Siamo grati a M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng utili per le discussioni. Cellule HeLa sono stati ottenuti dal National Center cultura cellulare (Minneapolis, MN). Ringraziamo anche Eisai Co., Ltd per la fornitura di E7107 e la Nikon Imaging Center della Harvard Medical School per un aiuto con microscopia ottica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione al NIH GM043375 RR e FEG e NRSA borsa di studio per JLH.

1. Le cellule HeLa in crescita per l&#39;estrazione del nucleare <ol><li> Cellule HeLa piastre su tre piastre da 150 mm con DMEM mezzo supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina. Crescere in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 fino a quando le cellule sono al 90% confluenti. </li></ol> Tip-Split cellule 1:10 da un piatto confluenti e del raccolto 3 giorni dopo la divisione. Tip-Un posto aggiuntivo può essere coltivata in caso non vi sono abbastanza cellule con tre piastre (per esempio, se le cellule sono meno del 90% confluenti). 2. Preparare Chill-Solutions estratto nucleare <ol><li> Preparare le soluzioni fresche come indicato nella Tabella 2. </li><li> Aliquotare 10 ml di tampone ipotonico in una provetta da 15 ml Falcon. Aliquotare 1 ml di tampone di sale e 1 ml di Buffer Low Salt in 1,5 ml provette Eppendorf. Raffreddare i buffer sul ghiaccio. Aggiungere i volumi appropriati di PMSF e DTT per ogni buffer immediatamente prima dell&#39;uso (vedi <strong&gt; Tabella 1). </li></ol> 3. Raccolta di cellule HeLa per estrazione nucleare <ol><li> Aspirare supporti dalle cellule e le cellule lavate una volta con 13 ml di temperatura ambiente 1X PBS per piastra. </li><li> Aspirare il lavaggio PBS. </li></ol> Tip-Aspirare tanto del PBS come possibile aspirante primo, poi in piedi la piastra su un lato, attendere qualche secondo, ed aspirando il resto. <ol start="3"><li> Utilizzo di un sollevatore cella, raschiare le cellule al bordo inferiore delle piastre, e poi trasferire le cellule ad un tubo Eppendorf. Evita di fare le bolle. Le 3 piastre di cellule raschiate dovrebbe inserirsi in una provetta 1,5 ml Eppendorf. </li></ol> Tip-È facile stimare il volume di celle se una provetta Eppendorf viene utilizzato. Per la scala, usare tubi Falcon. <ol start="4"><li> Centrifugare a 4 ° C in una microcentrifuga per 5 min a 100 xg per agglomerare le cellule. </li></ol> 4. Swell cellule HeLa in tampone ipotonico </p&gt; <ol><li> Aspirare accuratamente la PBS dalla cella pellet e stimare l&#39;ematocrito (PCV), cercando in la gradazione sul tubo. Tre piastre confluenti di cellule HeLa producono circa 500 microlitri di PCV. </li><li> Aggiungi 2X il PCV di tampone ipotonico al pellet cellulare. Agitare delicatamente per risospendere le cellule. Utilizzare un Pipetman P1000 per risospendere le cellule delicatamente pipettando su e giù, se necessario. </li><li> Centrifugare a 4 ° C in una microcentrifuga per 5 min a 100 xg per agglomerare le cellule. * Le cellule hanno iniziato a gonfiarsi da questo momento, e il volume cellulare dovrebbe essere di circa 750 pl-1000 pl. </li><li> Aspirare accuratamente la Buffer ipotonica e aggiungere nuovi buffer ipotonico ad un volume finale di 1,5 ml. Risospendere le cellule. </li><li> Incubare le cellule risospese gonfi su ghiaccio per 10 min. </li></ol> 5. Lyse celle usando un omogeneizzatore Dounce <ol><li> Utilizzare tampone ipotonico per sciacquare il Dounce e poi raffreddare sul ghiaccio. Pulire a secco con un pestello WIP delicato compitoer (es Kimwipe). Rimuovere il buffer rimanente dal Dounce utilizzando una punta di 1.000 ul micropipetta estesa. </li><li> Trasferire le cellule gonfie nella Dounce. Spostare lentamente il pestello stretta del Dounce su e giù per 5 volte per lisare le cellule, facendo attenzione a evitare le bolle. </li><li> Saggio per la lisi delle cellule usando Un&#39;aliquota di 5 microlitri di cellule dalla