This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.

NOTA: Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità con gli animali del Regno Unito (procedure scientifiche) Act, 1986. 1. set-up sperimentale <ol><li> Prima di iniziare a tessuti e delle cellule di raccolta, controllare che tutti gli strumenti sono sterili. Se necessario, sterilizzare in autoclave un paio di forbici chirurgiche Sharp, molto fine pinza e una pinza sottile standard. Sterilizzare anche ogni substrato prima semina cella utilizzando la sterilizzazione UV, l&#39;esposizione etanolo o la sterilizzazione a vapore a seconda dei casi. </li><li> Preparazione di terreni per la raccolta delle cellule staminali e la differenziazione <ol><li> Preparare il terreno di coltura di cellule staminali, contenente terreno minimo essenziale (α-MEM) addizionato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 200 mm L-glutammina, e l&#39;1% di penicillina-streptomicina (PS). </li><li> Preparare una soluzione madre di 10 mm in forskolin sciogliendo 10 mg di forskolina in 2.436 ml di sterile dimetil sulfoxyde. Utilizzare a concentrazione finale di 14 micron. &lt;/ Li&gt; <li> Preparare una / soluzione madre ml 35 mg di acido retinoico sciogliendo 50 mg in 1,43 ml di sterile dimetil sulfoxyde. Utilizzare a concentrazione finale di 350 ng / ml. </li><li> Preparare il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) scorte (100 mg / ml) sciogliendo 10 mg di polvere liofilizzata in 100 ml di acqua distillata sterile. Utilizzare a una concentrazione finale di 5 ng / ml. </li><li> Preparare base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) scorte (100 mg / ml) sciogliendo 50 mg di polvere liofilizzata in 500 ml di acqua distillata sterile. Utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng / ml. </li><li> Preparare il mezzo di differenziazione delle cellule staminali, contenenti mezzo di crescita delle cellule staminali integrato con 14 micron forskolin, 126 ng / ml di crescita gliale fattore-2 (GGF-2), 5 ng / mL di derivazione piastrinica fattore di crescita (PDGF), e 10 ng / ml di base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). </li></ol></li><li> Preparazione dei media e soluzioni madre per la raccolta neurone e dissociazione <ol><li> Preparare BottenstEin e di Sato (BS) medio 28, con l&#39;aggiunta di 1% PS e l&#39;1% supplemento N2 medio F12 di Ham. Calcolare il volume finale necessario come 500 microlitri per bene (se si utilizza un 24-pozzetti). </li><li> Preparare scorte collagenasi IV in mezzo F12 di Ham alla concentrazione di 1,25% in peso / v. Filtro-sterilizzare la soluzione e conservare a -20 ° C in 200 microlitri aliquote. </li><li> Preparare bovina scorte tripsina pancreatiche in mezzo F12 di Ham alla concentrazione di 2,5% in peso / v, filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in 200 microlitri aliquote. </li><li> Preparare il fattore di crescita nervoso (NGF) soluzione madre alla concentrazione di 5 mg / ml in un filtro sterilizzata 1 mg / ml soluzione grassi liberi-acido di siero albumina bovina (BSA) in mezzo F12 e conservare a -20 C come 200 microlitri aliquote. Non filtrata del NGF dopo la ricostituzione. </li></ol></li><li> Nel caso in cui nessuna modifica della superficie è stata eseguita, vetrini cappotto / piastre con poli-D-lisina (0,1 mg / ml per 15 minuti a temperatura ambiente) E / o laminina (2-10 mg / cm 2 per 2 ore a 37 ° C) per supportare attaccamento neurone e crescita dei neuriti come appropriato. </li><li> Sempre scaldare media in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC) Harvest e differenziazione in un fenotipo SC <ol><li> ASC raccolta dal grasso viscerale e inguinale dell&#39;adulto maschio ratti Sprague-Dawley <ol><li> Prima di iniziare, preparare una provetta con 10-15 ml di Hanks &#39;Balanced soluzione salina (HBSS) supplementato con 1% v / v della soluzione di PS e conservare in ghiaccio fino grasso raccolta. </li><li> Terminare il ratto per dislocazione cervicale e decapitazione. Shave ratto ed effettuare una incisione attraverso la pelle addominale, esponendo gli organi interni ed evitando sanguinamento. Rimuovere il grasso viscerale che racchiude lo stomaco e l&#39;intestino (solitamente caratterizzato da una consistenza grassa gialla) e il grasso inguinale che circonda i testicoli di un maschio adulto Sprague-Dawley di ratto. Trasferimento the grassi nel tubo contenente HBSS su ghiaccio. </li><li> In un armadio di sicurezza biologica (classe II) tritare finemente il grasso con un paio di forbici e una lama di rasoio sterile fino a consistenza bene raggiungimento e trasferirlo in una provetta contenente 15 ml di 0,2% preparata