Utilizzando questa procedura di purificazione e microiniezione della sporozoite, essenzialmente qualsiasi microbo ospite può essere studiato in qualsiasi sistema di organi derivati dai tessuti. Usando questa tecnica, possiamo controllare la quantità di sporozoiti puri iniettati nel lume organoide o nel lato apicico dell'organoide. Per purificare le sporozoiti di C.parvum, trasferire l'oocista in un tubo da 15 millilitri e rimondere le cellule a una concentrazione media di estasi una volta 10 al settimo oocista per millilitro.
Dopo 60-90 minuti a 37 gradi Celsius, mescolare 14 millilitri di una soluzione di lavaggio appropriata con le oocisti e sedimentare le cellule per centrifugazione. Aspirare attentamente il supernatante per evitare di perdere oocisti e rimescolare il pellet sporozoico a un tre volte 10 al settimo oocista per uno o due millilitri di concentrazione DMEM. Per rimuovere eventuali oocici e gusci rimanenti, posizionare una canna da 10 millilitri dotata di un apparecchio portafiltro da 47 millilitri dotato di un filtro in policarbonato di dimensioni di pori di tre micrometri in un tubo da 15 millilitri a quattro gradi Celsius.
Aggiungere 7,5 millilitri della sospensione di sporozoite all'assieme del filtro. Quando l'intero volume è passato attraverso il colino per gravità, lavare tutte le cellule rimanenti attraverso il colino con altri 7,5 millilitri di DMEM. Quando tutto il lavaggio è passato attraverso il colino, raccogliere la sospensione di sporozoite filtrata per centrifugazione per 10 minuti ed etichettare il pellet in 50-100 microlitri di un apposito mezzo di coltura organoide, integrato con colorante verde veloce allo 0,05%, e L-glutatione, betaina, L-cisteina, acido linoleico e taurina contenente tampone riducente.
Per microiniettare i parassiti nel lato apicale di un organoide 3D, utilizzare prima un estrattore di micropipette per preparare i capillari di iniezione di vetro. Utilizzare le forcep per tagliare la punta del capillare a un diametro da nove a 12 micrometri per consentire un facile flusso di sporozoiti o oocici, se si sceglie di iniettare direttamente oocista, e utilizzare punte di micro-caricatore per riempire ogni capillare con un veloce colorante verde etichettato o sospensione di sporozoite. Quindi, caricare il primo capillare riempito di sporozoite in un microiniettore e utilizzare un microscopio invertito con un ingrandimento 5x e una pressione costante per microiniettare da 100 a 200 nanolitri della sospensione in ogni organoide.
Il protocollo di escystation provoca il rilascio di sporozoiti da circa il 70 all'80% delle oocici. Pertanto, è essenziale filtrare i gusci di oocista rimanenti attraverso una filtrazione di tre micrometri. Rimuovere quasi il 100% delle oocista non eccitate.
Inoltre, l'aggiunta di un colorante verde aiuta a garantire l'iniezione di tutti gli organoidi e consente la visualizzazione degli organoidi iniettati per almeno 24 ore dopo l'iniezione. Sebbene questo sia un metodo ben praticato, la microscopia elettronica a scansione può essere utilizzata per garantire che il processo di escystation non abbia danneggiare le sporozoiti o le oocici. L'iniezione di quantità uguali di oocista nel lume organoide può essere confermata visivamente da una semplice imaging microscopica.
I test di immunofluorescenza possono anche essere utilizzati per esplorare i tipi di cellule infettate dal Cryptosporidium. Dopo che gli organoidi differenziati sono stati infettati per cinque giorni, la presenza di sporozoiti all'interno delle oocista può essere confermata asciugando una porzione di oocista su uno scivolo adesivo, fissando gli oocici con metanolo e combinando la colorazione DAPI con un anticorpo adatto specifico per oocista. Per ottenere i massimi risultati, utilizzare oocista fresco, utilizzare lo stesso capillare per tutte le iniezioni e cambiare il supporto ogni giorno dopo l'iniezione.
Utilizzando questa tecnica, vari laboratori stanno iniziando a utilizzare organoidi per studiare le interazioni ospite-microbo. Stiamo studiando commensals e altri agenti patogeni in contesti di microcoltura organoide simili. Poiché cryptosporidium è un parassita umano, è importante eseguire questi esperimenti secondo le normative di sicurezza di livello 2.
