Gli autori ringraziano J. Priscu, A. Chiuchiolo e il team di McMurdo LTER limnologia per l&#39;assistenza nella raccolta e conservazione dei campioni in Antartide. Ringraziamo Ratheon Servizi polari PHI ed elicotteri per il supporto logistico. Micrografie luce sono stati generati nel Centro di Miami per la microscopia avanzata e Centro Imaging. Questo lavoro è stato supportato dall&#39;Ufficio NSF di Polar Grants Programmi 0631659 e 1056396.

1. Esempio di acquisizione <ol><li> Scegli e prepara il sito di campionamento un giorno prima campionamento della colonna d&#39;acqua. Ciò consentirà alle stratificazioni della colonna d&#39;acqua di riformare dopo disturbo a causa di perforazione e ghiaccio foro di fusione. Identificare la posizione del sito di perforazione attraverso GPS. </li><li> Per accedere alla colonna d&#39;acqua, iniziare praticando un foro attraverso il ghiaccio con una coclea ghiaccio Jiffy attaccato ad una da 4 pollici di estensione Jiffy po &#39;di volo e di taglio. Per evitare il congelamento del trapano nel foro, cercare di evitare di perforazione in acqua liquida interrompendo perforazione di circa 4-6 cm sopra la parte superiore della colonna d&#39;acqua. </li><li> Il foro dovrà essere allargato da un diametro di 15 a 60 cm prima del prelievo. Ciò si ottiene mediante l&#39;uso di un fusore foro (Modello Hotsy) che circola polietilene glicole riscaldata attraverso un tubo di rame. Hole di fusione richiede in genere fino a 18 ore. </li><li> Prima di campionamento della colonna d&#39;acqua, in modo che tutte le attrezzature necessarie e st campioneorage vasi sono assemblati presso il sito di campionamento. Materiali di campionamento sono: bottiglia Niskin (capacità L 5-10), Winch con profondità calibrata cavo, Messenger, bottiglie di un campione sufficiente per ogni profondità di campionamento e scambiatori di calore per il trasporto del campione. </li><li> Inizia campionamento nelle prime ore del giorno (~ 5 del mattino), il filtraggio delle acque del lago dovrebbe essere completata il giorno del prelievo. Raccogliere campioni di acqua (1-5 L) dalla profondità desiderata (per questo studio: 6-m, 15 me 18 m profondità di campionamento, misurata dal livello dell&#39;acqua piezometrico nel buco del ghiaccio) utilizzando un campionatore Niskin collegata a un calibrato argano a mano. Per evitare disturbi della colonna d&#39;acqua raccolgono basse profondità prima di quelli più profondi. </li><li> Conservare i campioni di lago in dispositivi di raffreddamento e dei trasporti dal sito del campione al laboratorio campo utilizzando una slitta attaccato ad un ATV (All Terrain Vehicle). I campioni devono essere trattati o stabilizzati (ad es: freeze flash in azoto liquido) presso il laboratorio di campionamento campo immediatamente successivo. </li></ol> 2. SVILUPPOnt di colture di arricchimento <ol><li> Per la coltivazione di colture di arricchimento, concentrato 0,5-1 litri di acqua del lago sul 47 mm a 0,45 micron filtri dalle dimensioni dei pori polietersolfone con filtrazione leggera (&lt;0,3 atm). Se la diversità della comunità naturale si desidera, filtrare un secondo campione su 47 mm 0,45 filtri dimensioni dei pori um polietersolfone e seguire protocolli secondo Bielewicz et al. 4 per diversità filogenetica eucariote. </li><li> Trasferire filtro 50 provetta sterile falcon mL contenente ~ 20 mL di acqua filtrata lago raccolti dalla profondità di campionamento stesso filtro. Lavare delicatamente le cellule dal filtro con una pipetta sterile. </li><li> Trasferire sospensione cellulare in un centimetro 25 2 beuta sterile coltura cellulare. Aggiungere l&#39;acqua filtrata lago raccolto da ciascun campione profondità per aumentare il volume di cultura a 45 mL. Impostare replica multipli per ogni profondità di campionamento se arricchimenti su diversi terreni di coltura si desiderano. </li><li> Supplemento palloni di coltura con 50X sterile soluzioni ad una concentrazione finale di 1X dei seguenti terreni di coltura: Medio Bold Basal, il BG11 e F / 2. Se la coltura di organismi mixotrophic è richiesto, set-up due navi F/2-supplemented e aggiungere 2-3 grani di riso sterile a uno dei fiaschi. </li><li> Incubare fiasche di coltura a bassa temperatura (4 ° C) e basso irraggiamento (20 fotoni micromoli m -2 s -1) a temperatura controllata crescita incubatore per almeno 4 settimane in Antartide prima della spedizione al laboratorio degli Stati Uniti. Se si desiderano isolati, piatto 250 microlitri della coltura di arricchimento su piastre di agar contenenti terreni di coltura appropriati dopo 2 settimane di incubazione. </li><li> Per la spedizione verso gli Stati Uniti, colture di arricchimento di trasferimento a sterili da 50 mL tubi falcon. Richiesta di spedizione requisito &quot;non congelare&quot; e &quot;mantenere la calma&quot; su spedizione richiesta. Mentre il processo di spedizione dall&#39;Antartide è relativamente veloce (2 settimane aereo commerciale) e altamente affidabile, vi è la possibilità di perdita