peso / v soluzione di tipo I e collagenasi sterilizzata per filtrazione il giorno. </li><li> Trasferire la provetta in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C e lasciare il tessuto adiposo di digerire in presenza dell&#39;enzima per 30 min-1 hr sotto agitazione continua. Monitorare attentamente la digestione e fermare prima che il tessuto è completamente dissociato, questo migliorerà la vitalità delle cellule e la resa delle cellule. Tessuto Filter Theun-dissociato attraverso un colino cella 100 micron. NOTA: Una buona digestione del tessuto comporta consistenza omogenea del grasso, visibile a occhio quando agitando delicatamente il tubo, acquisendo un aspetto beige. </li><li> Neutralizzare l&#39;enzima aggiungendo 15 ml di terreno di coltura di cellule staminali contenenti siero fetale bovino a 37 ° C e centrifugaresoluzione a 160 g per 10 minuti per raccogliere la frazione stromale vascolare, comprese le cellule staminali, sul fondo della provetta. </li><li> In questa fase, il pellet può essere risospeso in 1 ml di globuli rossi Lysis Buffer per eliminare la contaminazione globuli. Dopo la risospensione e pipettaggio per 1 minuto, aggiungere 10 ml di fresco mezzo di crescita delle cellule staminali e centrifugare a 160 g per 10 min. </li><li> Attenzione aspirare il surnatante dal tubo, curando il pellet cellulare depositato sul fondo. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di coltura di cellule staminali, trasferirli in 75 cm 2 palloni e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Mantenere le cellule a livello sub-confluenti fino passaggio 1-2, cambiando media ogni 3 giorni. </li></ol></li><li> ASC differenziazione di un fenotipo SC <ol><li> Al passaggio 1-2, rimuovere il mezzo di crescita delle cellule staminali dal pallone 75 centimetri 2 e sostituirlo con 10 ml di mezzo fresco contenente 1 mM β-mercaptoetanolo appena preparosso e sterilizzata per filtrazione il giorno. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. In questa fase, è importante che le cellule sono seminate a bassa densità (30%) prima di iniziare la differenziazione. </li><li> Lavare le cellule accuratamente con HBSS, aspirare e sostituirlo con 10 ml di mezzo contenente 350 ng / ml acido retinoico. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 72 ore. Cercare di ridurre al minimo l&#39;esposizione di medio cellule alla luce. </li><li> Dopo 3 giorni, lavare le cellule accuratamente con HBSS, aspirare e sostituirlo con 10 ml di staminali medio differenziazione cellulare (vedi punto 1.2.6). Mantenere le cellule a livelli sub-confluenti, cambiando media ogni 3 giorni. NOTA: Dopo 2 settimane di incubazione, ASC sono differenziati in SC-come ASC, esprimendo la loro caratteristica fenotipo (come dimostrato da Kingham et al. 5). Essi possono essere utilizzati fino al 10 ° passaggio, senza cambiamenti notevoli nel comportamento 29. </li></ol></li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Raccolta e dissociazione dei gangli spinali (DRG) Neuroni <ol><li> Terminare il ratto per dislocazione cervicale e decapitazione. Shave ratto e sollevare la pelle per esporre la colonna vertebrale. Utilizzando forbici affilate, durare più dell &#39;la colonna vertebrale prendendo cura supplementare degli organi ristretti e vasi sanguigni. Trasferire la colonna vertebrale in un armadio di sicurezza biologica (classe II) con una capsula di Petri e rimuovere qualsiasi parte dorsale. </li><li> Dividere la colonna vertebrale a metà lungo l&#39;asse longitudinale usando forbici chirurgiche sterili e taglienti per esporre il midollo. A questo punto, è utile tagliare la colonna vertebrale in due segmenti più piccoli di sotto del livello della gabbia toracica, per rendere più facile maneggiare durante la raccolta DRG neurone. Utilizzando una pinza sottile, rimuovere delicatamente tutto il tessuto del midollo, facendo attenzione a non tirare e rimuovere le radici DRG. In questo modo il DRG e radici saranno esposti nei canali vertebrali, ancora racchiuso nella colonna. Osservare DRG come bianco filamenti Coming direttamente dai canali. </li><li> Estrarre l&#39;intera radice DRG (non solo il DRG) dai canali vertebrali utilizzando una pinza molto fini, andando in profondità nei canali vertebrali e facendo attenzione a non danneggiare le radici dei gangli. Trasferire il DRG in una piccola capsula di Petri (60 mm 2) contenente 3-4 ml di mezzo di F12 di Ham integrato con 1% PS. Se si utilizza diversi animali, usare piatti separati. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, pulire il DRG di ogni eccesso di radici nervose che circondano i gangli con pinza sterile e un bisturi per ridurre la contaminazione delle cellule gliali. Trasferire il DRG in una piccola capsula di Petri (35 mm 2) con 1,8 ml di mezzo F12 fresco. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di peso / v tipo collagenasi IV magazzino 1,25% (concentrazione finale di 0,125%) e incubare il DRG a 37 ° C, 5% CO 2 per 1 ora. Aspirare accuratamente il terreno con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non aspirare o danneggiare il DRG. Aggiungere mezzo F12 fresco elasticamented con 0,125% peso / v collagenasi di tipo IV enzima e incubare per 1 ora come descritto precedentemente. </li><li> Aspirare il medio e lavare delicatamente la DRG con il mezzo F12. Aggiungere quindi 1,8 ml di mezzo F12 e 200 ml di tripsina (concentrazione finale di 0,25% in peso / v) e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 30 min. </li><li> Rimuovere tripsina e aggiungere 1 ml di terreno F12 integrate con 500 ml di FBS di arrestare la reazione enzimatica. Aspirare il mezzo e lavare delicatamente DRG con mezzo F12 per tre volte per rimuovere tracce di siero. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno fresco F12 e trasferire accuratamente DRG con il terreno in una provetta da 15 ml usando una pipetta di vetro. Dissociarsi delicatamente i neuroni DRG pipettando su e giù (circa 8-10 volte) con la pipetta di vetro (punte di plastica possono essere utilizzati come alternativa). </li><li> Lasciare il pellet di stabilirsi nella parte inferiore del tubo e raccogliere il mezzo in una nuova provetta. Aggiungere 2 ml di terreno fresco F12 per il tubo contenente il pellet e ripetere la mdissociazione eccanico con la pipetta di vetro. Ripetere questa operazione fino a quando la sospensione diventa omogenei (circa 3-4 volte) e raccogliere tutte le DRG dissociato nel nuovo tubo. Questo metodo riduce la sollecitazione derivante dalla dissociazione meccanica e migliora la vitalità dei neuroni. </li><li> Filtrare la sospensione omogeneizzata risultante in un nuovo tubo da 15 ml con un colino micron cella 100 per rimuovere i neuroni non-dissociati e altri detriti. A questo punto, potrebbe essere conveniente per filtrare prima sospensione cellulare in una provetta da 50 ml e poi trasferire la soluzione nel tubo più piccolo utilizzando una pipetta di vetro. Centrifugare la sospensione a 110 g per 5 min. </li><li> Preparare un siero albumina bovina 15% (BSA) aggiungendo 500 ml di una soluzione di BSA 30% a 500 ml di mezzo F12. Lentamente pipettare la soluzione lungo la parete di un tubo 15 ml per creare un percorso proteine ​​graduale. In questa fase, è utile per tenere il tubo ad un angolo di 45 ° e rilasciare lentamente la BSA utilizzando i numeriil tubo falcon come riferimento per la &quot;pista&quot; formatura. </li><li> Aspirare il supernatante dal punto 3.10 lasciare 500 microlitri sul fondo della provetta e risospendere il pellet cellulare nello stesso mezzo. Lentamente pipettare la sospensione lungo il sentiero di proteine ​​precedentemente preparato nel passo 3.11 (usare i numeri sul tubo come riferimento) e centrifugare a 500 g per 5 min. </li><li> Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno BS modificato (o supporto misto per la ASC / DRG co-coltura SC-like, come descritto di seguito nel passo 4.5. NOTA: Il volume per risospendere le neuroni DRG può essere effettuata a volume effettivo richiesto, a seconda della concentrazione cellulare finale desiderata e il numero di campioni da seminato. Un animale fornirà abbastanza cellule per un esperimento di 24-pozzetti. </li><li> Incubare i campioni seminati a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 ore per permettere l&#39;adesione delle cellule e infine aggiungere mezzo BS fresco supplementato con 50 ng / ml di crescita nervoso factor (NGF). </li></ol> 4. Diretta Co-cultura della SC-come ASC e DRG neuroni <ol><li> Mantenere SC-come ASC in cultura a livello sub-confluenti come descritto al punto 2.2.3. Ventiquattro ore prima della raccolta DRG, aspirare il terreno differenziazione delle cellule staminali e lavare le cellule con HBSS. Aspirare e incubare in 3 ml di tripsina a 37 ° C, 5% CO 2 per 3 min. </li><li> Controllare al microscopio luce che tutte le cellule sono staccato dal pallone. Battere delicatamente il pallone per aiutare il distacco. Aggiungere 7 ml di mezzo per arrestare la reazione tripsina, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 110 g per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno differenziazione delle cellule staminali. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare in base alla concentrazione finale desiderata. Idealmente, seminando 20.000 SC-like ASC / cm 2 garantirebbe uno strato confluente di cellule. </li><li> Seed il SC-likeASC sul substrato e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore per permettere l&#39;adesione delle cellule. </li><li> Dopo 24 ore di incubazione, aspirare il terreno e aggiungere i neuroni DRG sopra le cellule come descritto al punto 3.14 e 3.15. Cambiare medio e un mezzo mista contenente il 50% di cellule staminali terreno di differenziamento e il 50% di BS medie. Inoltre, riducendo la concentrazione di FBS al 1-2,5% nel terreno misto finale contribuisce ad evitare la proliferazione delle cellule satelliti contaminanti derivanti dalla dissociazione DRG. </li><li> Incubare i campioni co-coltivate a 37 ° C, 5% CO 2 e mantenere in coltura per il tempo necessario per le prove future. </li></ol>

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J., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+regeneration+of+peripheral+nerves+through+bioengineered+nerve+grafts.">Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts.</a> Neuroscience. 181, 278-291 (2011).</li><li>Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+decellularized+allogeneic+artery+conduits+with+autologous+transdifferentiated+adipose-derived+stem+cells+for+facial+nerve+regeneration+in+rats.">Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).</li><li>Zhang, Y., Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nerve+graft+constructed+with+xenogeneic+acellular+nerve+matrix+and+autologous+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).</li><li>Gomillion, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-aligned+Schwann+cell+monolayers+demonstrate+an+inherent+ability+to+direct+neurite+outgrowth.">Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth.</a> J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).</li><li>Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalization+of+polycaprolactone+films+via+surface-initiated+atom+transfer+radical+polymerization+for+covalently+coupling+cell-adhesive+biomolecules.">Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules.</a> Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).</li><li>Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+molecules+mediate+both+Schwann+cell+proliferation+and+activation+to+enhance+neurite+outgrowth.">ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth.</a> Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).</li></ol>

The authors confirm that there are no conflicts of interest associated with this publication.

Neuroni DRG sono spesso utilizzati tra le cellule neuronali per la cultura primaria per studiare la rigenerazione dei neuroni dopo assotomia in vivo. Qui un protocollo preciso per DRG raccolto da ratti adulti è presentato, al fine di ridurre la popolazione di cellule satelliti nell&#39;ambiente circostante senza compromettere la sopravvivenza neuronale. Come ASC differenziato in un fenotipo SC-like sono una valida alternativa a SC per terapie cellulari, un ASC / DRG sistema di co-coltura SC-simile è anche descritto in dettaglio. È ampiamente noto che laminina (o sequenze peptidiche laminina-derivato) hanno un effetto benefico sulla sopravvivenza dei neuroni e la formazione dei neuriti 31 - 33. Quando si esegue colture di neuroni DRG si consiglia pertanto precedentemente cappotto ciascun substrato con laminina per evitare la perdita di funzionalità delle cellule neuronali. Il concetto di rivestimenti laminina applica anche ai substrati biomateriale per la progettazione dicostrutti di ingegneria tissutale, ad esempio poli - caprolattone (PCL) frequentemente utilizzate per la fabbricazione di condotti 30 nervose. Inoltre, lavoro precedente ha dimostrato che le matrici di fibrina sono materiali adatti per colture neuronali in tre dimensioni 11. Oltre al rivestimento proteico, modelli co-coltura preziose forniscono condizioni di sopravvivenza DRG neurone e un ambiente adatto per studiare le interazioni che avvengono tra neuroni e SC nel sistema nervoso periferico seguenti lesioni. Le cellule possono essere trapiantate in vivo mediante dispositivi neurali per abbreviare il tempo di reclutamento di cellule autologhe al sito della lesione. Ciò è particolarmente importante in lesioni gravi, che può portare alla senescenza cellulare / morti e atrofia muscolare. Sebbene SC sono le più importanti cellule gliali coinvolti nel processo di rigenerazione del nervo periferico e mielinizzazione, la loro disponibilità limitata e il loro tasso di proliferazione lenta li rende inadattiper applicazioni di ingegneria tissutale 34. ASC è una valida alternativa a causa della loro abbondanza e la capacità di differenziarsi in fenotipo SC, esprimendo specifici marcatori gliali