Gli autori desiderano ringraziare Jeanette Schermuly per la preparazione di ricombinante T7 RNA polimerasi e Ebelt Norman per l&#39;assistenza nella preparazione di Figura 1. Questo lavoro è stato finanziato con fondi della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) e del Max Planck Society.

1. Generazione di lunga pre-crRNA substrati mediante PCR <ol><li> Disegno primer PCR mirati alle regioni spaziatrici di un cluster CRISPR. Aggiungere l&#39;RNA polimerasi T7 (T7RNAP) sequenza promotore (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) per il primer forward e siti di restrizione per il clonaggio del prodotto di PCR in un vettore di entrambi i primers (es BamHI e Hind III per pUC19, Fig. 2A) . Nota: Il T7RNAP richiede un residuo guanidina per iniziazione della trascrizione. </li><li> Amplifica il vostro pre-crRNA sequenza di interesse da DNA genomico mediante PCR. </li><li> Separare i prodotti di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e gel estrarre la banda desiderata. Digerire il prodotto di PCR con gli enzimi di restrizione per creare estremità coesive (ad es BamHI e HindIII, Fig. 2A). Purificare il prodotto di PCR con un kit di purificazione PCR per eliminare clivaggio sottoprodotti. </li><li> Impostare una reazione di ligazione che contiene DNA ligasi T4, T4 DNA ligasi e tamponeun rapporto molare di 3:1 del prodotto spaccati PCR e il vettore lineare pUC defosforilato con corrispondenti estremità appiccicose. Incubare la miscela a 16 ° C per una notte. Trasforma la miscela di ligazione in cellule di Escherichia coli competenti DH5a di protocolli standard e utilizzare il blu di screening per identificare bianco legatura successo. </li><li> Isolare plasmidi da colonie bianche utilizzando un kit di preparazione di plasmidi. Identificare cloni positivi mediante sequenziamento plasmide. In alternativa, colonia PCR potrebbe essere utilizzata per lo screening. </li></ol> 2. Generazione di pre-intermedio crRNA substrati mediante ricottura di oligonucleotidi di DNA <ol><li> Progettare avanti e indietro oligonucleotidi con il desiderato CRISPR ripetizione / distanziale sequenza. Gli oligonucleotidi contengono la sequenza di un promotore T7 RNAP nonché siti di restrizione BamHI terminali (ad esempio e Hind III per pUC19). Terminate le oligonucleotidi per garantire che forma appiccicoso dopo ricottura estremità (vedi fig. 2B </strong&gt;). </li><li> 5&#39;-fosforilare 1 nmol di ciascun oligonucleotide in una reazione separata 20μl contenente 5 ml di T4 polinucleotide chinasi (PNK), 2 microlitri di tampone di T4 PNK 10x, 2 microlitri ATP (10 mM). Incubare ciascun campione per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Ibridare due oligonucleotidi fosforilati. Combinare 1ml del fosforilata miscela avanti oligo (da 2,2.), 1 ml di miscela fosforilata inversa oligo (da 2,2.), 1 ml di tampone di T4 DNA ligasi 10x in una reazione di 10 microlitri. Incubare i campioni per 5 min a 95 ° C su una piastra riscaldante o in acqua bollente, spegnere la fonte di calore e lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente (~ 2-3 ore). Nota: In questa fase critica, il processo di raffreddamento lento favorisce l&#39;appaiamento dei due oligonucleotidi rispetto alla formazione di strutture all&#39;interno di ogni singolo oligonucleotide. </li><li> Legare 4 microlitri della miscela di ibridazione, 1ml di digerito e defosforilato vettore pUC (0,1 mg /microlitri) con DNA ligasi T4, T4 DNA ligasi tampone 10x e 10 mM ATP in una miscela di ligazione 20 microlitri. Incubare il campione a 16 ° C per una notte. </li><li> Trasformare i plasmidi competenti legato in cellule di Escherichia coli DH5a da protocolli standard e di utilizzare lo screening blu bianco. Plasmidi isolare e identificare cloni positivi mediante digestione (per lo screening per inserti della dimensione desiderata) e successivo sequenziamento plasmide. </li></ol> 3. Generazione di breve Cas RNA substrati tramite sintesi personalizzata oligonucleotidi di RNA Progettazione breve Cas RNA substrati (ad esempio, sequenze ripetute singole, fig. 2C) e utilizzare servizi personalizzati RNA di sintesi di oligonucleotidi. Nota: L&#39;inclusione di un deossiribonucleotide in una posizione specificata di un oligonucleotide RNA (Fig. 2C) può essere utilizzata per individuare il sito di scissione RNA. 4. In vitro T7 RNA polimerasi della trascrizione <ol><li> Isolare plasmidi con il costrutto progettato (da 1.9. O 2.7.) Utilizzando un kit di purificazione plasmide maxiprep. </li><li> Linearizzare il plasmide con l&#39;enzima di restrizione che fende valle del frammento clonato (es. HindIII). Garantire la completa digestione. Nota: Se un divergente 3 definito &#39;terminale del trascritto di RNA è desiderato, il costrutto progettato dovrebbe contenere un sito aggiuntivo restrizione specifica per trascrizione &quot;run-off&quot; a monte della sequenza HindIII. </li><li> Purificare il plasmide linearizzato con fenolo: cloroformio (1:1) estrazione e precipitazione con etanolo. Recuperare gli acidi