Dounce. Posizionare l&#39;aliquota in un tubo Eppendorf e aggiungere un volume uguale di Trypan Blue. Mettere il composto su un vetrino ed esaminare le cellule con un microscopio ottico. I nuclei delle cellule lisate apparirà blu. Circa il 90% lisi è l&#39;ideale. </li></ol> Tip-Il numero di volte delle cellule deve essere dounced varierà a seconda della tenuta del Dounce. Nell&#39;effettuare tale protocollo per la prima volta, determinare il numero di volte per Dounce effettuando passo 5,3 dopo ogni corsa con la Dounce. Non esagerare con Dounce, douncing eccessiva distruggerà i nuclei. <ol start="4"><li> Trasferire le cellule lisate in un pre-chilled tubo Eppendorf e rotazione in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min a 1500 x g. Il pellet contiene i nuclei. Con attenzione trasferire il surnatante in una nuova provetta senza interrompere i nuclei. Il supernatante contiene il citoplasma. </li></ol> Tip-Il citoplasma può essere utilizzato così com&#39;è o ulteriormente lavorato per uno S100 utilizzando lo stesso ad alta velocità di centrifuga usata per gli estratti di bulk (cfr. 1 per preparare uno attivo S100 da estratti di bulk). 6. Salt-Estrarre il Nuclei <ol><li> Stimare il volume al sacco nucleare (PNV), cercando in la gradazione sul tubo. Una PCV di 500 pl produce tipicamente una PNV di 400 microlitri. </li><li> Aggiungere ½ X PNV di tampone sale insufficiente alla nuclei inserendo una punta micropipetta al fondo della provetta e lentamente spruzzando il buffer in nuclei mentre delicatamente miscelazione. Non pipettare su e giù. Delicatamente a scatti i tubi per assicurarsi che il pellet è completamente risospeso nel tampone di sale basso prima di continuare. </li> &lt;li&gt; Add ½ X PNV di tampone di sale e mescolare velocemente 1 volta invertendo il tubo. Non agitare. Ruota a 4 ° C per 30 min. </li></ol> Tip-Sii gentile con i nuclei quando sono in Buffer di sale per evitare la loro lisi. <ol start="4"><li> Spin a 4 ° C in una microcentrifuga per 15 min a 18.000 x g. Il surnatante è l&#39;estratto di sale nucleare (HS-NE). Tre lastre di cellule genere permette di ottenere 500-600 microlitri di HS-NE. </li></ol> 7. Concentrato e Dializzare l&#39;estratto nucleare <ol><li> Trasferire 500 pl del HS-NE in refrigerati mini-centricons (Amicon) e centrifuga per 50 minuti a 4 ° C in una microcentrifuga a 14000 x g. Invertire la mini-centricon (Amicon) e collocarlo in una nuova provetta Eppendorf. Spin per 2 min a 4 ° C 1000 xg per recuperare l&#39;HS-NE. La HS-NE saranno concentrate a circa 115 microlitri. </li><li> Utilizzando una Pipetman P200, trasferire 45 aliquote pl della HS-NE in mini-dialisi Slide-A-Lyzers, e metterli in 500 ml di tampone di dialisi refrigerata. Assicurarsi che il fondo della Slide-A-Lyzer è allineato con la parte inferiore del corpo galleggiante. Mescolare per 1-2 ore a 4 ° C. La NE avrà un aspetto torbido dopo la dialisi. </li></ol> Tip-Non centrifugare per rimuovere il precipitato torbido che viene osservata dopo dialisi, in quanto questa centrifugazione riduce l&#39;attività dell&#39;estratto. <ol start="3"><li> La NE può essere usata immediatamente o aliquote. Aliquote dovrebbe essere lampo congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Il NE possono essere memorizzati e sottoposti ad almeno due cicli gelo-disgelo senza perdere attività. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Recentemente, efficienti sistemi in vitro per l&#39;accoppiamento RNAP trascrizione II di splicing sono stati sviluppati 2-5. Questi sistemi impiegati coltivate cellule HeLa in massa e quindi non sono suscettibili di rapido testare gli effetti di specifici trattamenti cellulari su più campioni. Sulla base di questo bisognond l&#39;utilità generale di un piccolo estratto di protocollo (vedi discussione), abbiamo stabilito un solido metodo di piccola scala nucleare estratto. I dati rappresentativi del confronto RNAP II trascrizione / splicing reazione in piccola scala estratto nucleare con l&#39;estratto bulk nucleare è mostrato in Figura 2. Un costrutto di DNA-CMV, che contiene il promotore CMV e codifica un substrato splicing standard (FTZ 3, Figura 2A) è stato utilizzato per l&#39;analisi. Quando questo costrutto è stato incubato nella massa (corsie 1-3) o di piccole dimensioni (corsie 4-6) estratto, livelli simili di nascente del pre-mRNA sono stati sintetizzati dal punto 5 min Tempo (figura 2, corsie 1 e 4 ). Dopo aggiunta di α-amanitina per bloccare la trascrizione ulteriormente, gli intermedi di giunzione e prodotti giuntate accumulata nel tempo con cinetiche simili in entrambi i tipi di estratti (figura 2, corsie 2, 3, 5, 6). Questi risultati rappresentativi mostrano che l&#39;efficienza del colpo<html> led RNAP II trascrizione / splicing sistema è simile negli estratti rinfusa e su piccola scala nucleari. Per dimostrare l&#39;utilità della piccola scala metodo estratto, estratti sono stati preparati da cellule HeLa trattati con l&#39;inibitore splicing, E7107, o il composto di controllo negativo pladienolide F 6,7 e quindi accoppiata RNAP II trascrizione / splicing saggio è stato effettuato. Come mostrato in figura 3, trascrizione da RNAP II verificato efficientemente estratti preparati sia dal Pladienolide F E7107 e cellule trattate (10 punti temporali min). Al contrario, si è verificato splicing normalmente l&#39;estratto preparato dalle cellule trattate con F Pladienolide ma è stata abolita in E7107 cellule trattate (Figura 3, 20-60 punti di tempo min). Questi dati forniscono la prova di concetto per l&#39;utilizzo degli estratti nucleari di piccole dimensioni per il trattamento speciale di cellule in piccola scala. jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema di piccola scala protocollo Extract. Punto P1. Le cellule sono coltivate come monostrati, raccolto da piastre con un sollevatore di cella e gonfiato con l&#39;aggiunta di tampone ipotonico. Passo P2. Le cellule sono lisate usando un omogeneizzatore Dounce e centrifugato a pellet nuclei. Passo P3. I nuclei sono separati dal citoplasma e subiscono estrazione del sale. Passo P4. L&#39;estratto nucleare viene concentrata e dializzato. Passo P5. I risultati si ottengono che mostrano che gli estratti nucleari sono funzionali (vedi figura 2 per maggiori dettagli). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> Figura 2. Estratti nucleari di piccole dimensioni sono robuste in un RNAP accoppiato II trascrizione / splicing saggio. A. Schematica del CMV-DNA FTZ template utilizzato per accoppiamento RNAP II trascrizione / splicing. Il promotore CMV e le dimensioni degli esoni e introni sono indicati. Confronto B. accoppiato RNAPII trascrizione / splicing test utilizzando l&#39;estratto di massa nucleare o su piccola scala estratto nucleare. α-amanitina è stato aggiunto dopo 5 minuti di trascrizione e di splicing è stata lasciata avvenire per 30 e 60 min. RNA è stato estratto e frazionato su un gel di poliacrilammide denaturante al 5% e rilevato da phosphoimager. Gli intermedi di giunzione ed i prodotti sono indicati. Il endogeno U6 snRNA e tRNA presenti nell&#39;estratto e che sono 32 P-marcato durante l&#39;incubazione sono indicati. Vedere 3 per un protocollo dettagliato sul RNAP accoppiato II trascrizione / splicing del sistema. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> Figura 3. Estratti nucleari piccola scala preparati da cellule HeLa trattati con il farmaco inibitore E7107 splicing sono difettosi in splicing. Cellule sono state trattate con 3 Pladienolide pM o F E7107 comedescritto 6 e poi utilizzata per preparare estratti nucleari piccola scala. Un decorso di tempo è stata effettuata utilizzando la stessa trascrizione / splicing saggio come in Figura 2. Gli intermedi di giunzione e dei prodotti, e snRNA U6 e tRNA sono indicati.

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	<li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro.">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li><li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts.">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li><li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly.">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li><li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns.">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147 (2006).</li><li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing.">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li><li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide.">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li><li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region.">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing.">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li></ol>

Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Abcam, Plc.

Abbiamo stabilito un metodo rapido e riproducibile per la preparazione di estratti nucleari di piccole quantità di cellule HeLa come monostrati coltivate. Abbiamo dimostrato che questi estratti sono robusti, mostrando che la cinetica e l&#39;efficienza delle RNAP II trascrizione / saggi di splicing sono simili negli estratti di piccole dimensioni e massa nucleari. Abbiamo mostrato l&#39;utilità degli estratti dimostrando che estratti preparati da cellule trattate con un farmaco inibitore della giunzione sono attivi per la trascrizione ma difettoso in splicing. Il metodo per preparare estratti nucleari piccola scala è stata stabilita mediante la combinazione e l&#39;ottimizzazione dei metodi precedentemente stabiliti per rendere estratti di cellule HeLa coltivate in sospensione in larga scala 1,8 e un metodo per la piccola preparazione di estratti 9. Abbiamo stabilito il protocollo perché i precedenti piccola scala estratti non erano funzionali per alcuni saggi, come la trascrizione accoppiata / splicing saggio. Una differenza importante tra la precedente piccola scala protocollo 9 e la nostra è che abbiamo ottimizzato le condizioni per la lisi delle cellule utilizzando un mini-Dounce mentre il precedente protocollo lisate le cellule spingendo attraverso un piccolo ago di calibro 9. L&#39;ago-lisi risultati in bolle, che possono spiegare perché gli estratti sono stati inattivi e / o difficili da riprodurre per alcuni saggi. Abbiamo anche aggiunto una fase di concentrazione al nostro protocollo. Questo passaggio aumenta l&#39;attività degli estratti, che sono estremamente sensibili alla concentrazione, e limita anche la variabilità tra estratti che è inerente ai piccoli preparazioni. Infine, la preparazione viene usualmente effettuata con solo tre piastre da 150 mm di cellule monostrato, senza alcun effetto significativo sull&#39;attività rispetto al estratti rinfusa. Pertanto, la procedura è facilmente recuperabili per i piccoli preparazioni che richiedono reagenti costosi o la disponibilità cellulare limitata. Per esempio, abbiamo preparato small scala estratti da cellule atterramento RNAi e da leucemia linfocitica cronica (CLL), le cellule del paziente, questi estratti e utilizzati per le prove funzionali e / o biochimici (EGF, JLH, TY e RR, inedito). Abbiamo scoperto che gli estratti sono preziose per RNAi seguita da specifici saggi biochimici quali immunopreciptations, western e la colorazione d&#39;argento. Dopo aver stabilito l&#39;efficacia di abbattere una proteina particolare, uno studio più dettagliata può essere effettuata facendo un atterramento linea cellulare stabile, che può essere utilizzato per preparare estratti supplementari a costi inferiori. La spettrometria di massa di proteine ​​presenti in immunoprecipitati ottenuti da queste linee cellulari smontabili sarà anche una utile applicazione del metodo. Oltre al accoppiato trascrizione / splicing saggio che abbiamo usato come esempio per la descrizione di protocollo qui, i piccoli estratti dovrebbe essere generalmente applicabile a numerosi saggi funzionali e biochimici, come quelli utilizzati per la st diversieps di espressione genica (es. capping, splicing, trascrizione, poliadenilazione, elaborazione microRNA). Il protocollo può anche essere adattato per tipi di cellule di pazienti che possono essere ottenuti sia in sospensione (come le cellule CLL) o in coltura (quali fibroblasti paziente). Infine, la frazione citoplasmatica ottenuta durante la procedura sia utile per i saggi funzionali e biochimiche che richiedono il citoplasma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Nome e cognome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-idrossietil) piperazin-1-etansolfonico </td><td> Sigma </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Di cloruro di magnesio esaidrato </td><td> Sigma </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Cloruro di potassio </td><td> Pescatore </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluoruro Phenylmethanesulfonyl </td><td> Sigma </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Ditiotreitolo </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Etilendiamminotetracetato, sodio, diidrato </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td> MP Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Media Minimal Essential Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Trypan Blue Stain 0,4% </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> Sollevatori cellulari </td><td></td><td> Corning </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> Piatti 150mm </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> Estesa Micropipetta Tip </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> Dounce omogeneizzatore, 1 ml, con pestello stretta </td><td></td><td> Wheaton </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> Mini-Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche. <table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> Finale </td><td> Stock </td><td> Dispensare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ipotonica </td><td> HEPES 10 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td> &lt;td&gt; 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 750 microlitri </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1,67 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 pl </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 microlitri </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Portate fino a 500 ml con acqua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Salt Basso </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td></td><td> 20 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 microlitri </td></tr><tr><td> &amp; Nbsp; </td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 40 microlitri </td></tr><tr><td></td><td> 25% Glicerina </td><td> Glicerina </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 pl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Portare a 100 ml con acqua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sale alta </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td></td><td> 1.4M KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 40 microlitri </td></tr><tr><td></td><td> 25% Glicerina </td><td> Glicerina </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 pl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Portare a 100 ml con acqua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dialisi </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16,625 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td></td><td> 20% Glicerina </td><td> Glicerina </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 pl </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 microlitri </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Portate fino a 500 ml con acqua </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Soluzioni per la preparazione di estratto nucleare.

small-scale nuclear extracts for functional assays of gene-expression machineries

Una grande quantità di progressi nella comprensione dell&#39;espressione genica è stato realizzato utilizzando sistemi in vitro. Per la maggior parte degli studi, saggi funzionali vengono effettuate utilizzando estratti che sono preparati in massa da 10-50 o più litri di cellule coltivate in sospensione. Tuttavia, queste grandi preparazioni non sono suscettibili di rapido test in vitro effetti derivanti da una varietà di trattamenti cellulari in vivo o condizioni. Questo articolo video di giornale mostra un metodo per preparare funzionali estratti nucleari piccola scala, utilizzando le cellule HeLa come esempio. Questo metodo viene effettuata utilizzando sole tre piastre da 150 mm di cellule cresciute in monostrati aderenti. Per illustrare l&#39;efficienza dei piccoli estratti, si dimostra che essi sono attivi come bulk estratti nucleari per accoppiati RNA polimerasi II trascrizione / splicing reazioni. Per dimostrare l&#39;utilità del protocollo estratto, si dimostra che splicing è abolito in estratti preparati da cellule HeLas trattati con il farmaco inibitore E7107 splicing. La piccola scala protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile a qualsiasi processo o tipo di cellula che può essere studiato in vitro con estratti cellulari. Questi includono le cellule dei pazienti che sono disponibili solo in quantità limitate o cellule esposte a numerosi agenti come la droga, gli agenti che danneggiano il DNA, RNAi, o di trasfezione, che richiedono l&#39;uso di popolazioni cellulari di piccole dimensioni. Inoltre, piccole quantità di cellule appena coltivate sono convenienti e / o richiesto per alcune applicazioni.

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Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Un protocollo per la preparazione di robusti, piccoli estratti HeLa nucleari viene descritto. Questo protocollo è importante per i saggi che richiedono l&#39;uso di piccole popolazioni di cellule, come cellule trattate con farmaci o RNAi. Il metodo dovrebbe essere applicabile ad un&#39;ampia varietà di analisi di espressione genica e altri tipi cellulari, incluse cellule del paziente.

Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

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25.9K Views.  Harvard Medical School. Un protocollo per la preparazione di robusti, piccoli estratti HeLa nucleari viene descritto. Questo protocollo è importante per i saggi che richiedono l'uso di piccole popolazioni di cellule, come cellule trattate con farmaci o RNAi. Il metodo dovrebbe essere applicabile ad un'ampia varietà di analisi di espressione genica e altri tipi cellulari, incluse cellule del paziente.

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

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Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elettrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

Estrazione di antigeni dei tessuti per test funzionali

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...