Questi studi sono stati finanziati, in parte, Ospedale dei Bambini Revenue Boston Urologia Fondo di dotazione e il National Institutes of Health sovvenzioni NIBIB P41-EB002520 (Kaplan); NIDDK T32-DK60442 (Freeman); NIDDK 1K99-DK083616 (Mauney). Noi riconosciamo il dottor Peter Zvara presso la University of Vermont per l&#39;assistenza nello stabilire la tecnica per il posizionamento del tubo cistostomia e cistometria.

Metodi chirurgici 1. Preparazione chirurgica e anestesia <ol><li> Impostare il campo chirurgico sterile con gli strumenti chirurgici necessari per la rasatura: cesoie, pinze con denti, belle pinze atraumatiche, driver con ago sottile, garze, forbici, forbici Metzenbaum tenotomia, lama bisturi, ago ipodermico, 30 gauge, soluzione salina riempita siringa da 1 ml, quattro 6-0 suture in polipropilene, 7-0 poliglattina sutura, suture poliglattina 4-0. </li><li> Anestetizzare la animale con isoflurano inalazione nella camera di induzione. Conferma induzione completa dell&#39;animale prima del trasferimento al campo chirurgico. Assicurarsi che il tubo di anestesia per inalazione è in posizione adeguata per avere l&#39;anestesia continua. </li><li> Posizionare il supina animale sul telino sterile. [Per l&#39;analisi cistometrica, vedere la sezione in tunnel sotto il catetere cistostomia.] </li><li> Utilizzare le cesoie di rasatura per eliminare il pelo dal basso addome. </li><li> Prep l&#39;addome con esseretadine e il 70% di etanolo. </li><li> Prima di incisione, un analgesico come buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) può essere iniettata per via sottocutanea per il controllo del dolore perioperatorio. </li></ol> 2. Incisione ed esposizione della vescica <ol><li> Fare un centimetro 1-2 (dipende dalla dimensione dell&#39;animale e se ratto o mouse) un&#39;incisione mediana inferiore, con il bisturi attraverso la pelle. Approfondire l&#39;incisione nella parte inferiore della incisione attraverso il muscolo retto facendo attenzione a non danneggiare l&#39;intestino o la vescica sottostante. </li><li> Utilizzando pinze dentate, elevare il muscolo retto e sezionare libera la superficie posteriore del muscolo con belle forbici Metzenbaum. </li><li> Incidere il resto del muscolo sulla linea mediana per tutta la lunghezza della incisione cutanea. </li><li> Consegnare la vescica attraverso la ferita incisionale (Figura 1). La vescica è di solito l&#39;organo più dipendenti nel bacino. (Nel maschio, la prostata è effettivamente più dipendente ed è maggiorevescica decompressa.) </li><li> Mettere una sutura soggiorno attraverso la parete posteriore della vescica, e poi un altro attraverso la parete anteriore della vescica con sutura in polipropilene 6-0. Porre suture supplementari lateralmente. Non legare questi punti di sutura. Quando le suture sono teso, la vescica avrà una configurazione quadrata di circa 1 cm 2 (Figura 2). Fare attenzione a non avere troppa tensione su questi punti di sutura in quanto possono essere facilmente estratto attraverso il tessuto della vescica. </li><li> Incidere la vescica longitudinalmente attraverso la parete anteriore della vescica (appena inferiore alla cupola della vescica) nella linea mediana di circa 1 cm (1,5-2 cm nella vescica ratto). </li></ol> 3. Anastomosi dell&#39;impalcatura <ol><li> Utilizzando forbici sottili, tagliare il patibolo seta per l&#39;area approssimativa del difetto vescicale. </li><li> Utilizzando 7-0 sutura poliglattina, partono da un angolo del palco e suturare alla vescica in un continuo, in esecuzionemoda per creare una tenuta stagna tutto intorno al difetto (Figura 3). </li><li> Verificare l&#39;integrità della anastomosi riempiendo la vescica con soluzione salina sterile instillando attraverso la parete della vescica con un ago ipodermico 30 gauge. Se viene trovata una perdita, questo può essere chiuso con un ulteriore 7-0 interrotto poliglattina sutura per chiudere il gap. </li><li> Ridurre la parte posteriore della vescica ricostruita nell&#39;addome. </li></ol> 4. Chiusura incisionale <ol><li> Prima della chiusura della parete addominale, iniettare il muscolo retto e del tessuto sottocutaneo con bupivicaine per anestesia locale (&lt;3 mg / kg di 0,25%). </li><li> Reapproximate del muscolo retto con un continuo, sutura continua poliglattina 4-0. </li><li> Chiudere la pelle con un continuo, sutura continua poliglattina 4-0. </li><li> Pulire e asciugare l&#39;incisione (Figura 4). </li><li> Trasferire l&#39;animale in un ambiente caldo, gabbia pulita per il risveglio dall&#39;anestesia. </li></ol&gt; I passaggi per il posizionamento del catetere cistostomia per l&#39;analisi