nucleici dal risospendere pellet in acqua DEPC trattata sterile. </li><li> Impostare un in vitro T7 RNAP scappare miscela di trascrizione che contiene 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 spermidina mm, 4 mm di ogni nucleoside trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 ug / ml di digeritoplasmide e 0,1 mg / ml in acqua T7 RNAP trattata DEPC. Incubare per 3 ore a 37 ° C. </li><li> Analizzare i trascritti di RNA ottenuti su una denaturazione urea 8 M gel di poliacrilammide al 12% (Fig. 3A). I trascritti di RNA può essere purificato tramite anionico Mono Q cromatografia a scambio 13 e recuperato per precipitazione in etanolo delle frazioni di RNA e risospensione del pellet in acqua trattata con DEPC sterile. Per uso futuro, memorizzare l&#39;RNA a -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 endonucleasi test <ol><li> Impostare un 20 pl in vitro T7 RNAP scappare miscela di trascrizione (vedi 4.4) che contiene una quantità ridotta di 2 mM ATP ed è integrata da 2,5 microlitri α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purificare prodotti di reazione mediante estrazione da un gel denaturante gel urea 8 M 12% di poliacrilammide. Visualizza bande mediante autoradiografia. </li><li> Produrre e purificare le proteine ​​ricombinanti desiderate Cas. In questo esempio, CAS6 da Clostridium thermocellum stato purificato tramite precipitazione calore e Ni-NTA cromatografia. </li><li> Impostare una reazione saggio endonucleasi (ad esempio per Clostridium thermocellum Cas6, la miscela di reazione contenente 20 mM di Hepes (KOH pH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12.000 cpm RNA substrato e 1 pM enzima ed è stato incubato a 37 ° C per 30 min). </li><li> Carico 5 pl di miscela di reazione (+ 10 microlitri tampone contenente RNA carico 95% formammide) su un gel di poliacrilammide urea 8 M 12%. Visualizzare i prodotti di taglio dopo elettroforesi mediante autoradiografia. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Un esempio di RNA substrati per l&#39;analisi dell&#39;attività endonucleasi Cas è mostrata in Figura 3A. Un&#39;aliquota di 5 microlitri di una analitica 100 pl in reazione di trascrizione in vitro sono stati caricati. Notare che l&#39;efficienza della produzione di RNA varia tra diversi costrutti. Alcuni fattori di tcappello sono stati osservati per influenzare la quantità di RNA ottenuti sono (i) la sequenza iniziale dopo il 1 G richiesto per l&#39;inizio della trascrizione, (ii) la possibilità di formazione di RNA struttura durante la trascrizione e (iii) la scelta del sito di restrizione per la generazione del run-off posizione di scissione. L&#39;indagine di attività endonucleasica RNA richiede sia altamente purificata ricombinante proteine ​​Cas (Fig. 3B) e adeguati controlli negativi. Idealmente, questo campione di controllo negativo si differenzia il meno possibile dalla reazione indagato endonucleasi Cas. Ciò può essere ottenuto mediante incubazione del RNA con tampone di reazione e lisato cellulare senza Cas espressione (e seguendo la procedura di purificazione identica). Un controllo ideale negativo è l&#39;aggiunta di un deossiribonucleotide nel sito di clivaggio proposto. In figura 3C, la scissione di un 5 &#39;terminale sequenza di ripetizione etichettata viene mostrato per Clostridium thermocellum Cas6. Sotto<html> condizioni identiche, questa ripetizione non è un substrato più quando un deossiribonucleotide è introdotto nella posizione -9. Questo metodo fornisce anche informazioni sul sito di taglio. Infine, una lunga internamente pre-etichettato crRNA è tagliata da Cas6 e due frammenti di scissione sono osservati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di CRISPR / Cas attività. La rassegna segue l&#39;inserimento di una sequenza di DNA virale (protospacer) nel cluster CRISPR (adattamento), la trascrizione e la lavorazione della matrice CRISPR in crRNAs piccoli da una endonucleasi Cas6, l&#39;assorbimento di crRNAs nel complesso Cascade e l&#39;interferenza di un ripetuto attacco virale basato sulla complementarità tra crRNA e protospacer. Motivi Protospacer adiacenti (PAM) sequenze protospacer marchio virali. igura 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Generazione di RNA substrati per proteine ​​Cas. Lo schema mostra il flusso di lavoro per la generazione di (A) a lungo pre-crRNA substrati, (B) intermedio pre-crRNA substrati e (C) breve Cas RNA substrati per la pre-produzione crRNA. Sequenze di esempio sono presentati per la matrice CRISPR di Clostridium thermocellum. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Figura 3. Cas6 dosaggio endonucleasi. A.) toluidina poliacrilammide gel blu macchiato di una custom-designed oligonucleotide RNA (250 pmol) e due in vitro di RNA trascritti (5 pl di una tipica reazione di 100 pl). B.) SDS-PAGE gel di un preparato Cas6 (80 pmol) da Clostridium thermocellum dopo caloreprecipitazione a 50 ° C per 1 ora e Ni-NTA cromatografia. C.) il rilevamento di endonucleolitico Cas6 attività per 5 &#39;terminale sequenze ripetute in etichetta e alle pre-crRNA trascritti in vitro. L&#39;introduzione di un dNTP in posizione -9 abolisce Cas6 clivaggio per un breve Cas RNA substrato (S, fig. 2C). A 5 &#39;terminale 8 tag nt è generata anche per la maturazione crRNA da tempo pre-crRNA substrati (L, fig. 2A). Le bande sono stati separati su un gel denaturante 8 M urea poliacrilammide al 12% e visualizzati mediante autoradiografia.