Name: a drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system
Uploaded: 2018-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System at JoVE.com

Ringraziamo Jessica Goldshteyn per il supporto tecnico. Lavoro in laboratorio canzone è finanziato dalla sovvenzione NIH R00NS088211 e intellettuale e disabilità dello sviluppo Research Center (IDDRC) nuovo programma Development Award.

1. preparazione delle piastre di coltura e delle bottiglie
<ol><li>Preparazione delle piastre di agar di succo d'uva<ol>
<li>Aggiungere 10 g di agar in polvere, succo di uva 200ml e 192 mL ddH2O in un becher e forno a microonde per circa 4-5 minuti, mescolando in modo discontinuo fino a quando l'agar è dissolto completamente.</li>
		<li>In una cappa, raffreddare la soluzione a circa 60 ° C. Aggiungere 4,2 mL di etanolo al 95% e 4,0 mL di acido acetico glaciale. Regolare il volume totale della soluzione da 400 mL con ddH2O. Mix bene.</li>
		<li>Per ogni piatto di 35 mm, aggiungere circa 2-3 mL di soluzione. Fare circa 120-150 tavole per un totale di 400 mL di soluzione di succo d'uva agar.</li>
		<li>Attendere 10 minuti per raffreddare le piastre e solidificare la soluzione di agar. Imballare il succo d'uva piastre di agar in sacchetti ziplock self-sigillato e conservare a 4 ° C per un uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione dei flaconi per coltura della drosofila<ol>
<li>Utilizzare una lama per perforare un foro triangolare del lunghezza laterale di 1,5 cm su una parete del flacone di coltura della drosofila e riempire il foro con una sfera del diametro di 2-2.5 cm di cotone per la ventilazione.</li>
		<li>Inserire la bottiglia con una piastra di agar di succo d'uva completata con circa 0,5 cm3 di pasta di lievito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. raccolta delle larve di Drosophila
<ol><li>Impostare la pagina di croci di mosche adulte<ol>
<li>Posto 10 femmine vergini e 5 maschio adulto vola insieme in un flacone di coltura collegato con una piastra di agar di succo d'uva.</li>
		<li>Mettere i fondi di bottiglia fino a 25° C, in modo che mosche deporranno le uova sulla piastra di agar di succo d'uva. Cambiare la piastra con la pasta di lievito almeno una volta al giorno. Per un periodo di raccolta 2-h, che consente la raccolta delle larve di una fase inerente allo sviluppo omogenea, iniziare con più di 20 Vergine femmine e 10 maschi al punto 2.1.1.</li>
		<li>Cultura la piastra a 25° C in una capsula Petri 60 mm con un panno umido, per esempio, imbevuta di soluzione di acido propionico del 0,5%. Disporre il tessuto in modo che non bloccare il flusso di ossigeno. Nota: La soluzione di acido propionico è utilizzata per mantenere l'umidità nel piatto ed evitare la crescita di muffe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccolta delle larve di un età specifici<ol>
<li>Utilizzare un paio di pinze per trasferire le larve della fase desiderata, ad esempio, 2nd a 3rd instar larve a 48-72 h dopo (AEL), la deposizione delle uova per una nuova piastra di agar di succo d'uva senza pasta di lievito.</li>
		<li>Rimuovere il lievito dalla pelle di larve consentendo loro di strisciare sul piatto di nuovo, per evitare che interferiscano potenziali di lievito con laser assotomia e imaging. In alternativa, pulire accuratamente le larve di lavarli in un piatto di PBS e asciugare brevemente su un pezzo di carta velina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. due-fotone ferita e Imaging confocale
<ol><li>Installazione di microscopio Nota: Un microscopio a due fotoni laser confocale del laser è stato usato per questo esperimento, ma altri sistemi con un setup di equivalente saranno anche sufficiente. Il laser del due-fotone (930 nm) è stato utilizzato per la consegna di lesioni e un laser ad Argon (488 nm) è stato usato per formazione immagine confocal di GFP.<ol>
<li>All'inizio di ogni sessione, accendere il laser del due-fotone e/o il laser(s) confocale e il microscopio. Aprire il software di imaging.</li>
		<li>Per la ferita del due-fotone, impostare i seguenti parametri per l'imaging di GFP con il laser del due-fotone a 930 nm (1.950 mW).<ol>
<li>Selezionare la modalità di scansione di linea. Aprire completamente il foro stenopeico. Aumentare l'intensità del laser al ~ 20% (390 mW).</li>
			<li>Selezionare 512 x 512 come l'esplorazione della struttura. Utilizzare la massima velocità di scansione (in genere con il tempo di permanenza di pixel a 0,77 µs). Assicurarsi che il numero medio è 1 e profondità di bit è di 8 bit.</li>
			<li>Guadagno a ~ 750 e l'offset a 0.</li>