cistometrica sono i seguenti: 5. Tunneling il catetere cistostomia <ol><li> Impostare il campo chirurgico sterile con gli strumenti chirurgici necessari: forbici da barba, pinze con i denti, belle pinze atraumatiche, driver con ago sottile, garze, forbici Metzenbaum, forbici tenotomia, piccola pinza curva, bisturi, polipropilene 6-0, 4-0 poliglattina sutura, 3-0 sutura di seta (seta sutura 4-0 per i topi), ago 18G, 22G la punta smussata, ago 25G, 1 ml di soluzione fisiologica siringa riempita, 50 tubi in polietilene (PE-50) tagliato per una lunghezza di ~ 10 cm. </li><li> Flare l&#39;estremità del tubo PE-50 delicatamente esponendolo a una fiamma. Attenzione a non fondere fine off o occludere il lume (questo può essere verificato iniettando salina attraverso un ago 25G collegato all&#39;estremità &quot;non-svasato&quot; e garantendo un flusso). Questo serve come un&#39;ancora per mantenere il tubo all&#39;interno della vescica (Figura 5). </li><li&gt; Anestetizzare l&#39;animale di cui sopra al punto 1.2. </li><li> Utilizzare le cesoie di rasatura per eliminare il pelo sia dal dorso dell&#39;animale tra la scapola e il basso addome sul ventre. </li><li> Prep le aree con betadine e il 70% di etanolo. Posizionare l&#39;animale prona sul telo. </li><li> Fai un 1 centimetro incisione sul dorso tra la scapola. Utilizzando il forbici Metzenbaum, sviluppare un piano tra la pelle e il muscolo sottostante ponendo le punte delle forbici nel piano e diffusione per creare un tunnel intorno al ventrale. </li><li> Riposizionare il supina animale. Fai la tua incisione addominale ed esporre la vescica come sopra ai punti 2.1-2.4. Ridurre la vescica nuovamente dentro l&#39;addome. </li><li> Mettere una piccola pinza nella tua tunnel sottocutaneo creata in 5.6 passo a partire dalla incisione cutanea dorsale. Usando le dita per proteggere i contenuti intra-addominali, Pierce attraverso la parete addominale con le punte della pinza nell&#39;addome. </li><li> Afferrare la smooth fine del tubo PE-50 con il morsetto e tirare indietro attraverso l&#39;incisione dorsale. Assicurarsi che la fine bulbed non è tirato oltre la parete addominale (Figura 6). </li></ol> 6. Posizionamento del tubo cistostomia <ol><li> Consegnare la vescica attraverso l&#39;incisione. Da questo punto in poi, la vescica deve essere maneggiato con pinze sottili per evitare traumi alla vescica che potrebbero causare danni o infiammazioni che possono inclinare i risultati cistometrici o provocare ulteriore disagio per l&#39;animale nel post-operatorio. </li><li> Prendere nota del sito proposto per il tubo cistostomia. Deve essere collocato alla cupola della vescica (superiore al segmento spessore di appoggio). Questo impedirà attorcigliamento o occlusione del tubo. </li><li> Utilizzando il 6-0 sutura in polipropilene, posizionare un punto pursestring alla cupola della vescica nel modo seguente: posto il primo lancio attraverso la parete della vescica longitudinalmente, laterale al sito proposto per il tubo cistostomia. Lasciare un morsetto sulla estremità libera in modo che la sutura non viene inavvertitamente tirato fino in fondo. Posizionare la successiva rimessa in direzione trasversale, partendo entrando nella parete della vescica leggermente laterale per l&#39;uscita del primo tiro. </li><li> Non tirare la sutura tesa. Inserite il vostro prossimo parallelo di sutura per il primo (in senso longitudinale) che va nella vescica appena cranialmente al sito di uscita del tuo ultimo sutura trasversale. Il quarto tiro si avvia verso l&#39;uscita laterale del l&#39;ultimo punto e alla fine accanto all&#39;ingresso per il lancio molto prima. Fatto correttamente, questo forma una piazza circolare intorno al sito del catetere proposto (Figura 7). </li><li> Utilizzo di un ago 18G, perforare la parete della vescica nel centro della sutura pursestring. Fare attenzione a non forare troppo in profondità (quel tanto che basta per essere intraluminale). Inserire le punte delle vostre belle pinze in apertura e delicatamente si diffuse per allargare il foro. </li><li> Inserire l&#39;estremità bulbed del catetere nel difetto nellavescica finché è intraluminale. Tirare la sutura pursestring stretta intorno al catetere e cravatta verso il basso. Questo dovrebbe cinch parete della vescica attorno al catetere mantenendolo in posizione (Figura 8). </li><li> Prendete una delle estremità della sutura e avvolgerlo intorno al catetere una volta e legare questo per fissare ulteriormente il catetere. </li></ol> 7. Verifica del catetere e chiusura incisione addominale <ol><li> Con un ago siringa da 1 ml e 25G, inserire l&#39;ago nel tubo