Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Zachary Z. Brown e Jennifer Alleva per lo sviluppo iniziale di questa tecnica di sintesi in fase solida e Matthew Parker FL utili per le discussioni. Questo lavoro è supportato dalla Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) e Horst Witzel Fellowship Award supportato da Cephalon, Inc.

1. Setup <ol><li> La reazione set-up per la sintesi in fase solida è una cartuccia filtro di polipropilene o reattore di vetro che è collegato mediante un tubo di polipropilene ad un pallone chiuso filtrazione sotto vuoto, come mostrato nella Figura 1. La reazione può essere miscelato con un agitatore magnetico o da gorgogliare azoto attraverso il reattore. </li><li> Un collettore gas collegato ad una bombola Argon dotato di un tubo di essiccazione e di gorgogliamento olio è inoltre consigliabile in quanto permette il recipiente di reazione deve essere contenuta in atmosfera inerte e permette la rimozione di reagenti da contenitori sigillati. </li><li> Tutte le operazioni vengono eseguite in una cappa aspirante e proprio dispositivo di protezione individuale (occhiali, camice e guanti di nitrile) è obbligatorio. </li></ol> 2. Primo caricamento Bis-Peptide Onto Resina <ol><li> Pesare 114 mg di HMBA-AM Resina (0,88 mmol / g di carico, 100 mmol) in 8 ml di reazione recipiente e aggiungere barra magnetica di agitazione. Chiudere la parte superiore del secolorecipiente e con un setto di gomma e il tubo di spurgo con argon per almeno 5 minuti. </li><li> Nel frattempo, pesano 117,3 mg del composto 1 della figura 3 (586,63 g / mol, 2 eq) e 59,2 mg di 1 - (mesitilene-2-solfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazolo (MSNT, 296,0 g / mol, 2 eq) in una provetta da centrifuga 15 mL monouso e sciogliere in 2 mL di diclorometano anidro (DCM). Aggiungere 24 microlitri di 1-metilimidazolo (NMI, 80,81 mL / mol, 3eq) alla soluzione e mescolare fino a completo scioglimento. </li><li> Trasferire la soluzione attivata al recipiente di reazione attraverso una siringa e consentono di mescolare sotto argon notte (circa 10 ore). </li><li> Rimuovere il setto e drenare la miscela di reazione. Lavare la resina con DCM (5x) e dimetilformammide (DMF) (5x). Eseguire il &quot;test rosso metile&quot; descritto nel paragrafo 10.1 per valutare il grado di carico resina. Se la resina rimane rosso durante il test rosso metile passi poi 2.2 e 2.3 deve essere ripetuto. Un colore giallo, indicativo di un test negativo rosso di metile, è preferito;Tuttavia, poiché tutti i gruppi ossidrilici rimanenti saranno limitati nel passaggio successivo, un risultato leggermente positivo (colore luce resina arancione) può essere accettabile. </li></ol> 3. Deprotezione della prima resina Bis-peptide e simultanea Capping <ol><li> Aggiungere 1 mL di DCM al recipiente di reazione si aggiunge 1 ml di acido bromidrico 33% in acido acetico a gocce nell&#39;arco di 30 secondi (bolle verifica) e permettono a mescolare per 15 minuti. Scolare e lavare la resina con DCM (5x) e poi ripetere il procedimento una volta di più. </li><li> Lavare la resina con DCM (5x) quindi DMF (5x). Neutralizzare il resina mediante lavaggio due volte con un 5% v / v soluzione di N, N-diisopropiletilammina (DIPEA) in DMF, poi lavare con DCM (5x) e DMF (5x) nuovamente. Eseguire il &quot;test rosso metile&quot; e &quot;test cloranile&quot; discusso nella sezione 10.1 e 10.2. I risultati dovrebbero essere negativo per il rosso metile, test e positivo per il test cloranile. </li></ol> 4. Giunto Boc / tBu-Protetto funzionalizzato Bis-Amino Acid <ol><li> Reintrodurre un&#39;atmosfera inerte alla resina contenente recipiente di reazione mediante lavaggio tre volte con DCM anidro poi attaccare un setto e linea di argon. Spurgare e lavare il contenitore con l&#39;aggiunta