Vorremmo ringraziare Ann Grimm e Michael Zimmerman per la revisione critica di questo manoscritto e Doug Hamilton per il suo supporto tecnico.

1. Flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione procedura <ol><li> Preparazione di tamponi e soluzioni: Soluzione di eluizione (1 L): Per aggiungere 1 L di acqua distillata polifosfato di sodio 0,1 g, 0,1 ml di Tween-80 e 0,01 ml Y-30 antischiuma. </li><li> Preparare gruppo filtro (figura 1) in una cappa di sicurezza biologica: <ol><li> Inserire Masterflex I / P 73 attraverso un tubo lab I / P Masterflex Easy-Load testa della pompa collegata ad un I / P brushless Masterflex unità di precisione. </li><li> Fissare la tubatura a un, glicerina 0-60 psi-riempita manometro munito di un ramo NPT connettore a T a monte della testa della pompa con un morsetto a vite, e ad un connettore a T HDPE a valle della testa della pompa. </li><li> Montare la bottiglia ritentato montando un Nalgene 53-B di riempimento / sfiato tappo con Masterflex L / S 15 tubi di laboratorio e di un connettore a T e fissandolo ad una bottiglia da 1 L heavy duty polipropilene Nalgene. </li><li> Montare Masterflex L / S 24 tubi won una fascetta pizzico (pizzico morsetto 2) e collegarlo dalla bottiglia retentato al HDPE T-connettore. </li><li> Collegare L / S Masterflex tubo 24 laboratorio dal manometro al Asahi Kasei Rexeed 25S alto flusso dializzatore con un morsetto a vite, e dal dializzatore alla bottiglia ritentato. Utilizzare misura adattatori DIN progettati per ospitare ¼ &quot;tubo ID per collegare il tubo al ultrafiltro a fibre cave. </li><li> Montare Masterflex L / S 24 tubi di laboratorio con una fascetta pizzico (pizzico morsetto 1) e collegarlo a una pipetta di plastica da 10 ml con il tappo di punta e cotone rimosso per agire come la linea di assorbimento del campione e quindi collegare il tubo al HDPE T- connettore. </li><li> Inserire un&#39;estremità del tubo Masterflex L/S-36 laboratorio con una rampa fissacavo e collegare il tubo alla porta effluenti situato vicino alla estremità di uscita del filtro. Posizionare l&#39;altra estremità nel contenitore di rifiuti. </li></ol></li><li> Aggiungere 0,01% (w / v) polifosfato di sodio al campione 10 L di acqua e miscelare per 3 min. </li><li> Chiudere il morsetto pizzico 2e rimuovere il tappo di chiusura dal flacone ritentato. Tutti gli altri morsetti dovrebbe essere aperta. </li><li> Impostare la direzione della pompa per spostare il fluido dal connettore a T per il manometro (da destra a sinistra seguente Figura 1). Regolare la velocità della pompa al 25% della velocità massima e accendere la pompa. </li><li> Quando la bottiglia retentato è di 2/3, morsetto pizzico aperto 2 e sostituire rapidamente il tappo di chiusura alla bottiglia ritentato. Controllare tutte le linee e raccordi per garantire non vi siano perdite. </li><li> Aumentare lentamente la velocità della pompa alla velocità di filtrazione desiderata (circa 1,5 L / min), controllando eventuali perdite. Utilizzo di un cilindro graduato e un misuratore di flusso o timer, controllare la portata del filtrato dell&#39;acqua in uscita dalla linea di effluente (blu L / S tubo 36 nella figura 1). Le bolle d&#39;aria possono tipicamente formano all&#39;estremità di uscita del filtro rende difficile raggiungere una pressione stabile e la velocità di filtrazione. Questo è stato corretto pizzicando la linea di effluenti a mano per un momento. Questa azionegeneralmente coassiale la bolla d&#39;aria alla porta e filtrato per uscire attraverso la linea effluente. Ripetere, se necessario, tenendo presente che le bolle d&#39;aria pisello dimensioni sono spesso inevitabili. </li><li> Monitorare il processo di filtrazione. Misurare e registrare la pressione e la velocità di filtrazione come necessario. La pressione non deve mai superare i 20 psi. Si raccomanda che la velocità di filtrazione non deve superare 2,0 L / min. È importante che il volume di acqua nella bottiglia retentato essere monitorate per assicurare che non si svuota. È normale che il volume per aumentare o diminuire leggermente. Se il volume di acqua in bottiglia retentato scende sotto 1/3, quindi rimuovere il tappo di chiusura e un pizzico Chiudere il morsetto 2 sulla linea delle bottiglie ritentato. Portare il volume torna a circa 2/3, aprire il morsetto e sostituire rapidamente il tappo di chiusura, garantendo una tenuta perfetta. Se il volume in bottiglia retentato scende