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi presentati consentono la generazione di Cas substrati endonucleasi di forcelle di dimensioni diverse e con vari libertà nel design sequenza. L&#39;approccio più straight-forward per la generazione di oligonucleotidi sintetici substrati di RNA è limitata a brevi disegni RNA causa dei costi crescenti e limitazioni tecniche nella creazione di più oligomeri RNA. Mentre riuscita sintesi di RNA è stato riportato per non modificati oligomeri RNA lunghezza di oltre 100 nucleotidi, la massima pratica ed economica per sintesi su RNA giace sotto 40 nucleotidi. Tuttavia, ogni data sequenza può essere sintetizzato e l&#39;introduzione mirata di nucleotidi modificati (ad es desossiribonucleotidi) può essere utilizzata per analizzare siti di taglio in dettaglio. Più pre-cRNA deve essere generato tramite trascrizione in vitro. La ricottura di oligonucleotidi che contengono un promotore T7 RNA polimerasi permette la produzione di lunghezza intermedia pre-CRRNCome. La lunghezza massima di routine ed economicamente oligonucleotidi di DNA sintetizzato è appena sopra 150 nucleotidi e rappresenta il massimo di sintesi pre-crRNAs tramite questo metodo. L&#39;assemblaggio di diverse coppie di DNA ricotti oligonucleotidiche che formano estremità appiccicose con l&#39;altro può estendere questa lunghezza massima ma richiede crescenti sfide nella clonazione del costrutto. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di generare pre-crRNA costrutti (e quindi Cas endonucleasi substrati) con qualsiasi sequenza desiderata. Questo consente di testare i disegni crRNA sintetici. Infine, più pre-crRNAs possono essere ottenuti da PCR amplificati di elementi interi CRISPR genomiche o in frazioni. Modifica del modello in vitro trascrizione plasmide può essere introdotto tramite mutagenesi sito-diretta per la generazione di pre-crRNA varianti. Questi costrutti possono essere utilizzati per analizzare il pattern globale cleavage endonucleolitica all&#39;interno di un interopre-crRNA. Il lavoro pionieristico per la produzione di RNA non modificato tramite polimerasi T7 RNA trascrizione in vitro è stata basata su RNA di trasferimento 14 e bromo mosaic virus RNA 15. Il consenso promotore T7 RNA polimerasi è costituito da un dominio di riconoscimento (-17 attraverso -5) e un dominio di iniziazione (-4 attraverso +6) con inizio della trascrizione in una guanosina essenziale +1 16. A valle di posizioni 1 può essere variata che consente la trascrizione di qualsiasi sequenza desiderata RNA. I metodi presentati per generare in vitro deflusso modelli trascrizione consentire sintesi in vitro di completo pre-crRNAs che corrispondono CRISPR regioni genomiche o sintetici pre-crRNA varianti. Le trascrizioni sono generati con un 5&#39;-trifosfato terminale presente a meno che la reazione di trascrizione è innescato con le GMP per ottenere 5 &#39;monofosfato termini 14. Tali termini sono necessarie se le trascrizioni devono essere etichettaticon T4 polinucleotide chinasi e γ-[32 P]-ATP. Attività di scissione Cas6 e Cas6 enzimi simili genera crRNA contenenti 5&#39;-idrossile e 2 &#39;, 3&#39;-ciclici termini fosfato. Questi RNA possono poi essere analizzate per il riconoscimento da parte del complesso Cascade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Antartico Fosfatasi </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> trifosfati in grado di trascrizione in vitro ultrapuri Nucleotide </td><td> Bioscience Jena </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografia liquida, 100 ktapurifier </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA oligonucleotidi </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA oligonucleotidi </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Maxi Kit plasmide </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> Polinucleotide Kinase T4 </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> propria preparazione </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione Mix deossinucleotidi </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN Tetra elettroforesi sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Tempesta 840 Scanner </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Deposito Phosphorscreen </td><td> Dinamica Molecolare </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion ad alta fedeltà DNA polimerasi </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> utilizzare il buffer GC </td></tr><tr><td> Blu di toluidina </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> Hartmann analitica </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