di 1-2 mL di DCM anidro e lasciare che si agita per 30 secondi, quindi lo scarico della nave fino a quando la linea di argon gorgogliatore comincia a salire. Fate questo almeno una volta di più. </li><li> Preparare una soluzione di 0,15 M funzionalizzata bis-amminoacido (3eq) e 245 mg di 1-idrossi-7-azabenzotriazole (HOAT, 136,11 g / mol, 18eq) in 2 mL di 2:1 DCM: DMF in un test fiamma essiccata Tubo in atmosfera di argon. Aggiungere 47 microlitri di diisopropilcarbodiimmide (DIC, 156,6 mL / mol, 3eq) e mescolare per 90 minuti. </li><li> Aggiungere 35 microlitri DIPEA (174,19 ml / mol, 2 eq) in 666 pl DMF anidra di resina e consentire in agitazione per 5 minuti. </li><li> Trasferire la pre-attivato bis-ammino soluzione acida recipiente di reazione attraverso una siringa e consentono di agitazione per una notte. </li><li> Scolare la miscela di reazione e lavare due volte con DCM anidro mentre sotto<html> argon. </li><li> Per promuovere la chiusura del dichetopiperazina, aggiungere una soluzione 0,25 M di HOAT (136,11 g / mol, 10eq) e DIC (156,6 mL / mol, 10eq) in uno 4 mL di 1:1 DCM: DMF e permettono di mescolare sotto argon per 1 ora. </li><li> Rimuovere il setto e drenare la miscela di reazione. Lavare la resina con DCM (5x) e DMF (5x). Se lo si desidera, eseguire il &quot;test cloranile&quot; discusso nella sezione 10.2. </li></ol> 5. Deprotezione di Boc / tBu-Protetto funzionalizzato Bis-Amino Acid <ol><li> Aggiungere 2 mL di una soluzione di acido trifluororacetic 95:5 (TFA): triisopropilsilano (TIPS) al recipiente di reazione e permettono di mescolare per 1 ora. Scolare e lavare la resina per circa 30 secondi con DCM (5x) e poi ripetere il procedimento una volta di più. </li><li> Lavare la resina con DCM (5x) quindi DMF (5x). Neutralizzare il resina mediante lavaggio due volte con un 5% v / v soluzione di DIPEA in DMF, poi lavare DCM (5x) e DMF (5x) nuovamente. Se lo si desidera, eseguire il &quot;test cloranile&quot; discusso nella sezione 10.2. </li></ol>Le &quot;&gt; 6. Ripetere i punti 4 e 5 come desiderato per sintetizzare mirati bis-peptide. 7. Funzionalizzazione del Bis-Peptide End Prolidine <ol><li> La fine prolidine del crescente bis-peptide può essere acilati indipendentemente o insieme attraverso un dichetopiperazina. Inoltre, tale fine può essere omesso protetto, che sarà clivato quest&#39;ultimo, offrendo l&#39;amminoacido libero. Se lo si desidera, eseguire il &quot;test cloranile&quot; discusso nel paragrafo 10.2 per valutare l&#39;efficienza di accoppiamento. </li></ol> 8. La deprotezione del Fmoc e Acilazione della fine quaternario del Bis-Peptide <ol><li> Una soluzione 2 ml di 20% piperidina in DMF viene aggiunto e la reazione viene mescolata per 20 minuti. Scolare e lavare la resina con DMF (5x) e poi ripetere il procedimento una volta di più. </li><li> Lavare la resina con DCM (5x) quindi DMF (5x). </li><li> Preparare una soluzione 0,15 M di amminoacido (3eq) in 2 mL di N-metilpirrolidone (NMP) con 114 mg 2 - (7-aza-1H-benzotriazolo-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronio esafluorofosfato<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3eq) e 104,5 ul DIPEA (174,19 mL / mol, 6EQ) e mescolare bene. Aggiungere al recipiente di reazione e permettono di agitare per 6 ore. </li><li> Lavare la resina con DCM (5x) quindi DMF (5x). </li></ol> 9. Rimuovere il gruppo Boc dalla resina Bound Amino Acid e Cleave in resina <ol><li> Aggiungere 2 mL di TFA 1:1: soluzione DCM al recipiente di reazione e permettono di agitare per 30 minuti. Scolare e lavare la resina con DCM (5x) e poi ripetere il procedimento una volta di più. </li><li> Lavare e asciugare la resina per 30 secondi con DCM (5x) e poi DMF (5x). </li><li> Aggiungere 2 mL di una soluzione al 10% DIPEA in DMF anidra e permettono di mescolare 24-48 ore. </li><li> Raccogliere miscela di reazione in pre-pesato pallone a fondo tondo. Trasferire 30 pl di questa soluzione a 450 pl di THF in un flacone LC-MS per l&#39;analisi e presentare. Lavare la resina con ulteriori aliquote di DMF e raccogliere nel pallone a fondo tondo quindi rimuovere il solvente sotto vuoto. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Purificazione di Bis-Peptide <ol><li> Sciogliere grezzo bis-peptide in una quantità minima di dimetilsolfossido (100-250 mL) e trasferimento nell&#39;inserto flaconcino HPLC. Inserire luogo in autocampionatore di semi-prepitive sistema HPLC (Hewlett Packard serie 1100) equipaggiato con un Prep XTerra MS C18 5 um 7.8x150 colonna mm e 100 pl ciclo di iniezione. </li><li> Eseguire più di 50 iniezioni ul del campione utilizzando un programma di pendenza 5-95% acetonitrile in acqua con 0,1% di acido formico in 30 minuti durante il monitoraggio a 274 nm. Raccogliere il picco prodotto in pre-pesato monouso provetta da centrifuga e congelare a secco utilizzando una liofilizzatore. Attenzione deve essere assunto con la prima esecuzione, come un leggero cambiamento nel tempo di ritenzione di picco rispetto al LCMS analitici si osserva tipicamente. </li></ol> 11. Metodi di valutazione <ol><li> METILE ROSSO TEST 7: Rimuovere ~ 1 mg di resina a secco tramite pipetta monouso e lavare in 4 mL recipiente di reazione. Aggiungere una soluzione di 20 mg rosso di metile, 50 microlitri N, N&#39;-diisopropilcarbodiimmide (DIC), 5 mg e 4-dimetilamminopiridina (DMAP) in 500 pl DCM anidro e permettono a mescolare per 5-10 min. Scolare e lavare resina con DCM fino a quando il filtrato diventa incolore. L&#39;indicazione è positiva le gocce di resina restanti arancione o rosso. </li><li> Cloranile TEST 12: Transfer ~ 1 mg di resina a secco in una piccola fiala tramite pipetta monouso. Aggiungere 3 gocce di sia cloranile 0,8 mM in DMF e la soluzione al 2% in soluzione acetaldeide DMF e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5-10 minuti. L&#39;indicazione è positiva le gocce di resina di tornitura blu / viola. </li><li> TRAP TEST ATTIVAZIONE: composti attivati ​​durante la sintesi può essere valutata trasferendo una piccola quantità (pl 5-10) della soluzione attivata per un liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS) flacone contenente 50 pl di pirrolidina. Mescolare a mano per pochi secondi (SOLUZIOdovrebbe diventare il giallo) e poi diluire con 450 microlitri di tetraidrofurano (THF) e sottoporre LC-MS. </li><li> ANALITICA LC-MS: Il prodotto finale e intermedi attivati ​​possono essere valutato utilizzando un HP 1200 serie LC-MS impianto dotato di Waters XTerra MS C18 3,5 micron 4,6 mm x 150 mm di colonna ed un sistema gradiente 5-95% di acetonitrile in acqua con 0,1% di acido formico in 30 minuti. </li></ol> 12. Risultati rappresentativi Un esempio di entrambi grezzo (Figura 4) e purificata (Figura 5) tracce LCMS sono fornite. Purificati rese di circa il 10% si aspetta con le modalità sopra descritte. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di set-up sperimentale per la sintesi in fase solida. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figura 2.Nomenclature rilevanti del Bis-aminoacidi / bis-peptidi. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figura 3. Complesso schema sintetico. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Figura 4a. Trace HPLC del prodotto grezzo a 274 nm. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figura 4b. Spettro di MS Peak prodotto grezzo. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Figura 5a. HPLC Trace di prodotto purificato a 274 nm. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Figura 5b. Spettro di MS purificato Product Peak.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