e iniettare lentamente soluzione salina per distendere la vescica. Osservare la presenza di perdite intorno al catetere. Una volta che si vede perdite dall&#39;uretra, aspirare la soluzione salina per decomprimere la vescica di nuovo. </li><li> Chiudere l&#39;incisione addominale come sopra ai punti 4.1-4.4. </li></ol> 8. Chiusura della incisione dorsale e protezione del catetere (per ratti) <ol><li> Riposizionare l&#39;animale prona. </li><li> Tagliare il tubo del catetere, a livello della cute con le forbici. Inserire un blunt ti 22Gdell&#39;ago nel tubo p. </li><li> Chiudere la pelle sopra il tubo con poliglattina 4-0 in modo esecuzione. Lasciare il mozzo dell&#39;ago estrusione dalla pelle. </li><li> Inserire un tappo per via endovenosa on line l&#39;ago. Utilizzo di sutura di seta 3-0, fissare la punta del catetere alla pelle (Figura 9). </li><li> Pulire l&#39;incisione. Trasferire il ratto in un ambiente caldo, gabbia pulita per il risveglio dall&#39;anestesia. </li></ol> 8. * Chiusura incisione dorsale e protezione del catetere (per topi o ratti) <ol><li> * Occludere l&#39;estremità distale del catetere da piegature o utilizzando una fiamma per fondere la fine. </li><li> Bobina * l&#39;estremità del tubo e lasciare nella sacca sottocutanea sul dorso dell&#39;animale (NON tagliare tubo per abbreviare) (Figura 10). </li><li> * Chiudere la pelle sopra il tubo con poliglattina 4-0 in modo esecuzione (Figura 11). </li><li> * Il giorno della cistometria, preparare l&#39;incisione dorsale con Betadine e il 70% di etanolo. Aprire l&#39;incisione dorsale in anestesia e rimuovere il tubo a spirale dal sacchetto per via sottocutanea. Chiudere l&#39;incisione. Awaken l&#39;animale dall&#39;anestesia ed eseguire cistometria quando è completamente sveglio. </li></ol> 9. Risultati rappresentativi - Metodi chirurgici La vescica deve essere ricostruito come stagna possibile, per evitare complicazioni legate ad una perdita urinaria significativa (Figura 3). Dolore o fastidio di solito si manifestano come brividi o graffi e rosicchia l&#39;incisione addominale. Questo può essere gestito con il quotidiano iniezioni sottocutanee di una non-steroidei anti-infiammatori come il meloxicam (0.5-1.0 mg / kg per via sottocutanea). In genere, gli animali richiedono solo le iniezioni per i primi 3 giorni post-operatorio. Questo può essere integrato con un oppioide, come buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea ogni 8-12 ore), se necessario. Gli animali devono essere controllati 3 volte al giorno per i primi 3 post-operatorio giorni, twdi ghiaccio al giorno per post-operatorie giorni 3-5 e poi giornalmente successivamente a valutare per il dolore, segni di infezione, di adeguata cicatrizzazione, attività, governare, e turgore della pelle. Antibiotici (Baytril, 5mg/kg sottocutanea ogni 24 ore in un volume non superiore a 0,1 mL) sono indicati per il primo intervento 72 ore di seguito, come profilassi contro l&#39;infezione chirurgica. Segnali di ripresa normale sono deambulazione normale e livelli di attività, un&#39;alimentazione adeguata e bere, l&#39;assenza di dolore o disagio (senza vocalizzazione) e la socializzazione normale con cagemates. Un tempo di recupero di almeno 5-7 giorni deve essere somministrato prima dell&#39;analisi cistometrica, per consentire la guarigione della vescica ed è diminuito l&#39;infiammazione che potrebbe influire sui risultati. Analisi cistometrici 10. Awake Analisi cistometrici <ol><li> Setup descritto con MLT844 ADInstruments con la cattura e analisi dei dati con LabChart v6 (ADInstruments) e con una pompa di infusione siringa 22 Harvard (Harvard apparecTus, Holliston, MA), anche se altri sistemi analoghi sono disponibili (Figura 12). </li><li> Calibrare volume e pressione sulla base delle specifiche del sistema cistometrica utilizzato. </li><li> Mettere gli animali in gabbie metaboliche (gabbie con un pavimento di rete metallica), che sono sospesi su un scala. La scala è collegato ad un trasduttore. </li><li> Spurgare il sistema di eventuali bolle d&#39;aria e garantire un flusso continuo dalla pompa di infusione. </li><li> Collegare il sistema di acquisizione dati ad un computer e osservare per tracciati di dati. Regolare la scala di conseguenza. La pressione della vescica e del volume delle urine saranno registrati in continuazione. </li><li> Accedere i cateteri soprapubico con un ago 27G collegato tramite un tubo a T al trasduttore di pressione e la pompa per infusione. Iniziare l&#39;infusione di soluzione salina fisiologica a 12,5 pL / min per il mouse e 100 pl / min per il ratto. </li><li> Lasciare il modello svuotamento