di dell&#39;organo fastidiosoismi durante il processo di trasporto. Così, gli investigatori potrebbero voler mantenere un sottocampione prima della spedizione in modo che la perdita di alcune specie durante il processo di spedizione può essere valutata. </li><li> Al suo arrivo negli Stati Uniti, il trasferimento 5 ml di coltura di arricchimento in 45 ml di terreni di crescita appropriati in un 125 mL beuta sterile ricoperto con una spugna sterile. Colture di arricchimento devono essere mantenute in piedi le culture in una camera di crescita a temperatura controllata ambientale (camera di crescita Diurno, VWR) a 4 ° C/20 fotoni micromoli m -2 s -1. Le colture dovrebbero essere trasferiti in mezzi freschi ogni 30 giorni. </li></ol> 3. Cella Estrazione del lisato da arricchimenti filtrati <ol><li> Filter 5 ml di coltura di arricchimento su un 25 mm Whatman GF / F filtro utilizzando vuoto dolce (&lt;10 psi). Il filtro può essere conservato per diverse settimane a -80 ° C prima di essere analizzati attività RuBisCo. </li><li> Tagliare il filtro in sezioni 4-5 con le forbici in acciaio sterili etrasferire i pezzi con pinza sterile ad un tubo 2 tappo a vite mL riempito un quinto del modo pieno, con 0,1 mm di diametro in ossido di zirconio / silice perline. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di tampone di estrazione filtro (50 bicina mM, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, e 0,1% Triton X-100; aggiungere fresco: 10 mM NaHCO 3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocaproico acido, 0,7 benzammidina mM, pH 7.8) 13 e distruggere le cellule utilizzando un battitore Minibead tre volte per 30 secondi su regolazione della velocità 48. Per evitare il riscaldamento del campione, beadbeating alternano con 1 min di incubazione su ghiaccio. </li><li> Centrifugare slurry filtro per 2 min a 3000 xga 4 ° C per formare un pellet sciolto di GF / F fibre del filtro e della parete detriti cellulari. </li><li> Rimuovere a 200 microlitri un&#39;aliquota e immergerli in 800 microlitri di ghiacciata acetone 90%. Misurare clorofilla estraibile (CHL) in uno spettrofotometro a valori di lunghezza d&#39;onda di 664 nm e 647 nm 14. Trasferire il supernatante in una provetta 1,5 ml. </li><li> Centrifugare remaining surnatante a 4 ° C per 2 min a 15.000 xg e trasferire il supernatante (evitare il pellet insolubili di membrane cellulari e rimanenti GF / F fibre del filtro) ad una provetta pulita 1,5 mL microcentrifuga. Questo lisato cellulare solubile può ora essere usato nel saggio di attività carbossilasi Rubisco. </li><li> Lisato può essere conservato a -80 ° C dopo l&#39;aggiunta di 12,5% glicerolo e congelamento flash in azoto liquido. Una perdita di attività può verificarsi dopo diversi cicli gelo / disgelo a seconda della sensibilità degli enzimi del lisato. Pertanto, l&#39;attività di lisato fresco rispetto congelato dovrebbe essere testato prima su larga scala delle cellule estrazioni lisato. </li></ol> 4. RuBisCo carbossilasi Activity Assay Filter <ol><li> Trasferire 125 pl di lisato solubile in una provetta da microcentrifuga tappo a vite 15 mL (tappo non necessario) che è stata raffreddata su ghiaccio. Per i campioni di controllo negativi, aggiungere 125 microlitri lisato solubile a 15 provetta da microcentrifuga tappo a vite mL, ma non aggiungere substrato (nel passo 4.7). Correreduplicato reazioni per tutti i campioni ei controlli negativi. </li><li> Preparare 10 mL di tampone fresco (50 mM bicina-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO 3, 25 mM MgCl 2) e congelati su ghiaccio. Aliquotare abbastanza del tampone di saggio per tutti i campioni e dei controlli negativi (100 pl per campione / controllo supplementare più 100 mL) a un tubo 5 ml. Eseguire tutti i passaggi successivi sotto una cappa aspirante. </li><li> Aggiungere 40 microlitri NaH 14 CO 3 (500 uCi / mL) per mL di tampone al buffer aliquotate e mantenere il buffer su ghiaccio. </li><li> Rimuovere 10 L del tampone di saggio contenente 14 C e diluirlo in 1 ml di tampone. Dopo l&#39;inversione di mescolare, aggiungere 100 microlitri della miscela diluita 1:100 a 3 ml di Bio-Safe scintillazione II conteggio cocktail in una fiala di scintillazione. Capovolgere. Conta scintillazione (Beckman LS6500) dovrebbero essere oltre 18.000 cpm prima di continuare con il dosaggio. </li><li> Quando abbastanza NaH 14 CO 3 è stato aggiunto al tampone di saggio,spostare le provette di reazione ad un bagno di preset secco a 25 ° C e incubare per 3-5 minuti. </li><li> Aggiungere 100 pl tampone di saggio per i lisati e incubare per 5 minuti a 25 ° C. </li><li> Aggiungere 20 pl di 15 mM ribulosio difosfato, per campioni e permettere la reazione per 5-10 minuti a 25 ° C. </li><li> Aggiungere 100 pl di acido propionico (100%) (Fisher) per arrestare la reazione. Centrifugare per 1 ora a 2000 xg per esaurire unincorporated 14 C. </li><li> Trasferire il volume totale dei campioni di flaconi di scintillazione contenente 3 ml Bio-sicura di cocktail di scintillazione II conteggio. Determinare il cpm di prodotti finali acidi stabili mediante conteggio a scintillazione (B. Witte, R. Tabita comunicazione personale). </li><li> Calcolare i tassi di attività RuBisCo su Chl a base 14. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Abbiamo utilizzato coltura di arricchimento per isolare fototrofi freddo adattato e protisti mixotrophic residenti nella L AntartideAke Bonney. Per acquisire una maggiore diversità di organismi, abbiamo provato tre tipi di terreni di coltura: Medio basale Bold (BBM) 15, F/2-Si Marine Media 16, 17 e BG11 Media 18. L&#39;ispezione visiva delle colture di arricchimento al microscopio ottico ha rivelato che le colture sono state dominate dal protisti fototrofi (indicata dalla presenza del pigmento clorofilla nella maggior parte delle cellule) e alloggiata una varietà di morfologie cellule a seconda della profondità di campionamento dal quale è stata presa l&#39;inoculo e la tipo di supporto utilizzato nella coltura (Fig. 1). Abbiamo misurato i tassi massimi di attività carbossilasi catalizzate dalla RuBisCo enzima come proxy per il potenziale fissazione del carbonio. Chl a abbondanza è stato anche monitorato come una stima della biomassa fototrofi protista (Fig. 2). Nonostante la coltivazione di tutte le culture sotto la stessa temperatura / luce regime (es. 4 ° C/20 mmol m -2 s -1), fissazione del carbonio potenzialee biomasse fototrofi varia drasticamente tra le culture di arricchimento. Massima attività Rubisco è stata osservata in colture di arricchimento in crescita o BBM (arricchimenti 4 e 6) o BG11 (arricchimenti 13 e 14) mezzi di crescita, mentre le colture arricchito in F / 2 mezzo di crescita (arricchimenti 19, 21, 23) esposto a 4 - alle attività minori di 34 volte carbossilasi massimi. Queste differenze non erano dovuti a bassi livelli di biomassa nelle F / 2 culture, come l&#39;attività carbossilasi è stata espressa su una base Chl. Inoltre, l&#39;attività RuBisCo non correlavano con CHL una concentrazione (r = -0,023, p&gt; 0.1;. Fig. 2, inserto). Le culture BBM inoculate con l&#39;acqua del lago da 6 e 15 m (arricchimenti 4 e 5) aveva la più alta Chl a livelli, mentre tutte le altre culture esposti CHL relativamente bassa a, indipendentemente dall&#39;attività enzimatica RuBisCo (Fig. 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> Figura 1.Rappresentativi microbiche eucarioti colture di arricchimento che sono selezionati per la crescita di organismi diversi. Identità della cultura è data in basso a sinistra dei pannelli. Tutte le immagini rappresentano micrografie luminosi generati utilizzando olio da immersione ingrandimento 1000X. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> Figura 2. Potenziale capacità di fissazione del carbonio e la clorofilla estraibile alcuni livelli in colture microbiche eucarioti arricchimento antartici isolati dal lago di Bonney e coltivati ​​in vari terreni di coltura. Vedi Tabella 1 per i dettagli cultura Inset:. Correlazione di Pearson tra clorofilla un potenziale di fissazione di carbonio in abbondanza e colture microbiche eucarioti arricchimento antartiche.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Recenti studi molecolari hanno riportato alta diversità di eucarioti unicellulari in una serie di ambienti 3, 19, 20, tuttavia, a causa della mancanza di isolati tutta la gamma di habitat protisti i ruoli funzionali di queste singole specie in reti alimentari sono largamente sconosciuto. In questo studio, abbiamo descritto le metodologie di arricchire di specie microbiche eucarioti espositrici versatilità metabolica da un ambiente relativamente sottocampionato, uno permanentemente coperta di ghiaccio antart...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> BBM </td><td> Sigma </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> Sigma </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> Sigma </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtro, 25 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtro, 47 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polietersulfone filtro, pori 0,45 micron, 47 mm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile coltura cellulare pallone, 25 cm 2 </td><td> Corning </td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurnal camera di crescita </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> Zirconia / sfere di silice, 0,1 millimetri diametro non </td><td> Biospec Prodotti </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Bead beater </td><td> Biospec Prodotti </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> Con tappo a vite provetta (1,5 pl) </td><td> USA Scientific </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 14 CO 3 </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> Conservare in aliquote di 400 microlitri a -20 ° C </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> Sigma </td><td> R0878-100mg </td><td> Sciogliere in 10 mM Tris-propionico (pH 6,5) </td></tr></tbody></table>