L&#39;approccio sintetico qui presentato fornisce un metodo per la sintesi di funzionalizzati bis-peptidi da blocchi acido bis-ammino costruzione utilizzando comuni tecniche in fase solida di sintesi peptidica. La sintesi di monomeri di questi &quot;mattoni&quot; PRO4 di trans-4-idrossiprolina 3 è altamente scalabile ed è stato completato con successo alla fase idantoina a 600 mmol (234 g) scala (non pubblicato). Una volta che i monomeri sono in mano, l&#39;uso di tecniche in fase solida fornisce un metodo più rapido di bis-peptide sintesi del nostro attuale soluzione fase metodologia 4 eliminando la necessità di reazione work-up e purificazioni intermedi. La sfida primario in sintesi in fase solida viene diagnosi progressi sintetico e risolvere problemi in quanto non intermedi sono isolati. Questo ha portato allo sviluppo di numerosi test colorimetrici comprese quelle per identificare se ammine libere (Kaiser Test 10) o senza idrossidoYLS (Methyl Red Test 7), sono esposti su resina. Sfortunatamente, il test comunemente usato Kaiser 10 non è generalmente applicabile nel nostro sintesi in fase solida per l&#39;utilizzo quasi esclusivo di ammine secondarie o ammine attaccati ad un carbonio quaternario. Altre opzioni per la valutazione di resina HMBA includono divisioni di prova utilizzando un nucleofilo quale idrazina 11, quantitativa scissione Fmoc monitorato da UV / Vis 1,11, e la cattura e l&#39;analisi in arrivo composti attivati. Un altro problema trascurato in sintesi in fase solida è la natura ripetitiva di passaggi sintetici richieste dall&#39;operatore. Cosciente di questo, gli autori consiglia vivamente l&#39;uso di un foglio di calcolo o lista di controllo durante l&#39;esecuzione di qualsiasi manuale in fase solida sintesi peptidica. La difficoltà nell&#39;utilizzare bis-peptidi per sintesi in fase solida rispetto alle comuni α-amminoacidi include il potenziale per accoppiamenti più difficile a causa sterico hinDrance, la necessità di on-resina chiusure dichetopiperazina e deprotections simultanee (Boc / tBu; Cbz / tBu). Un altro difficilmente è quello di conseguire rilascio quantitativa dalla resina utilizzando questa &quot;sicura&quot; metodo rispetto a mezzi più convenzionali. Con questi fattori in mente, è molto probabile che un&#39;ulteriore ottimizzazione di questo metodo può essere realizzato e le iniziative attuali sono in corso nel nostro gruppo per migliorare il metodo presentato qui.