tracciamento per stabilizzare (aumento della pressione della vescica, seguito da un vuoto). Questo richiede di solito approssimativanell&#39;intervallo 10-20 minuti. Registrare i cicli della minzione per 45-120 minuti o almeno 3-4 cicli di svuotamento. </li><li> Osservare l&#39;intera procedura in tempo reale per risolvere eventuali complicazioni che porteranno ad un artefatto (kinking del catetere ad esempio, ostruzione, ecc, vedi sotto discussione). </li><li> Arrestare l&#39;infusione, scollegare il catetere dal sistema, e l&#39;animale ritorna alla sua gabbia. </li></ol> 11. Inconscio Analisi cistometrici (No catetere sovrapubica) <ol><li> Anestetizzare la animale con uretano (1-2 g / kg) iniezione intraperitoneale (IP). </li><li> Esporre la vescica come sopra ai punti 1.3-2.4. </li><li> Calibrare il sistema come nel passaggio 9,2. Preparare il sistema come nel passaggio 9,4-9,5. </li><li> Inserire un ago 27G collegato tramite un tubo a T al trasduttore di pressione e la pompa di infusione nella parte laterale della vescica. </li><li> Registrare i cicli della minzione per 45-90 minuti. </li><li> Interrompere l&#39;infusione, rimuovere l&#39;ago dalla vescica e l&#39;eutanasia degli animali. &lt;/ Li&gt; </ol> 12. Risultati rappresentativi - Analisi cistometrici Tracciati urodinamici possono poi essere analizzati per ricavare parametri quali volumi annullate, la conformità, picco pressioni minzionali, intervallo tra la contrazione, tempo di ciclo della minzione e volumi vuoti residui postali. Cystometrogram può essere diviso in un riempimento e una fase di svuotamento. Una fase normale riempimento è la porzione del ciclo della minzione in cui vescica si riempie con poche variazioni della pressione intravescicale. Una fase di svuotamento normale del tracciato è costituito da un costante aumento della pressione intravescicale corrispondente alla contrazione del detrusore. La massima pressione raggiunta durante la fase di svuotamento del tracciato viene definito la pressione di picco svuotamento. Un picco di alta pressione di svuotamento potrebbe suggerire un modello ostruttivo svuotamento, una vescica o un capriccio hypercontractile nel catetere SP. Compliance può essere calcolato acquisendo il rapporto tra il volume da infondere during la fase di riempimento e la variazione di pressione (rispetto = AV / AP). Una vescica hypocompliant è uno che non è in grado di ospitare adeguati volumi urinari a basse pressioni. L&#39;intervallo intercontraction può essere calcolato analizzando il tempo tra due contrazioni come visto sulla cystometrogram. Un intervallo breve intercontraction è indicativa di una vescica irritabile. Il tempo di ciclo della minzione si riferisce al tempo impiegato da un riempimento e svuotamento intera fase di completare e può essere facilmente determinata mediante analisi del tracciato. Al termine della cistometria, post-vuoto residuo (PVR) può essere ottenuta. Questo viene fatto aspirando il catetere sovrapubica al compimento di una contrazione del detrusore. Questi parametri aiutare l&#39;investigatore oggettivamente studiare la dinamica della vescica, come la vescica si riempie e si svuota. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografia della incisione addominaleed estrusione della vescica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig2.jpg" /> Figura 2. Incisione vescica con esposizione del lume vescica. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig3.jpg" /> Figura 3. Integrazione dell&#39;impianto sulla parete della vescica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig4.jpg" /> Figura 4. Fotografico dell&#39;incisione chiuso. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig5.jpg" /> Figura 5. Estremità svasata del tubo PE-50. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig6.jpg" /> Figura 6. PE-50 tubo (catetere) attraverso l&#39;incisione dorsale. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig7.jpg" /> Figura 7.Pursestring sutura. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig8.jpg" /> Figura 8. Fissaggio del catetere alla vescica. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig9.jpg" /> Figura 9. Catetere Secured. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig10.jpg" /> Figura 10. Tubo a spirale in tasca sottocutanea. <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig11.jpg" /> Figura 11. Dorsale chiusura incisionale. <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig12.jpg" /> Figura 12. Esempio cistometrica set-up. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/3981/3981fig13.jpg" /> Figura 13. Cistometria Rappresentante analisi.