establishment of microbial eukaryotic enrichment cultures from a chemically stratified antarctic lake and assessment of carbon fixation potential

Bonney Lake è uno dei numerosi permanente coperti di ghiaccio laghi situati nelle McMurdo Dry Valleys, Antartide. La copertura di ghiaccio perenne mantiene una colonna d&#39;acqua stratificata chimicamente e, a differenza di altri organi interni d&#39;acqua, impedisce in gran parte input esterno di carbonio e sostanze nutritive dai flussi. Biota sono esposti a numerosi stress ambientali, tra cui tutto l&#39;anno grave carenza di nutrienti, basse temperature, ombra estrema, hypersalinity, e 24 ore buio durante l&#39;inverno 1. Queste condizioni ambientali estreme limitare il biota in Bonney Lake quasi esclusivamente ai microrganismi 2. Unicellulari eucarioti microbica (chiamati &quot;protisti&quot;) sono attori importanti cicli biogeochimici globali 3 e svolgono importanti ruoli ecologici del ciclo del carbonio nei laghi asciutti valle, occupando entrambi i ruoli primari e terziario nella catena alimentare acquatica. Nelle secche alimentari valle acquatici web, protisti, che fissano inorganic carbonio (autotrophy) sono i maggiori produttori di carbonio organico per gli organismi organotrophic 4, 2. Phagotrophic o protisti eterotrofi capaci di ingerire batteri e piccoli protisti agire come i predatori al vertice della rete alimentare 5. Infine, una percentuale sconosciuta della popolazione protista è in grado di combinata metabolismo mixotrophic 6, 7. Mixotrophy in protisti implica la capacità di combinare la capacità fotosintetica con l&#39;ingestione di microrganismi phagotrophic preda. Questa forma di mixotrophy differisce dal metabolismo mixotrophic in specie batteriche, che in genere comporta l&#39;assorbimento di molecole di carbonio disciolto. Ci sono attualmente isolati protisti poche in posti di ghiaccio-capped laghi polari, e gli studi della diversità protista ed ecologia in questo ambiente estremo sono stati limitati 8, 4, 9, 10, 5. Una migliore comprensione di protista versatilità metabolica nel semplice cibo secco web Valle del Lago sarà di aiuto nello sviluppo di modelli per la role di protisti nel ciclo globale del carbonio. Abbiamo utilizzato un approccio coltura di arricchimento per isolare protisti potenzialmente fototrofi mixotrophic e dal Lago di Bonney. Profondità di campionamento nella colonna d&#39;acqua sono stati scelti in base alla localizzazione della produzione primaria e massimi protista diversità filogenetica 4, 11, nonché alla variabilità nelle principali fattori abiotici che influenzano le modalità trofiche protisti: profondità di campionamento basse sono limitati per i nutrienti più importanti, mentre più profonde profondità di campionamento sono limitati dalla disponibilità luce. Inoltre, campioni di acqua lago sono stati integrati con diversi tipi di supporto di crescita per promuovere la crescita di una varietà di organismi fototrofi. RuBisCo catalizza il fattore limitante nella Benson Calvin Bassham (CBB) il ciclo, la via principale attraverso il quale gli organismi autotrofi fissare il carbonio inorganico in carbonio organico e di fornire per i livelli trofici superiori nelle reti trofiche acquatiche e terrestri 12. In questo studio, we applicato un saggio di radioisotopo modificato per campioni filtrati da 13 a monitorare massima attività carbossilasi come proxy per il potenziale fissazione del carbonio e la versatilità metabolica nelle colture di arricchimento Bonney Lake.