<table border="1"><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> HMBA-Am Resina </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Tossico, Corrosivo </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Cancerogeno </td></tr><tr><td> DCM anidro </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Cancerogeno </td></tr><tr><td> Acido bromidrico 33% in acido acetico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Tossico, Corrosive, fumi quando è aperto </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Infiammabile, tossico, corrosivo </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Infiammabili, tossici </td></tr><tr><td> DMF anidra </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Infiammabili, tossici </td></tr><tr><td> HOAT </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Infiammabile, tossico, corrosivo </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Tossico, Corrosivo </td></tr><tr><td> CONSIGLI </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Infiammabili, tossici </td></tr><tr><td> Piperidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Infiammabile, tossico, corrosivo </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxic </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Tossico </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Tossico </td></tr><tr><td> Methyl Red </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Infiammabile, tossico, perossido di Formazione </td></tr><tr><td> Pirrolidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Infiammabile, tossico, corrosivo </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Pescatore </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS recipienti per reazioni </td><td> Grazia </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> Serie 1200 </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> Serie 1100 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Liofilizzatore </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> Argo </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

Nel 1962, RB Merrifield pubblicato la prima procedura utilizzando sintesi in fase solida del peptide come un nuovo percorso per sintetizzare in modo efficiente peptidi. Questa tecnica subito dimostrato la sua soluzione più vantaggiosa in fase predecessore in termini di tempo e lavoro. Miglioramenti relativi alla natura del supporto solido, i gruppi di protezione impiegati e dei metodi di attacco utilizzati nel corso degli ultimi cinque decenni hanno solo aumentato l&#39;utilità del sistema originale di Merrifield. Oggi, l&#39;uso di un Boc e protezione basato su base / nucleofilo strategia di resina scindibile o Fmoc e protezione basato su resina acida strategia scindibile, introdotta da RC Sheppard, sono più comunemente utilizzati per la sintesi di peptidi 1. Ispirato strategia solido supportato Merrifield, abbiamo sviluppato un Boc / terz-butil fase solida strategia di sintesi per l&#39;assemblaggio di funzionalizzati bis-peptidi 2, che è qui descritti. L&#39;uso di sintesi in fase solida rispetto to soluzione fase metodologia non è solo vantaggiosa in termini di tempo e di lavoro come descritto da Merrifield 1, ma consente anche una maggiore facilità nella sintesi del bis-peptide librerie. La sintesi qui dimostrano che incorpora una fase finale di scissione che utilizza due step &quot;sicura&quot; meccanismo per liberare il funzionalizzato bis-peptide dalla resina mediante formazione dichetopiperazina. Bis-peptidi sono rigidi, spiro-scala oligomeri di bis-amminoacidi in grado di posizionare la funzionalità in modo prevedibile e progettabili, controllato dal tipo e la stereochimica delle unità monomeriche e la connettività tra ogni monomero. Ogni bis-amminoacido è un stereochimicamente puro, ciclico scaffold che contiene due aminoacidi (un acido carbossilico con una α-ammina) 3,4. Il nostro laboratorio sta attualmente indagando le potenzialità funzionali del bis-peptidi attraverso una vasta gamma di settori tra cui catalisi, interazioni proteina-proteina e nanomaterials.

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

L&#39;efficiente sintesi in fase solida di un peptide funzionalizzato bis-peptide trimero di utilizzare un &quot;sicura&quot; procedura clivaggio dalla resina HMBA descritto.

Sintesi in fase solida di un funzionalizzato Bis-Peptide Uso di &quot;Sicura del fucile&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

solid-phase-synthesis-functionalized-bis-peptide-using-safety-catch

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.4K Views.  Temple University. L'efficiente sintesi in fase solida di un peptide funzionalizzato bis-peptide trimero di utilizzare un "sicura" procedura clivaggio dalla resina HMBA descritto.

Video: Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Ottimizzazione della reazione Ugi Con Sintesi parallela e automatica Gestione liquidi

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

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Biologia

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solida piastra a base di restrizioni alimentari, Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplex fluorimetrico Metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2&#039;-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

Determinazione della durata della fase S mediante incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...