e mostrando analogie funzionali nativo SC 19. ASC è inoltre in grado di produrre proteine ​​e fattori di crescita 5 punti che può essere utile per la formazione e l&#39;estensione dei neuriti da neuroni DRG in un sistema di co-coltura. Tuttavia, due sistemi diversi co-coltura possono essere impostati in funzione delle esigenze sperimentali. Il metodo proposto in questo documento è una versione modificata di un protocollo consolidata nel nostro laboratorio 11 e comporta un contatto diretto tra i due tipi di cellule (co-coltura diretta), in cui il secondo tipo di cellule (neuroni DRG) vengono seminate sulla parte superiore degli altri (SC-like ASC). Questo approccio si basa su risultati precedenti che hanno dimostrato l&#39;importanza della presenza di uno strato di cellule gliali sul substrato quando semina colture neuronali 35 <sup&gt; - 37. Questo effetto è probabilmente dovuto alle interazioni cellula-cellula, attraverso integrine DRG e molecole ECM depositati da ASC e altri spunti sulla superficie delle cellule staminali. È stato inoltre osservato che una riduzione di siero proteine ​​nel medio ridotto la proliferazione delle cellule satelliti contaminanti che possono derivare dalla dissociazione di neuroni DRG, senza influenzare le funzioni ASC. Tuttavia, cellule satelliti, tra cui una piccola frazione di SC, sono difficili da eliminare completamente da colture di neuroni DRG e poche cellule rimanenti sarà anche presente nel sistema di co-coltura. È quindi importante notare che questi piccoli sub-popolazioni possono anche partecipare ai processi mielinizzazione durante studi in vitro, ricordando le cellule autologhe che sono presenti in vivo dopo la lesione. Il secondo approccio (non presentata qui) prevede l&#39;utilizzo di inserti di coltura cellulare, evitando un contatto diretto tra i due diversi tipi di cellule (co-coltura indiretta). Carner, non è rappresentativa delle condizioni in vivo durante la rigenerazione del nervo (ridotta capacità delle cellule neuronali sviluppare lunghe neuriti), ma è utilizzato per studiare l&#39;effetto di fattori diffusibili rilasciati nel mezzo di una certa popolazione cellulare sull&#39;altro 38 .

Lesioni dei nervi periferici sono comuni con circa 9.000 casi nel Regno Unito che si verificano ogni anno in un prevalentemente giovane e la popolazione 1 lavorare. Nonostante microchirurgiche tecniche di riparazione dei nervi, il normale ripristino della funzione è irraggiungibile con conseguente sensazione di compromissione mano, funzione motoria ridotta e frequente dolore e intolleranza al freddo 2. Tali lesioni hanno un impatto profondo e permanente sul paziente e la loro capacità di svolgere le attività della vita quotidiana, con meno del 60% di tornare al lavoro 3. Dopo lesioni, il fenotipo e la morfologia dei neuroni e cellule di Schwann (SC) cambiamento al fine di creare un ambiente adatto per consentire l&#39;assone germinazione. In caso di resezione, il nervo è diviso in prossimali e distali ceppi; il moncone prossimale è il punto da cui il processo di rigenerazione ha luogo, mentre il moncone distale subisce walleriana degenerazione dopo di che il distacco SCdagli assoni danneggiati, de-differenziare e proliferare. Questo è fondamentale per la rimozione di detriti mielina e preparare il moncone distale del nervo per ri-generazione 4,5. Axon germinazione è supportata dalla produzione di fattori neurotrofici e chemochine rilasciati dal SC al moncone distale, e guidata dalla lamina basale lasciati seguente degenerazione walleriana 6,7. SC allineare lungo l&#39;assone rigenerare formando bande di Büngner, che aiuti la crescita degli assoni verso l&#39;organo bersaglio, riducendo ramificazione all&#39;esterno del tubo endoneurali. Dopo reinnervation, SC formare il nuovo guaina mielinica avvolgendo gli assoni rigenerati, ma funzioni sensoriali e motorie è solo parzialmente ripristinato 8. Gangli spinali (DRG) sono strutture situate nel fori intervertebrali della colonna vertebrale, che contengono le cellule neuronali sensoriali che innervano organi periferici. Quando dissociato, possono essere utilizzati come adatto in vitro model per lo studio della rigenerazione nervosa 9 - 11, comprese le indagini di formazione della mielina. In particolare, i neuroni DRG adulto imitano le caratteristiche in vivo di queste cellule e forniscono un formidabile strumento per studiare nuove strategie per la riparazione dei nervi periferici in ingegneria dei tessuti. Co-colture rappresentano un sistema dinamico che simula in vitro l&#39;interazione di due (o più) tipi di cellule in un particolare ambiente in vivo. Uno dei vantaggi di questi modelli cellule co-coltura