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E., Soler, R., Fullhase, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+urodynamic+investigation.">Rodent models for urodynamic investigation.</a> Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).</li><li>Soler, R., Fullhase, C., Santos, C., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+bladder+dysfunction+in+a+rat+model+of+dopaminergic+brain+lesion.">Development of bladder dysfunction in a rat model of dopaminergic brain lesion.</a> Neurourol Urodyn. 30, 188-193 (2011).</li><li>Streng, T., Santti, R., Andersson, K. E., Talo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+rhabdosphincter+in+female+rat+voiding.">The role of the rhabdosphincter in female rat voiding.</a> BJU Int. 94, 138-142 (2004).</li><li>Malmgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystometrical+evaluation+of+bladder+instability+in+rats+with+infravesical+outflow+obstruction.">Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction.</a> J. Urol. 137, 1291-1294 (1987).</li><li>Smith, P. P., Kuchel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+uroflow+cystometry+in+the+urethane-anesthetized+mouse.">Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse.</a> Neurourol. Urodyn. 29, 1344-1349 (2010).</li><li>Cannon, T. W., Damaser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anesthesia+on+cystometry+and+leak+point+pressure+of+the+female+rat.">Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat.</a> Life Sci. 69, 1193-1202 (2001).</li><li>Smith, P. P., Hurtado, E., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystometric+methods+in+female+rats.">Comparison of cystometric methods in female rats.</a> Neurourol. Urodyn. 27, 324-329 (2008).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Valutazioni cistometrici di configurazioni biomateriale dopo l&#39;impianto e ampliamento vescicale in modelli animali di piccole dimensioni rappresenta un passo importante di convalida per identificare ottime caratteristiche strutturali e meccaniche di disegni a matrice per l&#39;uso in situazioni cliniche. In questo studio, si descrivono i metodi chirurgici per l&#39;esecuzione di ampliamento vescicale in topi e ratti, nonché le tecniche per determinare le proprietà cistometrici urodinamici di organi ingegnerizzati per le valutazioni funzionali. Abbiamo utilizzato queste tecniche in diversi esperimenti che coinvolgono entrambi i topi e ratti, con ogni esperimento composto da 30 + roditori senza problemi significativi. Il nostro laboratorio di ricerca è un conglomerato eterogeneo di scienziati di base e medici chirurghi, chirurghi e con almeno 5-6 anni di formazione post-laurea chirurgica eseguita gli aspetti procedurali di questi esperimenti. Indipendentemente dal tipo di biomateriale utilizzato, la maggiore difference tra aumentando la vescica nel ratto rispetto topi è la dimensione della vescica. A causa delle dimensioni più piccole della vescica, la dissezione e incorporazione del biomateriale è tecnicamente più difficile nel topo. Per facilitare la visualizzazione, un microscopio chirurgico può essere utilizzato. Poiché la dimensione della vescica nel ratto è più grande, è più suscettibile di situazioni in cui più di una procedura deve essere eseguita sulla vescica (aumento esempio e posizionamento del catetere cistostomia). Inoltre, il protocollo descritto sopra impiego di PE-50 tubo per il ratto 13, tuttavia, cateteri dimensioni ancora più grandi, fino a PE-100 sono stati utilizzati, in particolare per studi a lungo termine 14. Nei topi, un calibro inferiore come PE-10 tubo può essere utilizzata 15,16, ma va tenuto presente che i tubi flessibili minore, più non possono trasmettere variazioni di pressione al trasduttore precisione. Inoltre, il metodo alternativo di fissaggio del catetere sul dorso (passo 8 * sopra) è fatto in micausa delle loro dimensioni corpo più piccolo e l&#39;ago punta smussata e il tappo IV ce sono troppo ingombranti. Lo svantaggio di questo è la necessità di anestesia per estrarre l&#39;estremità del catetere nella tasca sottocutanea prima cistometria. Studi hanno dimostrato che nei primi giorni primi (0-4 giorni) dopo il posizionamento dei cateteri, cistometria rivelato pressioni elevate e iperattività della vescica con volumi bassi svuotamento. Questi risultati sembravano stabilizzarsi intorno al sesto settimo giorno 14,17 e, pertanto, è probabilmente il momento ideale per la valutazione cistometrica. Tuttavia, la maggior parte delle segnalazioni in letteratura cistometria eseguire entro i primi 3 giorni di cateterizzazione 18, e questo rappresenta per l&#39;ampiezza dei suddetti parametri in funzione del tempo. Lasciando il catetere sovrapubico per una durata superiore a 3 giorni porta con sé patologie come il rischio di pietre, dislocazione, infezioni, ematuria e l&#39;occlusione del catetere di detriti. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; velocità di infusione differenti durante cistometria sono stati descritti da 1-3mL/hr per topi 15,16 e 13,19,20 10-11mL/hr per i ratti. Velocità di infusione soprafisiologiche può causare pressioni falsamente elevati 14. Usiamo una velocità di infusione 12,5 pL / min (0,75 mL / h) per topi e 100 pl / min (6 mL / h) per ratti nella nostra configurazione, ma tassi inferiori possono anche essere utilizzati. La temperatura della soluzione salina fisiologica dovrebbe essere almeno temperatura ambiente, sebbene calda (37 °) salina è più ottimale per evitare iperattività vescicale provocato con instillando soluzione fredda. In cistometria sveglio, è fondamentale per consentire la stabilizzazione del pattern come annullando l&#39;animale è regolato alla gabbia, che nella nostra esperienza richiede un periodo di circa 10-20 minuti. A seguito di questa, i cicli della minzione regolari possono essere registrate per 45-120 minuti oa cicli minimi di svuotamento 3-4. L&#39;animale deve osservare