velocemente e, quindi assicurarsi il coperchio bottiglia ritenuto è stretto e il tappo di sfiato è saldamente in posizione, e che l&#39;tubing è ancora in contatto con il campione di acqua. Se questi problemi non si verificano, allora è probabile che la guarnizione del coperchio bottiglia ritentato è male e deve essere sostituito. </li><li> Quando il contenitore del campione è vuoto, morsetto presa immediatamente chiuso 1, ridurre la velocità della pompa al 20% del massimo, togliere il tappo di chiusura dal flacone ritentato e chiudere il morsetto rampa. </li><li> Regolare il volume del campione in bottiglia retentato a circa 200 ml svitando o avvitando il morsetto rampa. Dopo che il volume è di circa 200 ml, stringere il morsetto rampa per le fasi di eluizione (1,11-1,12). </li><li> Aggiungere 500 ml di soluzione di eluizione per il contenitore del campione e lavare l&#39;interno del contenitore. Posizionare la pipetta 10 ml collegato alla linea di assorbimento del campione nel contenitore che contiene la soluzione di eluizione. Assicurarsi che il morsetto rampa è chiuso. Aperto pizzico morsetto 1 e un pizzico vicino morsetto 2 momentaneamente di elaborare la soluzione di eluizione. </li><li> Dopo 500 ml di soluzione di eluizione è redatta, Vicino pizzico morsetto 1 e il morsetto pizzico aperto 2. Lasciare la soluzione di eluizione di circolare per 5 minuti con una velocità della pompa del 20% del massimo. </li><li> Regolare il volume del campione in bottiglia retentato a circa 100 ml svitando o avvitando il morsetto rampa sulla linea di effluenti. Serrare la fascetta rampa e permettere al campione di circolare per 1 minuto. Evitare di tirare l&#39;aria nel tubo garantendo il volume del campione nella bottiglia retentato è sufficiente a coprire la L / S 15 di entrare nel tubo bottiglia ritentato. </li><li> Invertire la direzione della pompa che costringe il campione nella bottiglia ritentato. Lasciare la pompa per la retromarcia per 20 secondi per un totale di ~ 225 ml in bottiglia retentato. Spegnere la pompa. </li><li> Rimuovere l&#39;I / P Masterflex 73 tubo dalla testa della pompa e scollegare il manometro. Scollegare il L / S Masterflex 24 tubi uscita dalla fibra cava ultrafiltro. Tenere il tubo sopra la bottiglia ritenuto di forzare qualsiasi campione rimanente nellaritentato bottiglia. </li><li> Scollegare tutti i tubi dalla bottiglia e sostituire il tappo di sfiato con un non-sfiato tappo. </li><li> Proseguire fino alla IMS / IFA procedura con il retentato ~ 225 ml. </li></ol> 2. Separazione Procedura immunomagnetica <ol><li> Preparazione di tamponi e soluzioni: <ol><li> Lasciare i tamponi inclusi nelle Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit a temperatura ambiente. </li><li> 1X SL-buffer A: Aggiungere 1 ml di 10X SL-buffer A a 9 ml di acqua distillata. </li></ol></li><li> Trasferire la ~ 225 ml di liquido dalla bottiglia a un ritentato etichettato 250 ml provetta da centrifuga conica. Risciacquare la bottiglia ritentato due volte con 10 ml di acqua distillata, e aggiungere i risciacqui al tubo da centrifuga conica. Centrifugare la sospensione a 1500 xg per 15 min a 4 ° C senza freno. </li><li> Aspirare il supernatante dal aria-acqua a 5 ml di sopra della imballato pellet per ogni 0,5 ml di volume pellet (cioè aspirato a 15 ml sopra un volume di 1,3 ml pellet, e aspirare a 5 ml di una pastiglia di 0,5 ml o meno). </li><li> Accuratamente risospendere il pellet nel surnatante tramite vortex e / o una pipetta di miscelazione. Trasferire ogni volume di 5 ml di liquido al piatto lati Dynal L10 provetta contenente 1 ml ciascuna di SL-10X e 10X tampone A SL-tampone B. Lavare il tubo conico centrifuga due volte con 2,5 ml di acqua distillata e aggiungere la risciacquatura il tubo L10, portando il volume totale del tubo ml L10 a 12, compresi i buffer. </li><li> Aggiungere 100 ul ciascuno di Dynabeads risospeso ben miste anti-anti-Cryptosporidium e Giardia al tubo L10. Ruotare il tubo L10 a 18 rpm per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore rotatore. </li><li> Posizionare il lato piatto del tubo L10 contro l&#39;MPC-6 magnete e rock delicatamente a mano il tubo end-to-end, a 180 ° per 2 minuti. </li><li> Mantenere il tubo L10 del MPC-6 magnete con il lato magnete alto, decantare il surnatante dal tallone / (oo) cisti complessi bound al magnete. Rimuovere il tubo L10 del magnete e aggiungere 0,5 ml di tampone 1X SL-A al tubo. Trasferire