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1. Preparazione di piatti Cultura ECM rivestiti o coprioggetto <ol><li> Preparare soluzione di ECM sciogliendo substrato ECM in PBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Saline, Invitrogen, # 14040-133). Filtrare con un filtro a siringa 0,2 millimetri (VWR, # 28.145-495) e congelare in aliquote a -80 ° C. </li><li> Diluire soluzione di ECM in PBS alla concentrazione desiderata. Per MaxGel, diluire in DMEM (Dulbecco Modified Aquila americano, Invitrogen, # 11995-065). </li><li> Se immunofluorescenza verrà effettuata, sterilizzare 12 vetrini circolari mm (VWR, # 89015-724) per immersione in etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria. Questo dovrebbe essere fatto all&#39;interno della cappa laminare sterile. Se immunofluorescenza non verrà eseguita passare al punto 1.5. </li><li> Posto sterilizzato coprioggetti in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (Corning, # 3526). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione di substrato diluito ad ogni pozzetto della piastra da 24 pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 3 ore. </li><li> Aspirare dalla soluzione ECM e lavare threvolte posta in PBS. </li><li> Aspirare off PBS e utilizzare immediatamente o avvolti in parafilm e conservati a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. </li></ol> 2. Preparazione di strumenti di dissezione Piastre Sylgard con carbone aggiunto sono preparati secondo il protocollo del fabbricante. Lo sfondo nero resistente di queste targhe fornisce il supporto per appuntare giù l&#39;embrione e il colore offre un buon contrasto che facilita la visualizzazione dell&#39;embrione traslucido. <ol><li> Per preparare piatti pesare direttamente in un tri-versare becher su un equilibrio di parte 150 g Un liquido 15 g Parte B e 1 g di polvere di carbone (Strumenti di precisione del mondo, # SYLG184). Mescolare con un bastoncino di legno ghiacciolo o abbassalingua. Versare in vetro o plastica, 100 piatti cm. Utilizzare una piccola torcia butano tenuto circa 10 a 12 pollici sopra i piatti a bruciare eventuali bolle. Coperchi posto sulle piastre e lasciate riposare per almeno 24 ore per impostare. </li><li> Per preparare strumenti di dissezione inserire un perno Minutien (0,1 millimetri diameter) in un supporto del perno (Belle Strumenti Scientific, # # 26.002-10 e 26.018-17, rispettivamente) in alternativa 26 aghi calibro (BD, # 309.597) piegate ad angolo retto con l&#39;ausilio di pinze possono essere utilizzati come strumenti di dissezione. Affilato Student Dumont N ° 5 Pinza (Strumenti Scienza Fine, # 91150-20) con una pietra da affilatura (Belle Strumenti Scientifici, # 29008-22). </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione con il 70% di etanolo prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. Raccolta di embrioni <ol><li> Eutanasia il mouse a tempo in stato di gravidanza a 8.5 dopo coitum giorni secondo le norme di utilizzo degli animali della commissione e rimuovere utero. </li><li> Utero Mettere in un piatto di plastica Petri con PBS sterile. </li><li> Lavare utero una volta con PBS sterile. </li><li> Sotto un microscopio dissezione rimuovere con attenzione embrione da deciduas utilizzando un paio di pinze. </li><li> Rimuovere membrane extraembrionali e salvare per la genotipizzazione, se necessario. </li><li> Embrione Fase contando somiti. Le tappe ideali per rendere espianti di analizzare cellulare behAvior durante neurale elevazione volte sarebbe tra i 6 e 10 tappe somite quando le pieghe neurali hanno appena iniziato a elevare e prima della morfogenesi principale del mesenchima cranica avviene. </li><li> Lavare embrione in PBS. Mettere in un piatto nero Sylgard con DMEM che non contiene rosso fenolo (Invitrogen, # 21063-029). Rimuovere le membrane extraembrionali e salvare per la genotipizzazione, se necessario. </li></ol> 4. Preparazione di