in tempo reale poiché l&#39;animale è liberamente moving e complicazioni come torsioni o attorcigliamento del catetere può alterare l&#39;analisi cistometrica. La limitazione del rumore ambientale durante cistometria si vuole diminuire il movimento degli animali e artefatti successive. Cistometria Inconscio non ha i problemi che ne conseguono come cistometria sveglio, ma anestetici multipli hanno dimostrato di inibire le contrazioni della vescica spontanee. Questa inibizione corrisponde direttamente alla durata prevista di azione dei farmaci anestetici, cioè quando a remissione dei sintomi anestetici, contrazioni spontanee riprendere il 14. Inoltre, le pressioni misurate quando la vescica traboccato, erano statisticamente maggiore nei ratti anestetizzati, sia vivo e post-mortem, indicando un effetto sulle proprietà di conformità passivi della parete della vescica. Questo effetto si vede con 21 pentobarbital, ketamina, e cloralosio IM / IP, oltre a alotano per via inalatoria e intratecale nesacaine 14. Uno studio più ampio di vari anestetici confermam questo risultato con soppressione del riflesso della minzione per anestesiologia sia inalatoria (isoflurano e metossiflurano) e barbiturici (pentobarbital e thiobutabarbital) sotto i livelli di anestesia moderati 17. Questo effetto è stato osservato anche con livelli di luce o sedativi di anestesia con farmaci come il fentanil, droperidolo e ketamina-diazepam, e come nello studio precedente, come l&#39;effetto dell&#39;anestesia calmata, così ha fatto l&#39;inibizione 17. Per questa procedura, uretano iniezioni intraperitoneali può essere utilizzato poiché è stato dimostrato che la minzione riflesso viene mantenuto consentendo anche l&#39;anestesia adeguata 17,22. Inoltre, nessun effetto è stato osservato rispetto alla pressione minzione 23. Posizionamento del catetere sovrapubica per cistometria è descritto qui, poiché il cateterismo intrauretrale ha dimostrato di avere maggiori curve di pressione della vescica e le portate più basse in linea con ostruzione relativa uscita della vescica 24.Inoltre, il cateterismo intrauretrale è possibile solo in animali anestetizzati, e anche allora, il cateterismo può essere difficile, specialmente nei roditori maschi e sui topi. In conclusione, la scelta del modello da utilizzare per il riempimento della vescica e / o analisi cistometrica dipende dagli obiettivi dello studio specifico. Dal punto di vista tecnico il modello di ratto contiene chiaramente il vantaggio per i motivi di cui sopra. Tuttavia, il modello di topo può essere utilizzato in studi che valutano i ruoli di specifici geni codificati prodotti finali nelle malattie delle vie urinarie, a causa della loro suscettibilità per la manipolazione genetica. Questo non è generalmente possibile nel ratto. Cistometria Awake più accurato imita il normale stato fisiologico in cui questi animali subiscono i loro cicli della minzione, e così, è suscettibile di fornire una determinazione più affidabile fisiologica della funzione vescicale. Inoltre, le variabili di confondimento effetti diretti di unanesthetics sulla funzione della vescica è evitata.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiali: </td><td> Descrizione / Utilizzo: </td></tr><tr><td> Forbici da barba </td><td> Preparazione di ratto / topo per la chirurgia </td></tr><tr><td> Drappi sterili, Betadine, 70% etanolo, garza sterile </td><td> Preparazione di sterile campo chirurgico </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Strumenti: </td></tr><tr><td> Lama da bisturi </td><td> Incisione della pelle </td></tr><tr><td> pinza con denti </td><td> Manipolazione della pelle </td></tr><tr><td> Pinza Belle </td><td> Atraumatica (senza denti), senza scanalature o con sottili scanalature per manipolare </td></tr><tr><td> Ago piccolo driver </td><td> Tessuto dissezione </td></tr><tr><td> Metzenbaum forbici </td><td> Bldder incisione </td></tr><tr><td> Tenotomia forbici </td><td> Per suture retrazione e di sviluppare sottocutanea tunnel (catetere cistostomia) </td></tr><tr><td> Piccole pinze curve </td><td> Tunnel sottocutaneo (catetere cistostomia) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Suture: </td></tr><tr><td> 6-0 suture in polipropilene </td><td> Vescica suture e sutura pursestring </td></tr><tr><td> 7-0 poliglattina sutura </td><td> Anastomosi del ponteggio alla vescica </td></tr><tr><td> Poliglattina filo di sutura 4-0 </td><td> Chiusura del muscolo / pelle </td></tr><tr><td> 3-0 o 4-0 sutura Silk </td><td> Punta del catetere Protezione per la pelle </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Aghi e siringhe: </td></tr><tr><td> 18 gauge </td><td> Forando la vescica per catetere cistostomia </td></tr><tr><td> 25 e 30 Gauge aghi </td><td> Vescica Test per perdite </td></tr><tr><td> 1 mL salina fsiringa illed </td><td></td></tr><tr><td> 22 punta dell&#39;ago Gauge smussata </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Cistostomia catetere: </td></tr><tr><td> PE-50 tubi </td><td></td></tr><tr><td> Accendino </td><td> Svasatura tubi PE-50 </td></tr><tr><td> Piccolo morsetto curvo </td><td> Sviluppare tunnel sottocutaneo </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Cistometria: </td></tr><tr><td> MLT844 ADInstruments acquisizione dati e software LabChart </td><td> Pressione di acquisizione dati </td></tr><tr><td> Harvard 22 pompa a siringa (Harvard Apparatus, Holliston, MA) </td><td> Pompa da infusione Fluid </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Anestetici (cistometria Inconscio): </td></tr><tr><td> Iosoflurane </td><td> Induzione / mantenimento dell&#39;anestesia generale </td></tr><tr><td> Uretano </td><td> Unconconscious cistometria </td></tr><tr><td> Bupivicaine o equivalente </td><td> Anestesia locale </td></tr><tr><td> Meloxicam </td><td> Analgesia post-operatoria </td></tr><tr><td> Buprenorfina </td><td> Analgesia post-operatoria </td></tr></tbody></table>