la sospensione con due risciacqui supplementari di 0,5 ml di SL-1X tampone A in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml tenuto in MPC-S con il magnete in posizione verticale. </li><li> Agitare delicatamente il tubo nel MPC-S magnete a 180 ° per 1 minuto. Con il magnete in posizione, aspirare il supernatante usando una pipetta Pasteur diretta al fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1X PBS al lato anteriore della provetta, rimuovere il magnete e oscillare delicatamente il tubo fino a quando le perle vengono risospese. Sostituire il magnete in posizione verticale e oscillare delicatamente il tubo 180 ° per 1 minuto. Aspirare il PBS risciacquo, senza disturbare il pellet tallone, utilizzando una pipetta Pasteur per rimuovere quanto più possibile i detriti. </li><li> Rimuovere il magnete e aggiungono 50 pl di acqua distillata al lato posteriore della provetta. Vortex il tubo a tutta velocità per 50 secondi,incubare il tubo a 80 ° C per 10 minuti seguiti da un vortice 30 secondi. Sostituire il magnete nella MPC-S in posizione inclinata, legando le perline al magnete e lasciando i (oo) cisti nel liquido. Applicare il (oo) sospensione cisti a una diapositiva SingleSpot bene. </li><li> Ripetere passo 2,10, applicando il liquido stesso pozzo contenente la dissociazione prima. Vetrino su uno scivolo 37 ° C per 1 ora calda per asciugare la sospensione al vetrino. </li></ol> 3. Colorazione ed esame <ol><li> Preparazione di tamponi e soluzioni: Soluzione di lavoro DAPI: Aggiungere 25 ml di soluzione DAPI magazzino (2 mg / ml in metanolo) a 25 ml di PBS 1X. Negozio di stock e le soluzioni di lavoro tra 1 ° C e 10 ° C al buio. </li><li> Applicare 50 pl di metanolo alla slitta bene e lasciare asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 50 pl della soluzione di DAPI lavoro alla slitta pozzetto ed incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare un Kimwipe per Wick il DAPI dal pozzo. Applicare il 50 microlitri di EasyStain. Incubare a 35 ° C per 30 minuti. </li><li> Wick la macchia del bene con un Kimwipe, e poi aggiungere lentamente 300 ml di tampone di fissaggio a freddo EasyStain, permettendogli di scendere oltre il bordo bene. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare un Kimwipe a Wick il buffer dal pozzo e applicare 10 pl di medio EasyStain di montaggio. </li><li> Con attenzione applicare un vetrino, eliminando eventuali bolle che si verificano. Sigillare il coprioggetto con smalto trasparente. </li><li> Scansione l&#39;intera diapositiva utilizzando il filtro FITC, con ingrandimento 200X totale, per ovoidale o sferica oggetti fluorescenti verde mela che assomigliano a uno oocisti o cisti. Esaminare tutti gli oggetti con il filtro DAPI a 1000X ingrandimento totale e poi con DIC, anche a 1000X ingrandimento totale. Registrare il formato utilizzando un micrometro oculare calibrato e caratteristiche morfologiche. </li><li> Risultati del documento. </li></ol> Nota: Ulteriori informazioniinformazioni sulla procedura originale si trova nella versione di dicembre 2005 di metodo EPA 1623 12. Il flusso tangenziale a fibre cave ultrafiltrazione procedura descritta viene utilizzata al posto della sezione di 12,0 metodo EPA 1623. La dissociazione di calore modifica la sezione 13.3.3 del metodo EPA 1623. La procedura descrive anche un ulteriore risciacquo PBS durante il processo di IMS che può essere inserito nella versione del dicembre 2005 Method 1623 dopo la sezione 13.3.2.16. L&#39;elenco completo dei beni di consumo, reagenti e attrezzature utilizzati per il metodo EPA 1623 l&#39;inserimento di tali modifiche è elencato nella lista degli equipaggiamenti. 4. Risultati rappresentativi Oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia recuperati attraverso i processi di filtrazione e separazione immunomagnetica sono rilevati da analisi microscopica. A 200X ingrandimento totale, ogni organismo esibendo un tipico schema di colorazione, dimensione, forma e come mostrato in figura 2 </strong&gt; dovrebbe essere ulteriormente osservare con olio da immersione a 1000X ingrandimento totale. Ciò consentirà la misurazione e l&#39;identificazione di una delle caratteristiche tipiche che definiscono o caratteristiche atipiche che escludono l&#39;identificazione positiva. Cryptosporidium è un oggetto sferico ovoidale per 4 a 6 micron di diametro che presenta una brillante fluorescenza verde mela con bordi FITC brillantemente