			<li>Salva questo pre-set protocollo sperimentale come 2P GFP 930 ablazione, consentendo facile riutilizzare in futuro gli esperimenti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per formazione immagine confocal, impostare i seguenti parametri per l'imaging di GFP con il laser di Argon a 488 nm:<ol>
<li>Selezionare la scheda di acquisizione e quindi Z-stack.</li>
			<li>Sotto "Laser", attivare l'alimentazione per il laser di Argon 488 nm.</li>
			<li>Vai ai canali, selezionare il laser 488 mm e aumentare la potenza del laser per 5-10%. Per il foro stenopeico, utilizzare l'unità arioso di 1-2 (AU). Regolare il guadagno a 650.</li>
			<li>In Modalità di acquisizione, selezionare 1024 x 1024 come l'esplorazione della struttura, utilizzare la velocità di scansione massima, un numero medio di 2 e profondità di bit di 8 Bit.</li>
			<li>Salvare questo protocollo sperimentale pre-impostato come GFP Imaging.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia di larve con etere dietilico e montaggio<ol>
<li>In una cappa aspirante, posizionare un piatto di vetro 60 mm in una capsula di Petri di plastica di 15 cm. Piega e laici un pezzo di carta velina nella parte inferiore del piatto di vetro, quindi inserire una piastra di agar di succo d'uva sul tessuto. Aggiungere etere etilico nel piatto di vetro, al punto in cui la carta velina è intrisa e c'è uno strato di etere liquido rimanente nel piatto. Tenere il coperchio in ogni momento.</li>
		<li>Preparare un vetrino con una goccia di halocarbone 27 olio nel centro. Aggiungere 4 macchie di grasso per vuoto sui quattro angoli della diapositiva, per poi sostenere il vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Utilizzare pinze per raccogliere una larva pulita e posizionarlo sulla piastra di agar nel piatto di vetro di 60 mm. Coprire il piatto di vetro con il coperchio e attendere fino a quando la larva smette di muoversi. PNS ferita/imaging, per estrarre la larva appena la coda ferma spasmi muscolari. Per il sistema nervoso centrale, attendere fino a quando la larva intera diventa immobile, soprattutto i segmenti di testa. Nota: I tempi di esposizione di etere sono fondamentali. Vedere la discussione.</li>
		<li>Delicatamente prendere la larva anestetizzata e posizionarlo testa-montante nella goccia di olio halocarbone sulla diapositiva. Aggiungere un vetrino coprioggetto sopra la diapositiva. Utilizzare una leggera pressione per spingere il vetrino coprioggetto, fino a toccare la larva (Figura 1A).</li>
		<li>Regolare posizione di larva spingendo delicatamente il vetrino coprioggetti verso sinistra o verso destra per rotolare la larva, in modo che il neurone/assone/dendrite di interesse è sulla parte superiore e più vicina alla lente del microscopio.</li>
		<li>Per lesioni PNS, è possibile montare il lato dorsale della larva, in modo che entrambe le trachee sono visibili. Poi rotolare la larva ~ 30 gradi a sinistra per ferire classe III da neurone assoni (Figura 1B e 1C), 90 gradi per ferire gli di assoni di classe IV da neurone (Figura 1B e 1E) o ~ 30 gradi per ferire classe IV da neurone dendriti ( Figura 2A).</li>
		<li>Per lesione dello SNC, posizionare la larva per essere perfettamente ventrale verso l'alto (Figura 3A), in modo che la regione di interesse è più vicina alla lente del microscopio nel piano z.</li>
	</ol></li>
	<li>Ferita da due fotoni laser<ol>
<li>Porre il vetrino con la larva sotto il microscopio e fissarlo in posizione con il supporto per diapositive sul palco. Obiettivo di uso il 10 X (0,3 NA) per trovare la larva.</li>
		<li>Aggiungere 1 goccia di olio oggettiva il vetrino coprioggetto, passare al 40 X (1,3 NA) obiettivo e regolare la messa a fuoco.</li>
		<li>Passare alla modalità di scansione e riutilizzare il protocollo sperimentale 2P GFP 930 ablazione. Assicurarsi che il foro stenopeico è aperto tutta la strada. Nota: La configurazione deve essere ottimizzato basato sui singoli sistemi.</li>
		<li>Avviare la modalità Live per individuare l'area di interesse (ROI) e ottimizzare le impostazioni per ottenere immagini di buona qualità con lo zoom appropriato. Nota: Lo scopo di questo passaggio è quello di trovare il neurone/assone/dendrite di ferire, invece di prendere la migliore immagine di qualità. Di conseguenza, è possibile utilizzare le impostazioni minime sufficienti per visualizzare l'area di destinazione, al fine di evitare la sovraesposizione o photobleaching.</li>
		<li>Arrestare Live scansione, in modo che il pulsante Ritaglia diventerà disponibile. Lasciare che l'immagine ancora servire come la tabella di marcia. Selezionare la funzione di ritaglio e adattare la finestra di scansione a concentrarsi sul bersaglio per essere ferito.</li>