evaluation of biomaterials for bladder augmentation using cystometric analyses in various rodent models

La funzione renale e la continenza delle urine dipende in modo cruciale il corretto funzionamento della vescica urinaria, che memorizza le urine a bassa pressione e la espelle con un proprio orchestrato contrazione. Un certo numero di anomalie urologiche congenite ed acquisite incluse le valvole uretrali posteriori, iperplasia prostatica benigna e della vescica neurogena secondaria a spina bifida / lesioni del midollo spinale può causare nel rimodellamento del tessuto patologico che porta al rispetto compromessa e ridotta capacità 1. Ostruzione anatomica o funzionale delle vie urinarie è frequentemente associata a queste condizioni, e può portare a incontinenza urinaria e danni renali dallo stoccaggio aumentata e le pressioni di svuotamento 2. Impianto chirurgico di segmenti gastrointestinali per espandere la capacità degli organi e ridurre la pressione intravescicale rappresenta la principale opzione di trattamento chirurgico per questi disturbi, quando il trattamento medico fallisce 3. Tuttavia, questo approccio è ostacolareed dalla limitazione di tessuto dei donatori disponibili, ed è associata a complicanze significative, comprese infezioni croniche delle vie urinarie, perturbazione metabolica, formazione di calcoli delle vie urinarie, e malignità secondaria 4,5. La ricerca attuale nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti della vescica è fortemente incentrato sull&#39;identificazione di configurazioni biomateriale in grado di supportare la rigenerazione dei tessuti presso le sedi dei difetti. Convenzionale 3-D scaffold derivati ​​da polimeri naturali e sintetiche come piccolo submucosa intestinale e poli-acido glicolico hanno mostrato un certo successo a breve termine per sostenere la rigenerazione muscolare uroteliale e liscio, oltre a facilitare aumentata capacità di stoccaggio di organi sia in modelli animali e nella clinica 6,7. Tuttavia, le carenze di integrità impalcatura meccanica e biocompatibilità spesso sfociano in fibrosi deleterio 8, contrattura innesto 9, e calcificazione 10, aumentando così il rischio di fallimento dell&#39;impianto e hanno bisogno di for procedure chirurgiche secondarie. Inoltre, il ripristino delle caratteristiche di svuotamento che utilizzano normali standard di costrutti biomateriale per cistoplastica aumento deve ancora essere raggiunto, e quindi ricerca e sviluppo di nuove matrici in grado di assumersi questo ruolo è necessario. Al fine di sviluppare con successo e valutare biomateriali ottimali per l&#39;ampliamento vescicale ricerca clinica, l&#39;efficacia deve essere eseguita prima in modelli animali standardizzati dettagliati metodiche chirurgiche e valutazioni risultato funzionale. Abbiamo precedentemente riportato l&#39;uso di un modello di aumento della vescica in topi per determinare il potenziale di seta fibroina basati su impalcature per mediare la rigenerazione dei tessuti e la minzione caratteristiche funzionali. 11,12 cistometrici analisi di questo modello hanno dimostrato che le variazioni nelle proprietà implantari strutturali e meccaniche possono influenzare le caratteristiche risultanti urodinamici delle vesciche di ingegneria tessutale 11,12. Correlazione positivazioni tra il grado di matrice mediata rigenerazione dei tessuti determinato istologicamente e compliance funzionale e capacità valutata cistometria sono state dimostrate in questo modello 11,12. Questi risultati suggeriscono quindi che le valutazioni funzionali di configurazioni biomateriale in sistemi di potenziamento della vescica roditori può essere un formato utile per la valutazione delle proprietà delle impalcature e stabilire la fattibilità in vivo prima di studi sugli animali di grandi dimensioni e distribuzione clinica. In questo studio, presenteremo varie fasi chirurgiche di aumento della vescica nei topi e nei ratti utilizzando impalcature di seta e dimostrare le tecniche per cistometria sveglio e anestetizzato.