è la flessibilità e controllo che può essere esercitata sulla ambiente extracellulare. Neuroni DRG sono stati utilizzati di frequente nei sistemi di co-coltura con SC di imitare le interazioni reali che si verificano tra i due tipi di cellule del sistema nervoso periferico 10,12 - 14. È stato dimostrato che secernono SC matrice extracellulare (ECM) proteine ​​e fattori di crescita che possono notevolmente migliorare lacapacità dei neuroni DRG di sopravvivere e germogliare neuriti 15,16. Tuttavia, SC richiedono lunghi periodi di tempo a proliferare e, nonostante i progressi nella tecnica di coltura cellulare, è ancora difficile generare un adeguato numero di cellule per applicazioni di ingegneria tissutale. Inoltre, il sacrificio di un nervo sano è reso necessario per raccogliere SC autologo. Pertanto, la differenza in sourcing SC è importante sia per ingegneria tissutale e in vitro di rigenerazione nervosa. In questa vista, ASC può essere considerato una valida alternativa per lo sviluppo di un costrutto tissutale da utilizzare per la riparazione dei nervi periferici 17,18. Impieghi precedenti dimostrato la capacità di queste cellule di differenziarsi in SC-like ASC, esprimendo caratteristici gliali marcatori, come S-100, p75 e proteina gliale fibrillare acida (GFAP) 19, così come la proteina mielina zero (P0) 20 . La secrezione di fattori di crescita gliali, come il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), fattore di crescita nervoso (NGF) e gliale cellule fattore neurotrofico derivato (GDNF) è stata osservata anche 21,22. Pertanto, SC-like ASC può essere utilizzato come promotore di rigenerazione del nervo periferico, come dimostrato sia in vitro che in vivo studi 23-26. Inoltre, ASC può essere raccolto mediante procedure minimamente invasive in maggior numero rispetto ad altri tipi di cellule staminali; la frequenza di cellule staminali nel tessuto adiposo è 100- a 1.000 volte superiore a quello del midollo osseo 27, e hanno un tasso di proliferazione più elevata rispetto alle cellule staminali mesenchimali SC e del midollo osseo. Questo lavoro si propone di fornire un protocollo dettagliato per eseguire rispettivamente alti raccolti efficienti di neuroni DRG dissociate e ASC, quest&#39;ultima differenziate in cellule SC-like. Il co-coltura di questi due tipi cellulari fornirà pertanto un sistema molto pratico che può essere usato per futuri studi sulla capacità di DRG neurons germogliare neuriti e ai meccanismi di formazione della mielina sull&#39;impalcatura diverso per l&#39;ingegneria tessuto nervoso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">100 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:116px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;">70 &#956;m strainers (ref. 352350) can be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">15 mL plastic tubes</td>
			<td style="width:116px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">50 mL plastic tubes</td>
			<td style="width:116px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.547.004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">75 cm2 flasks</td>
			<td style="width:116px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">BC301</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Retinoic Acid &#62;98% HPLC</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">ARA-C supplement</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6645</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic (154 aa)</td>
			<td style="width:116px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9205</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Collagenase type I</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17100-017</td>
			<td style="width:167px;">Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:216px;">Collagenase type IV</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">Worthington Biochemical</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">LS004188</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:119px;">FB-1001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Forskolin&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3917</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB50253</td>
			<td style="width:167px;">Sharp material to be disposed accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="253">
			<td height="253" style="height:253px;width:216px;">Glial Growth Factor-2 (GGF-2)</td>