evidenziato (Figura 3A ). Con DAPI UV, uno oocisti esporrà una delle seguenti categorie tipiche funzionalità: la luce interna colorazione blu con bordo verde e senza nuclei distinti (DAPI negativo), intensa colorazione blu interno, o fino a quattro distinti, sky-blue nuclei (DAPI positivo - Figura 3B). Caratteristiche atipiche includono deviazioni di colore, struttura, o fluorescenza DAPI (ad esempio, troppi nuclei tinto, rosso fluorescente strutture interne). Se l&#39;oggetto fluorescente ha soddisfatto i criteri per FITC tipico e colorazione DAPI, è esaminato tramite le interferenze con differenzialecontrasto (DIC). L&#39;oggetto viene esaminato per atipici caratteristiche esterne o interne morfologici come ornamento parete cellulare, o uno o due nuclei grandi riempimento della cella. Se le strutture atipici non si osservano, l&#39;oggetto viene registrata nel totale IFA e classificati come una struttura amorfa o vuoto con uno a quattro sporozoiti presenti (Figura 3C). Allo stesso modo, Giardia oggetti simili vengono esaminati per quanto riguarda la colorazione FITC e DAPI così come le caratteristiche di CID, come assonemi, corpi mediani e nuclei cisti di Giardia sono rotonde ad oggetti ovoidali brillanti mela verde, 8 - 18 micron di lunghezza per 5 - 15 um ampio con bordi brillantemente evidenziato (Figura 3D). Con DAPI UV, la cisti Giardia esporrà DAPI-colorazione negativa, o DAPI-positive caratteristiche (Figura 3E). L&#39;oggetto fluorescente viene esaminato per le caratteristiche DIC tipici e atipici nello stesso modo come descritto per Cryptosporidium.Se caratteristiche atipiche non vengono osservate, l&#39;oggetto viene registrata nel totale IFA e classificati come vuoto struttura di contenimento amorfa, o con uno o più tipi di strutture interne presenti (Figura 3F). Qualsiasi organismo che si osserva di avere caratteristiche atipiche non dovrebbe essere considerato come un (oo) cisti. Analisi al microscopio di campioni ambientali può essere difficile in quanto vi sono organismi che possono auto-fluorescenti o cross-reagiscono con il FITC-coniugato anti-Cryptosporidium e / o anticorpi anti-Giardia 1. Si raccomanda che un analista avere familiarità con i microbi acquatici e decine di revisione di slide per acquisire esperienza identificare Cryptosporidium e Giardia. Almeno tre (oo) cisti sul vetrino del controllo positivo colorazione dovrebbe essere caratterizzato prima di ogni sessione al microscopio. Campioni di controllo di qualità può essere arricchito con (oo) cisti per determinare il rec per centoOvery per ogni protozoo utilizzando il calcolo: (Oo) Percentuale di recupero cisti = ((Count Sample QC - Contare da campioni non diluiti) / Spike) x 100. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione grafica del flusso tangenziale a fibre cave sistema di ultrafiltrazione. Il tubo di codifica a colori per facilitare sia l&#39;assemblaggio del sistema. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine rappresentativa fluorescenza di Cryptosporidium e Giardia (oo) cisti. Oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia sono state colorate con marcato con FITC anti-Cryptosporidium / Giardia anticorpi. Frecce, cisti Giardia, punte di freccia, oocisti di Cryptosporidium. Un totale di quattro oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia sei sono stati trovati nel piano di messa a fuoco. I campioni osservabilied in un ingrandimento di 200X. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Figura 3 immagini rappresentative microscopiche di oocisti di Cryptosporidium e cisti Giaridia utilizzati per la caratterizzazione oocisti di Cryptosporidium (A - C). Brillante fluorescenza verde mela FITC di oggetti sferici da 4 a 6 micron di diametro con i bordi evidenziati brillantemente (A) contenenti fino a quattro distinti, sky-blue nuclei DAPI (B) e una a quattro sporozoiti (S) per oocisti (C). cisti di Giardia (D - F). Brillante verde mela FITC del round agli oggetti ovoidali 8 - 18 micron di lunghezza per 5 - 15 micron di larghezza con bordi luminosi evidenziati (D) contenenti fino a quattro sky-blue nuclei DAPI (E) e con uno o più distinguibile struttura interna tale come nuclei (N), corpo mediano (M) e assonemi o (A) (F). Frecce bianche, fluorescenza verde mela brillante colorazione oocisti di Cryptosporidium e Giardia cisti walls, punte di freccia bianche, nuclei DAPI positivi. I campioni osservati sotto ingrandimento 1000X.

