Questo metodo può avere risposta a domande chiave nel campo dell'isolotto pancreatico sulla differenziazione del lignaggio dell'isolotto pancreatico, sulla maturazione e sulla rigenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la raccolta di singole cellule isolotti pancreatiche per la generazione di dati di sequenziamento dell'RNA a singola cella di alta qualità. L'applicazione di questa tecnica si estende verso la terapia del diabete e delle altre malattie endocrine pancreatiche attraverso l'analisi trascritologica delle singole cellule endocrine pancreatiche sulle condizioni patologiche.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'inserimento dell'ago nel condotto biliare stretto del pancreas per la perfusione può essere complicato. Per il giorno embrionale 17,5 embrioni. Dopo aver aperto la cavità addominale, utilizzare una pinzetta a gomito per trasferire il tessuto viscerale su un piatto inferiore nero di sei centimetri contenente PBS freddo.
Utilizzare le pinze per staccare il pancreas dal tessuto viscerale. E mettere il tessuto pancreatico in una fiala da 20 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione fredda di collagenasi. Per il giorno postnatale da zero a 15 topi, sezionare attentamente tutti i lobi del pancreas prima di posizionare il tessuto nella collagenasi.
Per il giorno postnatale da 18 a 60 topi, rimuovere prima lo xifoide ed estrarre l'intestino sul lato destro della cavità addominale. Spingere i lobi mediali sinistro e destro del fegato su ciascun lato per esporre la cistifellea e il comune condotto biliare. E bloccare il duodeno con un paio di morsetti di piccoli recipienti nelle posizioni superiore e inferiore per fiancheggiare il sito in cui il condotto biliare entra nel duodeno.
Successivamente, caricare una siringa da 5 millilitri dotata di un ago calibro 30 con soluzione di collagenasi fredda. E usa il microscopio per inserire la punta dell'ago nella cistifellea. Manipolare con cura e senza intoppi l'ago attraverso il comune condotto biliare.
E deprimere lo stantuffo per perfondere il pancreas con uno o cinque millilitri della soluzione di collagenasi in base alle dimensioni del topo. Quando tutta la soluzione è stata perfusa, utilizzare le forcep per trasferire immediatamente il pancreas in una fiala da 20 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione fresca di collagenasi fredda. Quando tutto il tessuto pancreatico è stato raccolto, posizionare il flaconcino in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per tre minuti, seguito da tre o cinque minuti di agitazione delicata.
Quindi filtrare il prodotto digerito attraverso un colino in nylon da 0,25 millimetri in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri. E utilizzare una siringa da 20 millilitri contenente PBS ghiacciato per lavare accuratamente il colino. Per il giorno postnatale da 18 a 60 pancreata, centrifugare il campione filtrato e rimospendare il tessuto in 30 millilitri di PBS freddo.
Quindi decantare la sospensione del tessuto in un piatto inferiore nero di sei centimetri e utilizzare una pipetta da 200 microlitri e un microscopio sezionante per raccogliere gli isolotti per il trasferimento in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente un piccolo volume di PBS freddo. Per il giorno embrionale 17,5 dopo il giorno natale 15 pancreata, centrifugare il tessuto pancreatico filtrato e rimpicolare il pellet in soluzione di tripsiderina-EDTA per un'incubazione di quattro minuti in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi. Al termine dell'incubazione, cercare delicatamente di valutare il pellet per un minuto con una pipetta da 200 microliter, seguita dall'aggiunta di 0,5 volte il volume del siero bovino fetale freddo con un vortice delicato per fermare la digestione.
Quindi raccogliere il digest per centrifugazione e risosopendare le cellule in 200 microlitri di tampone FACS in un tubo FACS da 5 millilitri per lo smistamento per citometria del flusso. Per il prelievo e lalisi a cella singola, tampone dilisi cellulare appena preparato in otto tubi PCR a strisce e trasferire una singola cella in ciascuno di essi. Vortice i campioni per liscittere le cellule per il rilascio dell'RNA, seguito da centrifugazione per 30 secondi a quattro gradi Celsius, e stoccaggio immediato sul ghiaccio.
Per la trascrizione inversa, incubare i lisati per tre minuti a 72 gradi Celsius seguiti da un minuto sul ghiaccio. Centrifugare brevemente i campioni per 30 secondi a quattro gradi Celsius e aggiungere 5,7 microlitri di miscela di trascrizione inversa a ciascun campione per portare il volume totale a 10 microlitri per ogni campione. Dopo un delicato vortice e centrifugazione, caricare i campioni in un termociclo e avviare il programma di trascrizione inversa.
Per la preamplificazione della reazione a catena della polimerasi, o PCR, aggiungere 15 microlitri di miscela PCR a ciascun campione contenente le prime reazioni del filamento, seguiti da un delicato vortice e centrifugazione. Quindi caricare i campioni nel termociclo e avviare il programma PCR. Per la purificazione della PCR, aggiungere 25 microlitri di perline di purificazione del DNA rimorsiate a ciascun campione e mescolare bene con il vortice.
Quindi ruotare rapidamente i campioni a temperatura ambiente per raccogliere il liquido evitando l'insediamento delle perline. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, posizionare i campioni su un supporto magnetico appropriato, rimuovendo e scartando con cura il supernatante quando la soluzione è chiara. Lavare le perline con due lavaggi di 30 secondi in 200 microlitri di etanolo per lavaggio preparato al momento all'80%.
E scartare l'etanolo rimanente dopo il secondo lavaggio. Quando le perline si sono asciugate all'aria, aggiungere 11 microlitri di acqua priva di nucleasi per elutare il bersaglio di DNA dalle perline, seguito da vortice. Quindi centrifugare rapidamente i campioni, riportare i campioni al supporto magnetico fino a quando la soluzione non è chiara e trasferire 10 microlitri di ciascun campione su un nuovo tubo PCR.
Il cDNA amplificato con successo dovrebbe avere una lunghezza completa superiore a 500 coppie di basi ed essere arricchito da 1,5 a due coppie di basi di chilo. Inoltre, di solito c'è un arricchimento da 500 a 600 coppie di basi di cDNA osservato in insulina una RFP più cellule, che può rappresentare le trascrizioni di insulina. Tuttavia, i frammenti di cDNA vicino a 100 coppie di basi sono dimeri primer, che di solito sono causati da primer eccessivi e che devono essere rimossi ripetendo la fase di purificazione del DNA.
I frammenti di cDNA tra le 100 e le 500 coppie di basi di solito rappresentano cDNA degradato, che è causato da uno stato di cattivo stato cellulare o da problemi di regione, come la contaminazione da RNasi e dovrebbe essere escluso. Dopo la purificazione delle librerie cDNA per il sequenziamento, il cDNA che va da 250 a 450 coppie di basi può essere ottenuto attraverso l'aggiunta di perline di purificazione del DNA al primo e al secondo round di purificazione. Dopo la purificazione delle perline di DNA, il punteggio di qualità del sequenziamento dovrebbe essere maggiore di 30 durante la valutazione della qualità del sequenziamento.
Per ottenere cellule di alta qualità per le analisi a valle, sono escluse cellule con meno di 0,5 milioni di letture mappate o con meno di 4.000 geni rilevati, facilitando la caratterizzazione di diversi gruppi di cellule e l'identificazione di geni che sono eterogenamente espressi in diversi gruppi dopo l'analisi dei componenti principali e il clustering gerarchico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di perfondere rapidamente il pancreas prima della digestione della collagenasi per evitare l'isolotto sulla digestione e mantenere l'ambiente libero dalla RNasi durante le procedure a singola cellula. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'imaging isolotto e la coltura possono essere eseguiti per facilitare la visualizzazione della struttura dell'isolotto ed esaminare le risposte cellulari e la stimolazione del farmaco.
Dopo lo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della ricerca pancreatica per esplorare i meccanismi di sviluppo e rigenerazione del lignaggio dell'isolotto, così come la progressione del diabete nei mammiferi.