		<li>Ridurre il ROI per essere la dimensione del futuro sito della ferita. Ad esempio, basta coprire la larghezza di un assone o un dendrite, per garantire la precisione della ferita e ridurre i danni ai tessuti vicini. Se lo si desidera, zoomare sul ROI prima del taglio, permettendo per la ferita più precisa.</li>
		<li>Aprire una nuova finestra di imaging. Ridurre la velocità di scansione e aumentare l'intensità del laser. Determinano l'aumento nell'intensità del laser basato sul segnale di fluorescenza del tessuto scansionato in modalità Live .</li>
		<li>In genere, impostare l'intensità del due-fotone laser a partire da 25% per le lesioni PNS e 50-100% per le lesioni VNC. Per la ferita di assone PNS, garantire che l'intensità del laser è ~ 480 mW e pixel tempo di sosta è 8,19 μs. Per la ferita dell'assone VNC, assicurarsi che il tempo di permanenza di intensità e pixel laser sono solitamente 965-1930 mW e 8,19-32,77 μs, rispettivamente.</li>
		<li>Avviare la scansione continua . Lasciare il cursore mouse sopra il pulsante continua . Tenere d'occhio sull'immagine e interrompere la scansione, non appena si osserva un aumento drastico in fluorescenza. Nota: L'aspetto del picco di fluorescenza è dovuta auto-fluorescenza al sito di lesione.</li>
		<li>Passare alla modalità "Live" riutilizzando le impostazioni. Trovare la regione di interesse che è stato mirato solo regolando la messa a fuoco. Nota: Una buona indicazione della ferita di successo è l'aspetto di un piccolo cratere, struttura anulare o detriti localizzato proprio al sito di lesione.</li>
		<li>Spostare il neurone successivo e ripetere dal punto 3.3.5, a danneggiare i neuroni multipli in un singolo animale. O ripetere il punto 3.3.5 mentre gradualmente aumentando la potenza e/o riducendo la velocità di scansione se la lesione iniziale era insufficiente. Nota: Nel caso in cui la potenza del laser è troppo alta, una grande area danneggiata sarà visibile nell'immagine post-ferita scan in tempo reale. Troppo ferita può causare la morte della larva.</li>
		<li>Recuperare la larva con attenzione rimuovere il vetrino coprioggetto e trasferendo la larva ferita su una piastra di nuova con la pasta di lievito. Fosso diverse grotte sulla piastra di agar con il forcipe; in alternativa, è possibile rendere un'isola di agar in lastra invece di utilizzare tutta la piastra, per ridurre la possibilità della larva strisciando fuori la piastra.</li>
		<li>Mettere la piastra in una capsula di Petri 60mm con tessuto umido (imbevuto con soluzione di acido propionico del 0,5%) e la cultura a temperatura ambiente o 25° C. Nota: La larva rimarrà allo stadio larvale per circa un giorno extra a temperatura ambiente (22° C) rispetto ai 25° c.</li>
	</ol></li>
	<li>Formazione immagine confocal di alberino-ferita<ol>
<li>Immagine la larva ferita a intervalli di tempo desiderato preparando la larva utilizzando la stessa procedura di anestesia e montaggio come in passo 3.2, quindi delle immagini con il laser confocale. Nota: Immagine della larva a 24 h dopo la lesione (AI) per confermare la ferita axonal e a 48 h AI (neuroni da classe IV) o 72 h AI (neuroni da di classe III) per valutare la rigenerazione.</li>
		<li>Individuare la larva utilizzando l'obiettivo 10x, quindi passa a un 25x (0,8 NA) obiettivo. Riutilizzare il protocollo sperimentale GFP Imaging.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Live e trovare il neurone stesso ferito in precedenza.</li>
		<li>Impostare le posizioni di Z prime e l'ultima nella finestra di scan in tempo reale. Premere il tasto stop e fare clic su Start sperimentare per acquisire un'immagine dello stack Z. Nota: Assicurarsi che un punto di normalizzazione (il punto di convergenza di assone) è incluso quando si acquisiscono immagini in modo che la quantificazione di rigenerazione è possibile (Figura 1, 1F) – questo è discusso ulteriormente nella sezione di analisi di dati.</li>
		<li>Passare all'Elaborazione di immagine, selezionare l'immagine appena scattata e generare una proiezione di massima intensità. Salvare il z-stack e l'intensità massima proiezione immagini.</li>
	</ol></li>
</ol>4. analisi dei dati
<ol><li>Elaborare e quantificare le immagini utilizzando il software di imaging o ImageJ.</li>
	<li>Quantificazione di rigenerazione assonale nel PNS<ol>
<li>Calcolare la percentuale di rigenerazione, che si riferisce alla percentuale di rigenerante assoni tra tutti gli assoni che sono stati lesi. Punteggio ottenuto un assone come rigenerante, purché essa ricresce oltre il sito di lesione.</li>