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L&#39;Agenzia degli Stati Uniti Environmental Protection attraverso il suo Ufficio di Ricerca e Sviluppo in collaborazione con l&#39;Ufficio delle acque sotterranee e centro di assistenza tecnica l&#39;acqua potabile ha finanziato la ricerca descritta qui. Tutto il lavoro è stato sostenuto in loco presso l&#39;EPA, Cincinnati, Ohio. Sebbene le informazioni descritte in questo articolo è stato finanziato in tutto o in parte dal Protection Agency degli Stati Uniti ambientale ai sensi del contratto (Contract EP-C-06-031) a Shaw Ambientale e delle Infrastrutture, Inc, che non riflette necessariamente le opinioni della Agenzia e senza l&#39;approvazione ufficiale può essere presupposta. E &#39;stato oggetto di un ricorso dell&#39;Agenzia e approvate per la pubblicazione.

Flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione è una tecnica alternativa ed efficace per la concentrazione iniziale di oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia dall&#39;acqua. Fibre cave ultrafiltrazione è meno costoso dei filtri tradizionali. Dal momento che ha la capacità di concentrarsi oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia da una varietà di differenti matrici acqua è una valida alternativa alle tecniche di filtrazione attualmente utilizzate per il metodo EPA 1623. Come con la maggior parte degli altri metodi di filtrazione, a fibre cave di ultrafiltrazione è incline alla formazione di incrostazioni con campioni molto torbidi. Acqua alta pressione potrebbe derivare dal fouling filtro, quindi si consiglia di monitorare la pressione durante il ciclo di filtrazione. Oltre a oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia, fibra cava ultrafiltrazione ha dimostrato di essere in grado di concentrare batteri e virus 1-3,5,8. A fibre cave o ultrafiltrazioneutlined in questo metodo può essere utilizzato per concentrare organismi multipli in un singolo campione. È interessante notare che ottenere un volume finale tra 200 e 250 ml è il passaggio critico finale del procedimento di concentrazione in modo che le fasi di centrifugazione aggiuntivi, che può provocare (oo) perdita cisti, vengono evitati (passo 2.2). Tuttavia, consentendo il volume nella bottiglia si abbassa troppo può avere effetti sfavorevoli sui recuperi dal momento che non sarà sufficiente volume di liquido per forzare tutte le oocisti o cisti nella bottiglia ritentato. Pertanto si raccomanda di mantenere un volume finale tra 200 e 250 ml. Il calore dissociazione è un&#39;alternativa alla fase acido dissociazione in Method 1623. Questo passaggio alternativa è stato dimostrato per migliorare il recupero Cryptosporidium oocisti e ridurre la variazione metodo quando isolato sia da acqua di fiume o reagente 9. Un side-by-side confronto di acido e calore metodi dissociazione dimostrato che utilizza il calore per dissociazionete gli organismi delle sfere immunomagnetiche prodotto recuperi medi più elevati sia per Cryptosporidium e Giardia. Inoltre, la precisione dei recuperi di Cryptosporidium e Giardia era migliore nei campioni trattati con il calore di dissociazione rispetto a dissociazione acida 9. L&#39;incorporazione di HFUF come la fase di concentrazione consente una maggiore flessibilità, fornendo la capacità di concentrarsi di più organismi. Inoltre si tratta di una alternativa meno costosa alle attuali opzioni di filtraggio Metodo 1623.