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Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Eucarioti microbiche sono sia una fonte di carbonio fotosinteticamente derivato e le prime specie di predatori in modo permanente coperti di ghiaccio dei laghi antartici. Questo rapporto descrive un approccio coltura di arricchimento per isolare metabolicamente eucarioti microbici versatili dal lago antartico, Bonney Lake, e valuta il potenziale fissazione del carbonio inorganico mediante un saggio di radioisotopi per la ribulosio-1 ,5-bisphophate carbossilasi ossigenasi (RuBisCo) attività.

Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  Miami University. Eucarioti microbiche sono sia una fonte di carbonio fotosinteticamente derivato e le prime specie di predatori in modo permanente coperti di ghiaccio dei laghi antartici. Questo rapporto descrive un approccio coltura di arricchimento per isolare metabolicamente eucarioti microbici versatili dal lago antartico, Bonney Lake, e valuta il potenziale fissazione del carbonio inorganico mediante un saggio di radioisotopi per la ribulosio-1 ,5-bisphophate carbossilasi ossigenasi ...

Video: Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep Technologies StemCell

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Ricerca

Biologia

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Un ibrido metodo di estrazione del DNA per la valutazione delle comunità batteriche qualitativa e quantitativa di pollame campioni di produzione

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Purificazione genoma a livello di extrachromosomal circolare DNA dalle cellule eucariotiche

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Istituzione e manutenzione di scarafaggi americani gnotobiotici (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di Colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Isolamento di microRNA da colture di ghiandole salivari Tick Ex Vivo e vescicole extracellulari

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.