		<li>Misura lunghezza di rigenerazione, che è l'aumento della lunghezza dell'assone. Se quantificare con ImageJ, utilizzare lo strumento Linea segmentata per tracciare l'assone rigenerata e utilizzare misura nel menu a discesa analizza per ottenere la lunghezza della linea che rappresenta l'assone rigenerata.</li>
		<li>Calcolare l' Indice di rigenerazione, che è l'aumento della lunghezza dell'assone normalizzato. Nota: La lunghezza dell'assone è normalizzato dalla distanza tra il corpo cellulare e l'assone convergenti punto (DCAC) – assone lunghezza/DCAC (Figura 1 e 1F). Questo valore consente di account per qualsiasi crescita assonale che è a causa di ridimensionamento larvale. Un valore positivo rappresenta la rigenerazione, un valore pari a 0 non significa nessuna rigenerazione e un valore negativo significa ritrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificazione di rigenerazione dendrite<ol>
<li>Calcolare la percentuale di rigenerazione, che è la percentuale di neuroni da tra tutti quelli reciso che mostrano dendrite evidente ricrescita. Nota: Dendrite ricrescita è segnato come positivi se nuovi dendriti ricrescono fuori dallo stelo retratto dendritico e oltre il sito di lesione. Il sito di lesione è determinato da punti di riferimento e in alcuni casi, è facilmente visibile a causa il autofluorescence indotto da lesione residuo.</li>
		<li>Calcolare l' aumento dei punti di ramo, che conta l'aggiunta di nuovi punti di ramo dendritico dopo la ferita.</li>
		<li>Calcolare l' aumento della lunghezza totale dendrite, che è la lunghezza cumulativa di tutti i nuovi dendriti aggiunto dopo la ferita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificazione di rigenerazione assonale nel SNC Nota: Se un sito di lesione mostra degenerazione nel primo punto di tempo imaged (Figura 3B), potranno essere inclusi nell'analisi della lunghezza di rigenerazione e.<ol>
<li>Misura lunghezza di rigenerazione, che è la lunghezza dell'assone ricresciuto. Nota: L'assone ricresciuto di un sito di singola lesione è identificato come proviene fuori del percorso di axon originale prima della lesione.</li>
		<li>Calcola la lunghezza di rigenerazione normalizzato, che normalizza la lunghezza di rigenerazione per la lunghezza del segmento commessura - la distanza longitudinale tra commissure ("Y" in Figura 3A e 3B). Nota: Questo valore aiuta a correggere l'effetto delle differenze di dimensione larvale.</li>
		<li>Calcolare il tasso di rigenerazione, che è la percentuale di rigenerante segmenti tra tutti i segmenti che sono stati lesi, in modo da riflettere la capacità di rigenerazione di un particolare genotipo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+axon+regeneration+in+Drosophila.">Models of axon regeneration in Drosophila.</a> Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).</li><li>Hao, Y., Collins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+for+axon+regeneration:+insights+from+injured+axons+in+Drosophila.">Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila.</a> Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Sugimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons.">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822 (2004).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite.">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Kang, H., Lichtman, J. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Buss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+and+phosphacan+are+present+in+the+astroglial+scar+after+human+traumatic+spinal+cord+injury.">NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury.</a> BMC Neurol. 9, 32 (2009).</li><li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. 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S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Tsai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30 (2006).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+low-budget+laser+axotomy+system+to+study+axon+regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans.</a> J Vis Exp. , (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando attraversa la configurazione di volo, il numero di femmine e maschi utilizzati può variare a seconda dei genotipi e il numero di larve necessarie per gli esperimenti specifici. Per le mosche WT, tipica croce utilizza 10 femmine e 5 maschi. La finestra di raccolta può essere ristretta, a seconda della precisione dell'età larve. Ad esempio, un periodo di 2 h raccolta produrrà le larve di una popolazione più omogenea. In questo caso, utilizzando 20 o più vergine femmine per impostare le croci aiuterà a produrr...