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature / Reagente </td><td> Venditore </td><td> Catalogo # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R umide fibre cave ultrafiltri </td><td> Comporre Medical </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex vulcanizzato al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex vulcanizzato al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex vulcanizzato al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P Precision Drive Brushless </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P Easy Load testa della pompa </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Nero Tee HDPE, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> Plastics USA </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex connettore a T L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene heavy-duty pp 1 L bottiglia </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml pipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene riempimento / sfiato tappo per 1/4 &quot;tubo, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manometro </td><td> Cole Parmer </td><td> A-680-46-10 </td></tr><tr><td> Giunto dritto, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> NPT ramo tee, pp naturale </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30.610-75 </td></tr><tr><td> Morsetti a pinza, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> Custom fit DIN adattatori </td><td> Prodotti stampati Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Anello di supporto </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Anello di sostegno morsetti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck rampa di clamp, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Polifosfato di sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Tiosolfato di sodio pentaidrato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Antifoam Y-30 emulsione </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L pieghevole polietilene ad alta densità cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Centrifugare portabottiglie </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml provette per centrifuga coniche </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Imbuto monouso </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> Bottiglia di lavaggio </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06.252-40 </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Rotore oscillante </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Centrifugare adattatori secchio per 250 ml provette coniche </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 pl grandi puntali calibro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield Filter </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml pipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit </td><td> IoDEXX </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> Provette da 50 ml coniche </td><td> Falco </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 tubi piatti lati </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 magnete </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml pipette </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml bassa aderenza microcentrifuga tubi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 pipette ul &amp; suggerimenti barriera corrispondenti </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 pipette ul &amp; suggerimenti barriera corrispondenti </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 pipette Pasteur pollici </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S magnete </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Vortice </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads rotatore mixer </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Blocco riscaldante </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Armatura Beads </td><td> Lab Armatura </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Termometro digitale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Fosfato-buffer salino 1X pH 7.4 (PBS 1X) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Diapositive singolo punto </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Copertura in vetro </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain kit diretta </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 pipette ul &amp; suggerimenti barriera corrispondenti </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-DiamidIno-2-fenil dicloridrato indolo (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Cancella lo smalto </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Incubatrice </td><td> Boekel Scientific </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> scorrere caldo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Olio di immersione, di tipo A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Microscopio Nikon 90i con capacità DIC </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Piano obiettivo APO olio 100X </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Pianificare Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC filtro </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI filtro </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-cite illuminatore a fluorescenza </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Lens carta </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard sacchetto usa e getta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard sharps container </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno al 3% </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Candeggina </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Specie di Cryptosporidium e Giardia sono due dei più diffusi protozoi che provocano epidemie di malattie diarroiche trasmesse dall&#39;acqua in tutto il mondo. Per meglio caratterizzare la prevalenza di questi patogeni, il metodo EPA 1623 è stato sviluppato e utilizzato per monitorare i livelli di questi organismi in acqua potabile degli Stati Uniti fornisce 12. Il metodo ha tre parti principali: il primo è la concentrazione del campione in cui viene filtrato almeno 10 L di acqua di superficie grezza. Gli organismi e detriti intrappolati vengono poi eluite dal filtro e centrifugato per concentrare ulteriormente il campione. La seconda parte del metodo utilizza una procedura di separazione immunomagnetica cui è applicato il campione concentrato a sfere immunomagnetiche che si legano specificamente alle oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia consentendo rimozione specifica dei parassiti dal detriti concentrato. Questi (oo) cisti sono poi staccati dalle biglie magnetiche da una dissociazione dell&#39;acido proceduradure. La parte finale del metodo è la colorazione per immunofluorescenza enumerazione e dove sono applicati (oo) cisti ad un vetrini colorati, e enumerate da microscopia. Metodo 1623 dispone di quattro quotate sistemi a concentrazione del campione per catturare oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia in acqua: filtri Envirochek (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek filtri HV (Pall Corporation), Filta-Max filtri (IDEXX, Westbrook, MA), o centrifugazione a flusso continuo (Haemonetics, Braintree, MA). Tuttavia, Cryptosporidium e Giardia (oo) cisti recuperi sono cambiate notevolmente a seconda della matrice acqua di sorgente e filtri utilizzati 1,14. Un nuovo flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione (HFUF) sistema è stato recentemente dimostrato di essere più efficiente e più robusto al recupero oocisti di Cryptosporidium e cisti di Giardia da matrici acquatici, inoltre, è meno costoso rispetto all&#39;opzione capsule altri filtros e può concentrarsi agenti patogeni contemporaneamente 1-3,5-8,10,11. Inoltre, studi precedenti di Hill e colleghi hanno dimostrato che il HFUF ha migliorato significativamente i recuperi oocisti di Cryptosporidium se direttamente confrontati con i filtri HV Envirochek 4. Ulteriori modifiche agli attuali metodi sono stati segnalati anche per migliorare le prestazioni del metodo. Sostituzione del procedimento di dissociazione acida con calore dissociazione ha dimostrato di essere più efficace a separare Cryptosporidium le biglie magnetiche in alcune matrici 9,13. Questo protocollo descrive un metodo modificato 1623 che utilizza il nuovo sistema di filtrazione HFUF con il passaggio di calore dissociazione. L&#39;uso di HFUF con questo metodo modificato è un alternativa meno costosa alle attuali metodo EPA 1623 le opzioni di filtraggio e fornisce una maggiore flessibilità consentendo la concentrazione degli organismi più.