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Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Fasi chirurgiche di aumento della vescica vengono descritte utilizzando 3-D scaffold in modelli murini e di ratto. Per verificare l&#39;efficacia di configurazioni biomateriale per uso in aumento vescica, tecniche per cistometria sia sveglio e anestetizzati sono presentati.

Valutazione di Biomateriali per l&#39;ampliamento vescicale con analisi cistometrici in modelli di roditori vari

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.1K Views.  Harvard Medical School. Fasi chirurgiche di aumento della vescica vengono descritte utilizzando 3-D scaffold in modelli murini e di ratto. Per verificare l'efficacia di configurazioni biomateriale per uso in aumento vescica, tecniche per cistometria sia sveglio e anestetizzati sono presentati.

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Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Ricerca

Bioingegneria

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polimerici per Discovery High Throughput di Biomateriali

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Valutazione dei comportamenti fotosintetici mediante misurazioni simultanee della riflettanza delle foglie e delle analisi della fluorescenza della clorofilla

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows assessment of bone substitution materials for oral and craniofacial bone regeneration in terms of bone growth and neovascularization support. Once animals are anesthetized and ventilated (endotracheal intubation), four cylinders made of polyether ether ketone (PEEK) are screwed onto the skull, on both sides of the median and coronal sutures. Five intramedullary holes are drilled within the bone area delimited by each cylinder, allowing influx of bone marrow cells. The material samples are placed into the cylinders which are then closed. Finally, the surgical site is sutured, and animals are awaken. Bone growth may be assessed on live animals by using microtomography. Once animals are euthanized, bone growth and neovascularization may be evaluated by using microtomography, immune-histology and immunofluorescence. As the evaluation of a material requires maximum standardization and calibration, the calvarial model appears ideal. Access is very easy, calibration and standardization are facilitated by the use of defined cylinders and four samples may be assessed simultaneously. Furthermore, live tomography may be used and ultimately a large decrease in animals to be euthanized may be anticipated.

Here we present a surgical protocol in rabbits with the aim to assess bone substitution materials in terms of bone regeneration capacities. By using PEEK cylinders fixed onto rabbit skulls, osteoconduction, osteoinduction, osteogenesis and vasculogenesis induced by the materials may be evaluated either on live or euthanized animals.

Modello calvariale di aumento osseo nel coniglio per la valutazione della crescita ossea e della neovascolarizzazione nei materiali di sostituzione ossea

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Chiarificazione primaria del fluido di coltura cellulare raccolto da CHO utilizzando un separatore acustico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...