L'incapacità degli assoni di rigenerarsi dopo una lesione al sistema nervoso centrale (CNS), può portare a disabilità permanenti nei pazienti e svolge anche un ruolo nei deficit neurologici irreversibili in neurodegenerative malattie1,2 ,3,4,5. L'ambiente del CNS, come pure la capacità intrinseche di crescita dei neuroni, determina se gli assoni sono in grado di rigenerare dopo il trauma. Fattori extracellulari da oligodendrociti, astroglial e fibroblastici fonti sono stati indicati per impedire la crescita neuronale4,6,7,8, ma l'eliminazione di queste molecole consente solo limitata5di germogliatura. Segnali di rigenerazione intrinseca possono influenzare il successo rigenerativa5,9 e rappresentano potenziali bersagli terapeutici, ma questi processi sono ancora non ben definiti a livello molecolare. Aumenti in fattore trofico segnalazione o eliminazione dei freni endogeni, quali la fosfatasi Pten10, possono causare la rigenerazione assonale in determinate circostanze. Combinazioni di diversi metodi trovati per essere singolarmente efficace forniscono anche solo limitato recupero complessivo ad oggi11,12,13,14. Di conseguenza, c'è un disperato bisogno per identificare ulteriori vie per la terapia mirata. Oltre l'inizio della ricrescita dell'assone, se e come gli assoni ricollegherai alla destinazione corretta, specificità di sinapsi di riforma e realizzare il recupero funzionale sono importanti domande senza risposta.
In sintesi, comprensione corrente del macchinario dettando la rigenerazione dell'assone è ancora molto frammentaria. Parte del problema è la difficoltà tecnica di studiare assone rigenerazione nei mammiferi in tempo reale, un approccio che è costosa, richiede tempo e stimolante per lo svolgimento di schermi genetici su larga scala. Drosophila melanogaster, d'altra parte, ha dimostrato di essere un sistema eccezionalmente potente per lo studio delle complesse questioni biologiche. Moscerino della frutta è stato determinante nella definizione di geni e vie che sono straordinariamente conservate negli esseri umani di segnalazione ed è stato un modello di successo per lo studio delle condizioni umane, come le malattie neurodegenerative, attraverso gli strumenti di genetica molecolare vasto disponibili per manipolare gene funzione15. In particolare, sono considerate uno strumento ideale per la scoperta di geni coinvolti in lesioni neurali e ricrescita15,16mosche della frutta. Sono stati sviluppati diversi modelli di lesioni neurali volare, compreso adulto-testa o nervo ventrali larvale cavo (VNC) lancinante con aghi, larvale VNC o schiacciamento del nervo con forcipe, neurone larvale laser assotomia, rimozione di neuroni recettori olfattivi, espianti trauma cranico, e la lesione del nervo periferico di ala severance15,17,18,19,20,21,22,23. Eccitante, recente lavoro che utilizzano modelli di lesione Drosophila hanno avanzato la nostra comprensione delle vie cellulari e genetiche utilizzati dal sistema nervoso per rispondere alle lesioni neurali, alcuni dei quali sono stati indicati per essere conservata nei mammiferi24 ,25. Ancora una volta, questo sottolinea l'utilità di questo organismo di modello per identificazione di nuovi meccanismi di riparazione neurale.
Un modello del due-fotone basato su laser Drosophila larvale neurone sensoriale lesioni è descritto qui. Un laser del due-fotone fu usato per tagliare gli assoni in zebrafish in vivo nel 200326. Nello stesso anno, il primo laser dendriotomy è stato effettuato in Drosophila utilizzando un laser pulsato azoto27. Poco dopo, diversi laboratori di c. elegans utilizzato con laser a femtosecondi per stabilire modelli di assone rigenerazione28. Nel 2007, Wu e colleghi rispetto e segnalato le differenze fra le lesioni laser in c. elegans indotte da vari tipi di laser29. Nel 2010, la rigenerazione assonale dopo lesione assonale laser era primo indicata per accadere in Drosophila30. Sulla base di questa letteratura di lesioni ampie laser, abbiamo sviluppato un modello di lesioni neurali volare utilizzando il laser del due-fotone, che permette la precisa induzione della lesione per siti mirati con minima perturbazione della vicina tessuti, fornendo un ambiente relativamente pulito sistema per lo studio di entrambe le proprietà intrinseche ed estrinseche della neurorigenerazione con cella singola ad alta risoluzione. In particolare, abbiamo stabilito un insieme di metodi di pregiudizio per i neuroni sensoriali arborization dentritico (da) in entrambi sistema nervoso periferico (PNS) e sistema nervoso centrale. Da neuroni possono essere raggruppati in quattro distinte classi distingue principalmente per la loro complessità ramificazione dendrite: classe I a IV31. Nostro lavoro pubblicato dimostra che da rigenerazione di neurone assomiglia a modelli di lesione dei mammiferi a livello molecolare e fenotipico: neuroni da visualizzare le proprietà di rigenerazione specifico di classe, con la classe IV ma non di classe I o neuroni da III che esibiscono rigenerazione nella PNS; assoni di neuroni di classe IV da rigenerano robustamente nella periferia, ma il loro potenziale rigenerativo è drasticamente ridotto nel SNC, così simile a neuroni gangliari (DRG) radice dorsale nei mammiferi; migliorante l'attività di mTOR tramite Pten eliminazione o iperespressione di Akt migliora la rigenerazione assonale nel moscerino della CNS19. Utilizzando questo modello di ferita, ci hanno suonato schermi genetici e hanno identificato l'enzima di elaborazione del RNA Rtca come fattore inibitorio evolutivamente conservato per rigenerazione dell'assone, che collega ferita dell'assone di stress cellulare e modifica di RNA20 .
Nel paradigma presentato, il pregiudizio è indotta tramite laser assotomia/dendriotomy di larvale classe IV o III da neuroni, etichettati da ppk-CD4-tdGFP o 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, rispettivamente. La ferita viene eseguita su 2nd a 3rd instar larve a circa 48-72 h dopo (h AEL) la deposizione delle uova. PNS assotomia la lesione è destinato alla sezione dell'assone ~ 20-50 µm lontano dal corpo cellulare, per CNS assotomia ad un'area di ~ 20 µm di diametro allo svincolo commissura in VNC e per dendriotomy ai punti di ramo dendritico primario. Il neurone stesso è imaged a 8-24 h dopo la lesione (AI) per confermare il transection completo e a 48-72 h per valutare la rigenerazione. Attraverso la formazione immagine confocal time-lapse, degenerazione e rigenerazione degli assoni/dendriti individuali che sono stati feriti in vivo possono essere monitorati nel tempo.