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A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Questo protocollo descrive l&#39;uso di un flusso tangenziale a fibre cave sistema di concentrazione del campione di ultrafiltrazione ed una dissociazione calore come procedura alternativa per la rilevazione di acquosa<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia</em&gt; Le specie che utilizzano il metodo EPA 1623.

Un metodo modificato EPA 1623 che utilizza flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione e di calore passi dissociazione per rilevare Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

a-modified-epa-method-1623-that-uses-tangential-flow-hollow-fiber

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

20.3K Views.  Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency. Questo protocollo descrive l'uso di un flusso tangenziale a fibre cave sistema di concentrazione del campione di ultrafiltrazione ed una dissociazione calore come procedura alternativa per la rilevazione di acquosa Cryptosporidium E Giardia Le specie che utilizzano il metodo EPA 1623.

Video: A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sette passi per Stellate Cellule

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocollo Chelex semplice per l&#39;estrazione del DNA da<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

Schermi throughput elevato e basso con Nematodi galligeni Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Chiuso flusso degli acidi nucleici Citometria fluorescenza In situ Ibridazione (LNA flow-FISH): un metodo per la rilevazione dei batteri piccoli RNA

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

Filtri di lana di vetro per la raccolta virus a base acquosa e agricole agenti patogeni zoonotici

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Un metodo semplice ed efficace per rilevare l&#39;attivazione del Fattore Nucleare in neutrofili umani mediante citometria a flusso

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l&#39;analisi di linfociti infiltranti

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Un riferimento brodo di microdiluizione per Dalbavancina<em&gt; In Vitro</em&gt; Test della Sensibilità di batteri che crescono aerobico

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Un semplice citometria a flusso metodo per misurare il glucosio assorbimento e glucosio Expression Transporter per monociti sottopopolazioni nel sangue intero

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...