L&#39;interazione di virus e loro ospiti procariotici plasmato l&#39;evoluzione della vita batterica e archaeal. Procarioti sviluppato diverse strategie per evitare gli attacchi virali che includono la modifica restrizione, l&#39;infezione abortiva e CRISPR / Cas sistemi. Questi sistemi immunitarie che si trovano in molti batteri e la maggior parte sono costituiti da Archaea c lustered r egularly i nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) sequenze e un certo numero di C RISPR come sociated (CAS) geni (Fig. 1) 1-3. Gli insiemi differenti di proteine ​​Cas e le ripetizioni definire almeno tre principali tipi divergenti di CRISPR / Cas sistemi 4. Le proteine ​​universali CAS1 e CAS2 sono proposti per essere coinvolti nella assunzione di DNA virale chegenererà un nuovo elemento distanziatore tra due ripetizioni al 5 &#39;terminale di un cluster CRISPR estendentesi 5. L&#39;intero cluster viene trascritto in un precursore-crRNA contenente tutte distanziale e sequenze ripetute e viene successivamente elaborato da un enzima del diverso Cas6 famiglia in piccole crRNAs 6-8. Questi crRNAs consistono nella sequenza spacer fiancheggiato da una 5 &#39;terminale (8 nucleotidi) e 3&#39; terminale tag derivata dalla sequenza di ripetizione 9. Una infezione ripetuta del virus può essere bloccato come il nuovo crRNA sarà diretto da un complesso proteico Cas (Cascade) al DNA virale e identificarlo come tale attraverso la complementarità base 10. Infine, per CRISPR / Cas sistemi di tipo 1, il CAS3 nucleasi distruggerà l&#39;invasore rilevato DNA 11,12. Questi processi definiscono CRISPR / Cas come un sistema immunitario adattativo di procarioti e aperto un affascinante campo di ricerca per lo studio delle proteine ​​coinvolte Cas.La funzione di molte proteine ​​Cas è ancora sfuggente e le cause per la diversità apparente dei CRISPR / Cas sistemi restano da illuminare. Attività potenziali della maggior parte delle proteine ​​Cas sono stati previsti attraverso dettagliate analisi computazionali. Una frazione importante di proteine ​​Cas sono mostrate o proposti per funzionare come endonucleasi 4. Qui, presentiamo metodi per generare crRNAs e precursori-cRNA per lo studio di endoribonucleases Cas. Saggi di endonucleasi diversi richiedono sequenze ripetute sia brevi che possono direttamente essere sintetizzati come oligonucleotidi di RNA o sequenze più crRNA e pre-crRNA che vengono generati tramite in vitro T7 RNA polimerasi ballottaggio trascrizione. Questa metodologia permette l&#39;incorporazione di nucleotidi radioattivi per la generazione di substrati endonucleasi internamente etichettati e la creazione di crRNAs sintetici o mutante. Cas6 attività endonucleasica è utilizzato per maturare pre-crRNAs in crRNAs con 5&#39;-hydroxyl e 2 &#39;, 3&#39;-ciclici termini fosfato.

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Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / Cas sistemi mediata immunità adattativa in Batteri e Archaea. Molte proteine ​​Cas si propongono di agire come agiscono sul endoribonucleases crRNA precursori di varia lunghezza. Qui si illustrano tre diversi approcci per la generazione pre-crRNA substrati per l&#39;analisi biochimica di attività endonucleasi Cas.

Generazione Substrato per endonucleasi di CRISPR / Cas Sistemi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

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Research

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Biology

27.2K Views.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. CRISPR / Cas sistemi mediata immunità adattativa in Batteri e Archaea. Molte proteine ​​Cas si propongono di agire come agiscono sul endoribonucleases crRNA precursori di varia lunghezza. Qui si illustrano tre diversi approcci per la generazione pre-crRNA substrati per l'analisi biochimica di attività endonucleasi Cas.

Video: Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

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Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

Cancro Borealis Stomatogastric dissezione del Sistema Nervoso

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissezione lordo dello Stomaco del Gambero, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...