<table><tbody><tr><td>Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous</td><td>Acros Organics</td><td>AC615080010</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 27 Oil</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-133</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L</td><td>VWR</td><td>97062-948&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agar powder, Alfa Aesar, 500GM</td><td>VWR</td><td>AAA10752-36</td><td></td></tr><tr><td>Grape juice</td><td>Welch&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>J.T.Baker</td><td>U33007</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: Rectangles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td>50 mm X 22 mm</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 laser scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system

La capacità di ricrescita di neuroni danneggiati governa neurorigenerazione ed il recupero funzionale dopo trauma del sistema nervoso. Negli ultimi decenni, sono stati identificati diversi fattori inibitori intrinseche ed estrinseche coinvolti nella restrizione di rigenerazione dell'assone. Tuttavia, semplicemente rimuovendo questi spunti inibitori è insufficiente per successo di rigenerazione, che indica l'esistenza di ulteriori normative macchine. Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta, condivide evolutivamente conservati geni e vie di segnalazione con vertebrati, compreso gli esseri umani. Combinando la casella degli strumenti genetico potente di mosche con due fotoni laser assotomia/dendriotomy, descriviamo qui il neurone sensoriale di Drosophila – modello di lesione del neurone arborization dentritico (da) come una piattaforma per lo screening sistematico per il romanzo regolatori di rigenerazione. Brevemente, questo paradigma include un) la preparazione di larve, induzione b) lesione di dendrite(s) o axon(s) utilizzando un laser del due-fotone, c) dal vivo confocale imaging post-infortunio e d) analisi dei dati. Il nostro modello consente altamente riproducibile lesioni di singoli neuroni con etichettati, assoni e dendriti dei sottotipi neuronali ben definiti, nel sistema nervoso centrale e periferico.

