Lo scopo di questa ricerca è quello di approfondire la comprensione del ruolo della vascolarizzazione pancreatica sia nella normale biologia pancreatica che nello sviluppo della malattia. Arricchendo con successo la frazione endoteliale, cerchiamo di identificare percorsi specifici all'interno del sistema vascolare che governano le funzioni pancreatiche, che possono potenzialmente essere mirati a ripristinare e migliorare le funzioni pancreatiche in contesti di malattia. Recentemente, una crescente enfasi è stata posta sul ruolo della disfunzione delle cellule endoteliali nelle patologie pancreatiche.
L'identificazione dell'eterogeneità delle popolazioni di cellule endoteliali nel pancreas ha permesso di comprendere come le interazioni endoteliali del pancreas combattono o proteggono dalle malattie. Gli approcci omici come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula o a singolo nucleo, la proteomica e la genomica vengono utilizzati per studiare il pancreas a livello cellulare. Per ottenere informazioni a livello tissutale o spaziale, sono in fase di implementazione nuove piattaforme che utilizzano approcci imparziali e basati su sonde come Visium e Xenium.
In questo protocollo, descriviamo una tecnica di dissociazione delicata che riduce al minimo la diminuzione della vitalità cellulare da parte degli enzimi pancreatici endogeni e una procedura di smistamento cellulare magnetico per arricchire selettivamente le cellule endoteliali. La strategia di dissociazione e arricchimento del nostro protocollo consentirà un'ulteriore comprensione sia dei marcatori della superficie cellulare che del trascrittoma delle cellule endoteliali pancreatiche, precedentemente poco esplorato a causa di limitazioni tecniche. Per iniziare, posizionare il mouse soppresso sul tavolo operatorio.
Allunga gli arti del mouse e fissali con degli spilli. Usando le forbici chirurgiche, praticare una piccola incisione sulla linea mediana attraverso la pelle e il peritoneo dalla zona addominale inferiore ed estenderla verso la regione toracica. Taglia il diaframma e solleva la gabbia toracica per esporre il cuore.
Inserire un ago da 25 a 30 gauge collegato a una siringa contenente PBS sterile ghiacciato nel ventricolo sinistro del cuore. Perfondere il cuore a una velocità compresa tra 5 e 10 millilitri al minuto e fermarsi dopo aver iniettato 10 millilitri. Quindi, utilizzando forbici da dissezione e pinze, estrarre con cura il pancreas.
Trasferire il pancreas in una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di PBS ghiacciato, insieme all'inibitore della tripsina e posizionare la provetta sul ghiaccio. Per iniziare, ottenere il pancreas murino in una capsula di Petri contenente PBS ghiacciato. Usando forbici e pinzette chirurgiche, rimuovere con cura il tessuto in eccesso.
Trasferire il pancreas tagliato in una provetta da cinque millilitri contenente un millilitro di soluzione di dissociazione. Con le forbici da dissezione, tritare i tessuti pancreatici in pezzi sottili, mantenendo la provetta in ghiaccio. Trasferite il lisato in una provetta da 50 millilitri posta sul ghiaccio.
Aggiungere due millilitri di soluzione di collagenasi alla provetta da cinque millilitri per rimuovere l'eventuale tessuto pancreatico residuo e trasferirlo nella provetta da 50 millilitri. Incubare la provetta in un bagno d'acqua temperato a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Posizionare il tubo con l'omogeneizzato di tessuto sul ghiaccio e lasciarlo riposare per gravità.
Quindi passare il surnatante attraverso un filtro da 70 micrometri e aggiungere cinque millilitri di soluzione di arresto della dissociazione. Utilizzando un ago calibro 27, triturare il pellet rimanente con un ulteriore millilitro di soluzione di dissociazione e farlo passare attraverso il filtro come prima. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lavaggio.
Incubare una volta 10 alla potenza di sette cellule con un microlitro di anticorpo anti-biotina CD31 su un rotatore. Aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-biotina e incubare per altri 40 minuti. Quindi installare un supporto magnetico con il supporto del separatore della colonna e applicare la colonna.
Dopo aver bilanciato la colonna, aggiungere il campione e lavare con un totale di nove millilitri di tampone di lavaggio. Rimuovere la colonna dal supporto e posizionarla in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di tampone di lavaggio alla colonna.
Utilizzando uno stantuffo, spingere verso il basso le cellule nella colonna per raccogliere l'eluizione contenente le cellule endoteliali. Infine, ridurre le frazioni di flusso e di eluizione. Dopo la risospensione, contare le cellule e misurare la vitalità.
L'analisi PCR quantitativa per convalidare l'arricchimento delle cellule endoteliali ha mostrato che le frazioni arricchite avevano livelli significativamente più elevati di geni marcatori, Pecam1 e Kdr rispetto ai campioni a flusso continuo. Nelle frazioni arricchite è stato osservato un livello più basso di NK6 omeobox 1, un fattore di trascrizione nelle cellule endocrine pancreatiche. Il western blotting ha mostrato forti segnali di CD31 alla dimensione prevista, confermando ulteriormente l'arricchimento delle cellule endoteliali nelle frazioni.