			<td style="width:116px;">Acorda Therapeutics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-&#946;1 (R &#38; D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nutrient Mix F12 HAM</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6658</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9394</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">N-2 supplement (100x)</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands&#160; (NGF)</td>
			<td style="width:116px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">NC011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:116px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Recombinant Human PDGF-AA</td>
			<td style="width:116px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-13A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">Trypsin&#160;</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin (2x bovine pancreatic)</td>
			<td style="width:116px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003703</td>
			<td style="width:167px;">This is used for DRG dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td style="width:167px;">Warm at 37 &#176;C in a water bath unless specified</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td style="width:167px;">Prepare the solution in the biological cabinet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Le colture di neuroni DRG dissociate rappresentano un opportuno modello in vitro per lo studio della rigenerazione nervosa. Tuttavia, i substrati non trattati non forniscono un ambiente adatto per l&#39;attacco DRG e l&#39;estensione dei neuriti. SC-like ASC sono in grado di produrre fattori di crescita e chemochine 19 che possono migliorare la capacità dei neuroni DRG a germogliare neuriti quando vengono rilasciati nel mezzo di coltura. La presenza di SC-come ASC nel sistema di coltura può quindi svolgere un ruolo importante nella regolazione delle funzioni DRG. Questo protocollo (figura 1) illustra la procedura per effettuare una co-coltura diretta di ASC e DRG neuroni SC-simili, durante il quale le cellule neuronali venissero a contatto diretto con precedentemente seminata ASC SC-like. La difficoltà principale associata con questa procedura è l&#39;alta variabilità del numero di neuroni DRG raccolte da animali differenti. Per questo motivo, i risultati possono essere a volte difficile Compare ed una particolare attenzione deve essere prestata durante la procedura di semina in modo da ottenere sempre una densità cellulare paragonabile in ogni esperimento. Il protocollo è stato ottimizzato per ridurre almeno il numero di cellule satelliti rimanenti dalla dissociazione DRG neurone utilizzando il gradiente BSA (passo 3.11). Inoltre, citosina-arabinosio (ARA-C) integratore può essere aggiunto al mezzo di BS al fine di minimizzare ulteriormente la popolazione cellulare satellitare, come descritto da Kingham et al. 11. Tuttavia, la scelta del tempo di trattamento deve essere attentamente conciliate con il DRG e SC-like ASC vitalità, anche influenzata dalla presenza di integratore ARA-C nel mezzo di coltura. Pertanto, è molto difficile da realizzare un sistema privo di cellule satelliti. La Figura 2 mostra l&#39;importanza di SC-like ASC per DRG neurite germinazione in un modello di co-coltura con poly greggia e chimicamente modificati - caprolattone (PCL) pellicole come substrati. Neuroni DRG erano maintained in coltura per 3 giorni in presenza o assenza di SC-like ASC, utilizzando una soluzione mista contenente il 50% di BS medio e il 50% delle cellule staminali terreno di differenziamento, come descritto al punto 4.5. Dopo questo periodo, le cellule sono state fissate in 4% paraformaldeide e colorati con β-tubulina III (neuroni DRG) e S100 (SC-come ASC) per indagare la morfologia cellulare e di studiare la capacità dei neuroni DRG sporgere neuriti. Nessun neuriti sono stati osservati sulle superfici non trattate in assenza di SC-like ASC (Figura 2A), mentre la formazione di neuriti stato chiaramente migliorato nel sistema di co-coltura (Figura 2C). In media, il numero di neuriti al corpo cellulare significativamente aumentata da 0 a 3 in presenza di cellule staminali. La conferma di questi risultati è stato dato anche da microscopia elettronica a scansione (SEM) analisi, illustrata in figura 3. In particolare, le immagini SEM mostrano che la capacità dei neuroni DRG a germogliare neuriti avviene preferenzialmente in congiunzionecon SC-like ASC, come indicato dalle frecce gialle in Figura 3C. Occorre rilevare che l&#39;uso di substrati laminina-modificato (compresi peptidi laminina-derivato) nei sistemi di coltura contenenti neuroni DRG è stata spesso definita come una condizione adatta per la coltura delle cellule neuronali, avendo effetti notevoli sulla formazione dei neuriti e prolunga 30-32 . Tuttavia, i risultati mostrati nella Figura 2D e Figura 3D dimostra che la combinazione di segnali chimici e biologici può migliorare ulteriormente la risposta dei neuroni DRG. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig1highres.jpg" /> Figura 1. Preparazione del sistema ASC di co-coltura DRG-SC-come diretta. Neuroni DRG e ASC derivano rispettivamente dalla colonna vertebrale e il grasso viscerale e inguinale di mal adultiratti e Sprague-Dawley. Dopo la digestione del tessuto adiposo attraverso una cascata di reazioni enzimatiche, ASC sono differenziati in cellule SC-simili e mantenuto in condizioni sub-confluenti fino a quando necessario. SC-come ASC sono pre-seeded su ogni supporto 24 ore prima del raccolto DRG. Il giorno, neuroni DRG dissociate vengono estratti e attraverso una serie di azioni enzimatiche e meccaniche. I neuroni sono poi seminati sulla parte superiore della ASC SC-come in precedenza ad apporto e mantenute in coltura fino all&#39;analisi (tecnica mista: contenente il 50% di media differenziazione delle cellule staminali e il 50% delle medie BS modificato). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig2highres.jpg" /> Figura 2. immagini di fluorescenza di neuroni DRG in condizioni di coltura diverse.(A) film PCL non trattati; (B) film PCL RGD-modificati; (C) co-coltura con SC-come ASC sui film PCL non trattati; (D) co-coltura con SC-come ASC sui film PCL RGD modificati. Le cellule sono state mantenute in coltura per 3 giorni con una soluzione mista contenente il 50% di media BS modificato e il 50% di mezzo di differenziazione delle cellule staminali. Dopo questo periodo, le cellule sono state fissate in paraformaldeide 4%, permeabilizzate in una soluzione Triton-X, e non specifici siti di legame sono stati bloccati con 1% BSA. Le cellule neuronali sono state poi colorate contro β-tubulina III (CIC, verde) e ASC SC-like contro S-100 (AlexaFluor568; rosso) anticorpi. Infine nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Le immagini sono state acquisite usando un microscopio a fluorescenza (Olympus BX60, Giappone). (Re-stampa con il permesso di de Luca et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere un più ampio vers</a>ioni di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52543/52543fig3highres.jpg" /> Figura 3. immagini SEM di neuroni DRG in condizioni di coltura diverse (A) Pellicole PCL non trattati (B) film PCL RGD-modificati;. (C) co-coltura con ASC SC-come film PCL non trattati; (D) co-coltura con SC-come ASC sui film PCL RGD-modificato. Le frecce gialle indicano i punti di contatto tra SC-like ASC e DRG, confermando la loro interazione diretta nel sistema di co-coltura. Le cellule sono state mantenute in coltura per 3 giorni e fissati in glutaraldeide 2,5%. Dopo disidratazione in serie graduata di etanolo (50%, 70%, 90%, 100%), le cellule sono state infine risciacquati in esametildisilazano e asciugati prima del montaggio sul stub e oro sputtering per l&#39;analisi SEM. Le immagini sono state acquisite con un SEM (Zeiss EVO60, UK) con un vol accelerazionetage di 10kV. (Re-stampa con il permesso di de Luca et al. 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52543/52543fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Gangli spinali (DRG) sono strutture che contengono i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Quando dissociato, possono essere co-coltura con cellule staminali derivate da tessuto adiposo SC-like (ASC), che fornisce un modello valido per lo studio in vitro rigenerazione e mielinizzazione nervo, imitando l&#39;ambiente in vivo presso il sito di lesione.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

21.1K Views.  EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI.  Gangli spinali (DRG) sono strutture che contengono i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Quando dissociato, possono essere co-coltura con cellule staminali derivate da tessuto adiposo SC-like (ASC), che fornisce un modello valido per lo studio in vitro rigenerazione e mielinizzazione nervo, imitando l'ambiente in vivo presso il sito di lesione. 

Video: Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Ricerca

Neuroscienze

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Chirurgia del nervo facciale nel modello di ratto per studiare l'inibizione assonale e la rigenerazione

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Un modello scalabile per studiare gli effetti della lesione da forza smussata nel pesce zebra adulto

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

Colture organotipiche della corteccia umana adulta come modello ex vivo per il trapianto e la validazione di cellule staminali umane

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...