Neuroni da mostrano il differenziale rigenerazione potenziale tra la periferica e del sistema nervoso centrale, come pure la specificità di classe. Questo offre l'opportunità unica di screen per nuovi fattori che sono necessari per la rigenerazione dell'assone (utilizzando la classe lesioni IV PNS), come pure quelli che sono inibitori per la rigenerazione (con lesioni snc di IV classe e classe lesione III PNS).
Rigenerazione asso...

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Un modello di lesione in vivo della Drosophila per lo studio della neurorigenerazione nel sistema nervoso periferico e centrale | Medicina | Video

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando la drosofila neurone sensoriale - modello di lesione del neurone arborization dentritico (da), che combina in vivo live imaging, due fotoni laser assotomia/dendriotomy e il potente toolbox di volare genetica, come una piattaforma per lo screening di potenziali promotori e inibitori della neurorigenerazione.

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

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A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

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9.6K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia. Qui, presentiamo un protocollo utilizzando la drosofila neurone sensoriale - modello di lesione del neurone arborization dentritico (da), che combina in vivo live imaging, due fotoni laser assotomia/dendriotomy e il potente toolbox di volare genetica, come una piattaforma per lo screening di potenziali promotori e inibitori della neurorigenerazione.

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Ricerca

Neuroscienze

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioingegneria

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Biologia dello sviluppo

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Degenerazione dei motori neuronali

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Valutazione morfologica e funzionale degli assoni e delle loro sinapsi durante la morte di Axon in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

Stimolare e analizzare la neurogenesi adulta nel cervello centrale della Drosophila

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observe Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila Larvae

Source: Li, D., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57557/" target="_blank">A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video describes two-photon laser ablation of axons in a Drosophila melanogaster larva and an example protocol to induce injury and image the injury site.

Lesione neurale indotta da laser a due fotoni: un metodo per osservare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni nelle larve di Drosophila

Source: Li, D., et al. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. 
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologia

Drosophila melanogaster (fruit fly)

Larva

Inducing Targeted Neuronal Injury Using a High-Power Laser in a Drosophila Larva

Source: Li, D., Li, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57557">A Drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for inducing targeted neuronal injury in Drosophila larvae using a high-power laser. After positioning the larva under a microscope, a low-power laser scans for fluorescent neurons, and then the laser power is increased to induce localized damage. The injury is confirmed by increased fluorescence and a crater at the injury site.

Source: Li, D., Li, F., et al. A Drosophila in vivo injury model for studying neuroregeneration in the peripheral and central nervous system. J. Vis. Exp. ...

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

Riepilogo

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