in questi topi geneticamente manipolati 12,13. In alternativa a topi knockout gene, p ablazione chirurgicaelimina ermanentemente NALT dal passaggio nasale senza influenzare altri tessuti. Il modello di topo risultante è stato utilizzato per stabilire relazioni tra le risposte NALT e immune ai vaccini 1,3. La raccolta di serie del siero, saliva, lavaggi nasali e secrezioni vaginali è necessario per stabilire la base delle risposte di accoglienza alla vaccinazione, mentre le risposte immunitarie provenienti direttamente dal NALT può essere confermata da coltura tissutale. Le procedure seguenti illustrano gli interventi chirurgici, la cultura dei tessuti e la raccolta dei campioni necessari per esaminare le risposte umorali locali e sistemici immunitarie a intranasale (IN) la vaccinazione.

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Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

I metodi per esaminare i contributi dei tessuti linforeticolari nasofaringeo associati (NALT) a risposte immunitarie nasali e sistemici di topi ai vaccini per via endonasale sono descritti. Abbiamo dimostrato una procedura chirurgica per stabilire una NALT-dipendente modello di topo e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Culture di NALT estratti.

Esaminando il ruolo della rinofaringeo associata Tissue linforeticolare (NALT) nelle risposte mouse ai vaccini

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.7K Views.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. I metodi per esaminare i contributi dei tessuti linforeticolari nasofaringeo associati (NALT) a risposte immunitarie nasali e sistemici di topi ai vaccini per via endonasale sono descritti. Abbiamo dimostrato una procedura chirurgica per stabilire una NALT-dipendente modello di topo e Ex vivo Culture di NALT estratti.

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Ricerca

Bioingegneria

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Immunologia e infezioni

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of vaccine to lymph nodes where antigen presenting cells can interact with lymphocytes for generation of the wanted immune responses. The strength and the type of immune responses induced also depend on the density or frequency of interactions as well as the microenvironment, especially the content of cytokines. As only a minute fraction of peripherally injected vaccines reaches the lymph nodes, vaccinations of mice and humans were performed by direct injection of vaccine into inguinal lymph nodes, i.e.&#160;intralymphatic injection. In man, the procedure is guided by ultrasound. In mice, a small (5-10 mm) incision is made in the inguinal region of anesthetized animals, the lymph node is localized and immobilized with forceps, and a volume of 10-20 &#956;l of the vaccine is injected under visual control. The incision is closed with a single stitch using surgical sutures. Mice were vaccinated with plasmid DNA, RNA, peptide, protein, particles, and bacteria as well as adjuvants, and strong improvement of immune responses against all type of vaccines was observed. The intralymphatic method of vaccination is especially appropriate in situations where conventional vaccination produces insufficient immunity or where the amount of available vaccine is limited.

Prophylactic and therapeutic vaccination often fails to stimulate strong immune responses due to week drainage of the vaccine to lymph nodes and consequently poor involvement of immune cells. By direct injection of vaccine to lymph nodes, so-called intralymphatic injection, vaccine efficacy can be strongly improved and vaccine doses can be reduced.

Endolinfatica immunoterapia e di vaccinazione nei topi

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

L&#39;efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.

Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante l'infezione da virus influenzale A nei topi

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Rapida In Vivo valutazione della funzionalità di generazione i linfociti T citotossici di adiuvante per lo sviluppo di vaccini

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

Medicina

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Intranasal Immunization with BCG in a Mouse Model

Source: Uranga, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54440">Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates intranasal BCG immunization in mice, activating both innate and adaptive immune responses, leading to the development of lung-resident memory T cells and effector B cells, thus enhancing protection against Mycobacterium infections.

Immunizzazione intranasale con BCG in un modello murino

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Esaminando il ruolo della rinofaringeo associata Tissue linforeticolare (NALT) nelle risposte mouse ai vaccini

Riepilogo

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Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l'attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride