Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni a favore di FZ dal NIH (R01NS064288) e Craig H. Neilsen Foundation.

1. Preparazione di vetrini coprioggetti, terreno di coltura, e enzimi digestivi <ol><li> Il 12-mm tondo # 1 vetrini vengono utilizzati per la coltura neuronale. Le coprioggetti vengono puliti con il 10% HCL notte seguito da lavaggio ad ultrasuoni con acqua distillata deionizzata e per 3 volte (20 minuti / tempo). Le coprioggetti puliti sono memorizzati in etanolo 70% per un uso futuro. Prima di ogni sperimentazione, i coprioggetti sono dotate di aria essiccata e inseriti nella piastra di coltura. </li><li> Per rivestire le coprioggetti secchi, 100 pl di soluzione di rivestimento contenente 100 pg / ml di poli-D-lisina e 10 ug / ml soluzione laminina lavoro viene aggiunto su ciascun vetrino coprioggetto e la piastra di coltura viene trasferita in un incubatore a 37 ° C. Dopo 1-2 ore, la soluzione di rivestimento viene rimosso e le coprioggetti sono lavate 3 volte con PBS sterile 1X. </li><li> Per preparare il terreno di coltura, il terreno minimo essenziale (MEM) è integrato con 5% siero bovino fetale (FBS), 1X soluzione di penicillina-streptomicina (500 unità di penicillinalin e 500 pg di streptomicina), 1X Glutamax-integratore I, ed i reagenti antimitotici contenente 20 pM 5-fluoro-2-desossiuridina e 20 pM uridina (FDU / R). Per il terreno privo di siero, il FBS è sostituito con il supplemento B27. </li><li> La collagenasi Una soluzione viene preparata sciogliendo collagenasi A polvere con MEM per fare una concentrazione operativa di 1 mg / ml. Per la tripsina, il Triplo 1X Express viene utilizzato. </li></ol> 2. Dissezione e Raccolta di neuroni adulti mouse DRG <ol><li> Dopo l&#39;eutanasia 6 - al topo adulto a 10 settimane di età, togliere la pelle dorsale e tagliare l&#39;intera colonna vertebrale. Lavare la colonna vertebrale rimosso con 1 x PBS 2-3 volte. </li><li> Pin rimossa la colonna vertebrale alla piastra dissezione con un massimo lato ventrale, e rimuove accuratamente i muscoli per esporre i nervi sensoriali sotto un microscopio da dissezione. I nervi collegati al DRG a livello di legname sono la più grossa e facili da individuare. Pertanto, solo per la maggior parte degli esperimenti lombareDRG vengono raccolte. </li><li> Tagliare ogni vertebra lungo la linea centrale con le forbici piccole e rimuovere con attenzione i dischi intervertebrali. Utilizzo di pinze per dividere ogni vertebra per esporre il midollo spinale. </li><li> Per sezionare i DRG legname, sollevare ogni nervo legname con una pinza e risalire verso il midollo spinale per individuare i DRG associati lombari (da L1 a L6). </li><li> Tagliare ciascun DRG da allegato nervi periferici, radici dorsali e ventrali con le forbici a molla, e conservarla in provetta per microcentrifuga con mezzo MEM posti su ghiaccio. Più DRG a diversi livelli spinali (ad esempio DRG toracica) possono essere sezionati in modo simile quando necessario. </li></ol> 3. Digestione e dissociazione dei neuroni adulti mouse DRG <ol><li> Dopo aver raccolto tutti i DRG sezionati, sostituire il mezzo MEM con 1 ml di una soluzione di collagenasi e incubare la provetta per microcentrifuga a 37 ° C per 90 min. </li><li> Sostituire collagenasi Una soluzione con 500 microlitri 1X Triplo Express in modoluzione e incubare a 37 ° C per 15-20 min. </li><li> Rimuovere la soluzione Triplo Express e lavare i DRG con 1 ml di terreno di coltura preparato (contenente il 5% FBS) per 3 volte. </li><li> Aggiungere 600 microlitri di media cultura e pipettare delicatamente su e giù per triturare i tessuti per 20-30 volte utilizzando un ml 1 blu, pipetta graduata punta. </li><li> Dopo triturazione, permettere ai non-tessuti dissociati per regolare verso il fondo del microcentrifuga e trasferire la sospensione cellulare in un tubo 10 ml sterile. Aggiungere un altro mezzo di 600 microlitri cultura e ripetere l&#39;operazione fino a quando triturazione maggior parte dei tessuti sono dissociati. La sospensione cellulare ottenuta contiene sia neuroni e cellule non neuronali. Nella maggior parte dei casi, le cellule da 6 DRG (~ 5 x10 4) vengono utilizzati per una reazione elettroporazione. </li></ol> 4. La manipolazione genetica dei neuroni attraverso elettroporazione <ol><li> Preparare la soluzione di trasfezione mescolando la soluzione nucleofection Amaxa per i neuroni di topo con i plasmidi di DNA (~ 10 mcg) O oligo siRNA (~ 0,2 nmol) per ottenere un volume finale di 100 microlitri per ogni trasfezione. </li><li> Centrifugare le cellule dissociate a 680 rpm per 7 minuti a temperatura ambiente, e il surnatante quanto possibile. Aggiungere la soluzione preparata trasfezione e pipettare delicatamente su e giù per 3-4 volte con 200 puntali pl per risospendere le cellule. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare miscelato con la soluzione trasfezione alla cuvetta elettroporazione e elettroporare le cellule utilizzando il sistema Amaxa Nucleofector programma G-013. </li><li> Dopo elettroporazione, immediatamente aggiungere 500 pl di pre-riscaldato (37 ° C) mezzo di coltura contenente FBS al cuvetta e trasferire tutta la soluzione (~ 600 pl) nella piastra di coltura rivestita a densità cellulari desiderati. Per esperimento che richiede risospensione e ri-placcatura, i neuroni sono coltivate direttamente sul piatto di coltura in plastica ad alta densità (10000-20000 cellule / pozzetto). Per l&#39;esperimento che esamina direttamente la crescita degli assoni, i neuroni sono placcati ONTO coprioggetto di vetro rivestite a bassa densità (3000-5000 cellule / pozzetto). Posizionare la piastra di coltura in incubatore (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Quattro ore dopo la placcatura quando i neuroni si sono attaccati ai substrati, gentilmente sostituire il terreno di coltura (che contiene la soluzione nucleofection Amaxa) con 500 microlitri mezzo di coltura fresco e pre-riscaldata, e restituire la piastra per l&#39;incubatore per la cultura supplementare (37 ° C , 5% CO 2). Entrambi mezzo di coltura contenente FBS o il terreno privo di siero può essere utilizzato in questa fase. </li></ol> 5. Coltura di neuroni adulti DRG per l&#39;analisi Axon crescita <ol><li> Per neuroni trasfettate con plasmidi di DNA, l&#39;espressione del gene d&#39;interesse (ad es EGFP) può essere osservato già dopo alcune ore uno elettroporazione. Per i neuroni trasfettate con siRNA, siamo soliti attendere 3-4 giorni per consentire l&#39;esaurimento sufficiente delle proteine ​​endogene. Le colture di neuroni possono essere direttamente fissato per l&#39;analisi la crescita degli assoni a varionoi il tempo punti (1-4 giorni dopo l&#39;elettroporazione) o ri-sospensione e ri-placcato per analizzare la ricrescita degli assoni (vedi sotto). </li><li> Per RNAi-mediate perdita di funzione studi, i neuroni in coltura possono essere risospeso e ri-piastrate per consentire assoni di ricrescere da neuroni, in cui le proteine ​​bersaglio sono già esauriti. Per fare ciò, sostituire il vecchio mezzo cultura dei neuroni in coltura ad alta densità con 1 ml preriscaldata mezzo fresco e pipetta delicatamente su e giù per 6-10 volte a ri-sospendere i neuroni collegati dalla piastra di coltura. Poiché cellule non neuronali (ad esempio le cellule di Schwann) attribuiscono molto più stretto al piatto cultura che i neuroni, le re-cellule sospese sono per lo più neuroni. </li><li> Trasferire i risospesi neuroni in una provetta da microcentrifuga e delicatamente triturare 10-15 volte a ri-separare i grumi di cellule nella sospensione singola cella. </li><li> Re-piastra di re-neuroni dissociati sul coprioggetto appena preparati a bassa densità (3000-5000 cellule / pozzetto) e la cultura per tutta la notte (16-24 ore). </li></ol> 6. Fissazione, Immuno-colorazione, e fluorescenza Imaging <ol><li> Aspirare il mezzo e aggiungere 4% paraformaldeide (PFA) (200 pl / pozzetto) per fissare le cellule per 15-20 min a temperatura ambiente. Le cellule fisse vengono poi lavate con 1X PBS per 3 volte. </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere la soluzione bloccante (1% albumina di siero bovino, 0,1% Triton X-100, 2,0% e siero di capra normale in 1X PBS) per i neuroni fissi per 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Per assoni etichette, i neuroni sono immuno-colorato con anti-neurofilamenti o anticorpi anti-βIII tubulina. Per fare ciò, una goccia 30μl di soluzione di anticorpo primario (1:1200 diluizione per anticorpo βIII-tubulina) su una parafilm per ogni coprioggetto. Invertire i coprioggetti e metterli sulla soluzione di anticorpo primario per 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Torna coprioggetti alla piastra cultura originale e lavarli con 1X PBS per 3 volte. </li><li> Ripetere la stessa procedura per l&#39;uno secondariotibody. </li><li> Lavare i coprioggetti con acqua distillata per 3 volte, e poi montare coprioggetto su vetrini con la soluzione di montaggio (ad esempio prolungare Antifade Gold). </li><li> I neuroni colorati possono essere esposte con qualsiasi sistema di microscopia a fluorescenza equipaggiato con una fotocamera digitale. Le lunghezze di assoni sono stati misurati e analizzati con il software di analisi di imaging. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi In assenza di fattori di crescita aggiunto extracellulari, i neuroni DRG adulti solito inizia a crescere assoni 48 ore dopo la prima placcatura. Gli assoni spesso mostrano morfologie ramificati (Figura 1). Al contrario, i re-placcati neuroni iniziano a estendere assoni solo poche ore dopo la placcatura, e gli assoni allungato con molto ridotto ramificazione (Figura 2). Questi risultati indicano che la re-placcati neuroni condividono proprietà simili a quelle dei neuroni condizionamento lesionati. Utilizzando questo approccio, abbiamo recentemente eseguito in perditadi funzione studi per esaminare il ruolo della trascrizione fattore di rigenerazione assonale associato c-Jun in crescita assonale, adulti neuroni DRG in vitro. I risultati hanno mostrato che elettroporazione di un gruppo di 4 siRNAs diversi destinati differenti regioni di c-Jun (ON-TARGETplus) marcatamente ridotto i livelli di proteina di c-Jun in adulti neuroni DRG 3 giorni dopo la trasfezione (figura 3) 9. Quando i neuroni sono stati ri-plated e colta durante la notte, la crescita assonale, c-Jun atterramento neuroni è risultata significativamente ridotta (Control: 348,37 ± 16,21 millimetri; SI-c-Jun: 262,32 ± 15,69 micron, Figura 3) 9. Questi risultati indicano che le colture di neuroni DRG adulti fornire un sistema utile modello per studiare crescita assonale neuroni adulti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> Figura 1. Adulti neuroni di topo coltivati ​​DRG a bassa densità per 3 giorni. I neuroni sono stati colorati con anti - &amp; beta; anticorpi tubulina III. Si noti che la maggior parte degli assoni mostrano morfologie ramificati. Scale bar: 125 micron. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> Figura 2. Re-plating topo adulto DRG neuroni dopo 3 giorni di coltura. (A) neuroni DRG adulti coltivati ​​ad alta densità per 3 giorni. (B) Re-plated neuroni DRG adulti sono stati coltivati ​​a bassa densità per il pernottamento. Si noti che la maggior parte degli assoni mostrano morfologie allungate con poca ramificazione degli assoni. Scale bar: 250 micron in A e 125 micron di B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> Figura 3. Ruolo di c-Jun in crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti in vitro. (A) Western blot di c-Jun in topo adulto DRG neuroni dopo l&#39;elettroporazione di c-Jun siRNA. Il risultato mostra il livello notevolmente ridotto di c-giu. (B) neuroni di controllo trasfettate con EGFP sono cresciuti lunghi assoni dopo la ri-plating e cultura durante la notte. (C) Co-transperfezione di c-Jun siRNAs EGFP e la crescita degli assoni compromessa da adulti neuroni DRG dopo la ri-plating e cultura durante la notte. Rosso: Tuj-1 colorazione; Green: EGFP. Scale bar: 125 micron. Questi risultati sono stati pubblicati in Saijilafu et al. 9.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Adulti neuroni DRG rigenerare i loro assoni robusta dopo lesioni dei nervi periferici in vivo e in vitro, fornendo così un sistema utile per studiare la rigenerazione degli assoni negli animali adulti. Coltura in vitro di neuroni DRG adulti sta diventando un metodo ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari attraverso i quali la rigenerazione degli assoni è regolamentata. La procedura in vitro di neuroni adulti, la coltura del mouse DRG qui presentato consente una ra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poly-D-lisina bromidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2-desossiuridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Collagenasi A </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> Triplo espresso </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Vetrini coprioggetto (# 1) </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 e piastra di coltura cellulare </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Sterile, acqua distillata e deionizzata </td><td> Mediatech </td><td> 25-055-CV </td></tr><tr><td> Kit Nucleofector ed elettroporazione per i neuroni del mouse </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ON-TARGETplus siRNA contro c-Jun </td><td> Dharmacon </td><td> L-043.776 </td></tr><tr><td> Anticorpo anti - tubulina βIII (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> Prolungare Antifade soluzione oro di montaggio </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

È noto che i neuroni maturi nel sistema nervoso centrale (CNS) non può rigenerare loro assoni dopo lesioni per diminuita capacità intrinseca di supportare la crescita assonale e un ambiente ostile in 1,2 maturo CNS. Al contrario, i neuroni maturi nel sistema nervoso periferico (PNS) rigenerare facilmente dopo lesioni 3. Adulti dei gangli della radice dorsale (DRG) i neuroni sono ben noti per rigenerare robusto dopo lesioni dei nervi periferici. Ogni neurone DRG cresce uno assone dal soma cellulare, che si dirama in due rami assonali: un ramo periferico innerva bersagli periferici e un ramo centrale che si estende nel midollo spinale. Lesioni dei DRG risultati assoni periferici nella rigenerazione degli assoni sostanziale, mentre gli assoni centrali nel midollo spinale rigenerare poco dopo la lesione. Tuttavia, se la lesione assonale periferico si verifica prima della lesione del midollo spinale (un processo chiamato la lesione condizionamento), rigenerazione di assoni centrali è greatly migliorata 4. Inoltre, gli assoni dei neuroni centrali DRG condividono lo stesso ambiente ostile come discendente assoni corticospinali nel midollo spinale. Insieme, si ipotizza che i meccanismi molecolari che controllano la rigenerazione degli assoni dei neuroni DRG adulti può essere sfruttata per migliorare la rigenerazione degli assoni del SNC. Come risultato, i neuroni DRG adulti vengono ora ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la crescita assonale rigenerativa 5-7. Qui si descrive un metodo di coltura adulto DRG neurone che possono essere utilizzati per lo studio della rigenerazione assonale genetica in vitro. In questo modello i neuroni DRG adulti sono geneticamente manipolati tramite elettroporazione trasfezione mediata gene 6,8. Trasfettando neuroni con DNA plasmidico o SI / shRNA, questo approccio permette sia di guadagni e perdite di funzione esperimenti per studiare il ruolo di ogni gene d&#39;interesse in crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti. Quando i neuroni sono trasfettate con SI / shRNA, la proteina endogena è miratadi solito dopo 3-4 giorni impoverito nella cultura, durante i quali il tempo robusta crescita degli assoni è già verificato, rendendo la perdita di funzione studi meno efficace. Per risolvere questo problema, il metodo qui descritto comprende una risospensione e ri-placcatura passo dopo trasfezione, che permette di assoni ricrescere dai neuroni in assenza della proteina mirata. Infine, forniamo un esempio di utilizzo di questo modello in vitro per studiare il ruolo di un gene associato rigenerazione degli assoni, c-Jun, a mediare la crescita degli assoni dei neuroni DRG da adulto 9.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per lo studio genetico della rigenerazione assonale adulte di topo in coltura con neuroni dei gangli della radice dorsale è descritto. Il metodo comprende una fase re-suspension/re-plating per consentire assoni ricrescita di neuroni sottoposti manipolazione genetica. Questo approccio è particolarmente utile per la perdita di funzione studi di rigenerazione degli assoni usando RNAi-based knockdown proteine.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

genetic-study-axon-regeneration-with-cultured-adult-dorsal-root

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26.4K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Un In vitro Modello per lo studio genetico della rigenerazione assonale adulte di topo in coltura con neuroni dei gangli della radice dorsale è descritto. Il metodo comprende una fase re-suspension/re-plating per consentire assoni ricrescita di neuroni sottoposti manipolazione genetica. Questo approccio è particolarmente utile per la perdita di funzione studi di rigenerazione degli assoni usando RNAi-based knockdown proteine.

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

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Neuroscienze

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomia per accesso del ganglio di radice dorsale lombare e l'iniezione nei suini

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Uso di neuroni ippocampali coltivati primari per studiare l'assemblaggio dei segmenti iniziali di Axon

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...