espianti <ol><li> Ridefinire il microscopio con l&#39;ingrandimento più alto possibile sopra la regione della testa dell&#39;embrione. </li><li> Fare tagli con un ago dissezione in ogni mano. Impiegare un ago per tenere il tessuto in posizione e l&#39;altra di effettuare tagli. </li><li> Tagliare la testa dell&#39;embrione anteriore ai rombomeri. </li><li> Tagliare lungo la linea mediana per tagliare in due la testa in due metà uguali. </li><li> Tagliare intorno ai margini esterni della testa e linea mediana. Questi tagli rimuoverà la cresta premigratory e ectoderma di superficie al confine esterno ela piastra precordale sulla linea mediana. Il tessuto rimanente sarà l&#39;espianto e la migrazione conterrà la cresta neurale cranica, mesoderma parassiale e ectoderma di superficie. </li><li> Quando il tessuto viene tagliato, rimuovere detriti sezionato dal piatto utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Questo modo si evita di confondere il espianto con i detriti sezionato. </li><li> Lavare delicatamente l&#39;espianto da dell&#39;uso lasciare equilibrare su e giù con una pipetta 20 pl punta e Pipetman. In questo modo rimuovere le cellule vagamente collegate e prevenire i bordi frastagliati sugli espianti. </li><li> Cautela raccogliere ogni espianto in circa 10 ml di liquido utilizzando una punta di pipetta 20 microlitri e Pipetman e posto al centro della cultura rivestito bene. </li><li> Aggiungere 20 ml di mezzo di coltura addizionato con 15% FBS a coprire l&#39;espianto. </li><li> Piastra posto in un incubatore umidificato tissutale (5% CO 2, 37 ° C) per 1-2 ore per consentire l&#39;espianto di allegare al fondo del piatto. Guarda periodicamente per assicurare che l&#39;espianto non asciugareout. </li><li> Quando l&#39;espianto è collegato, con cura aggiungere a ciascun pozzetto 250 microlitri DMEM supplementato con FBS 10% che è stato riscaldato a 37 ° C a bagnomaria. Una volta espianti hanno attaccato che non si muovano quando la piastra è leggermente scosso al microscopio. </li><li> Ritorno piatto al tessuto cultura incubatore. </li><li> Dopo 24 ore, gli espianti saranno saldamente e le cellule cominceranno a emigrare. In questo momento agenti farmacologici possono essere aggiunte al mezzo. </li><li> 48 ore dopo la placcatura, le cellule si sono migrati dalle espianti. La distanza di migrazione possono essere visualizzati e creata l&#39;immagine. Noi di solito fermare la cultura a questo punto da espianti cominciano a mostrare segni di vitalità diminuita con più lunghe incubazioni. Un colorante vitale come arancio acridina o trypan blu può anche essere utilizzato per controllare la vitalità della espianto. </li><li> A questo punto le immagini possono essere acquisite per documentare la distanza e il numero di cellule che migrano dal espianto. In alternativa, se espianti sono state piastrate su vetrini,essi possono essere fissati e analisi immunoistochimiche effettuate per visualizzare proteine ​​di interesse. </li></ol> Passaggi critici nel protocollo <ol><li> Tagliare espianti di circa la stessa dimensione. </li><li> Cancella tutti i detriti dissezione la piastra dissezione come si sta dissezione, per evitare detriti confondere con il tessuto desiderato espiantato. </li><li> Quando espianti placcatura in pozzi o su vetrini essere sicuri di mettere goccia di media con espianto nel centro di bene. </li><li> Lasciare espianto tempo sufficiente per collegare prima inondando il pozzo con i media. </li><li> Condizioni di trattamento dovrebbero essere standardizzati per ogni substrato di prova e agente farmacologico utilizzato. </li><li> Due espianti può essere fatto da ciascun embrione (uno a sinistra e uno da destra del tubo neurale). </li><li> Quando la verifica della migrazione di cellule di linee mutanti di topo in diverse condizioni sperimentali, mettere un espianto mutante nel gruppo di controllo e l&#39;altro nel gruppo trattato. </li></ol> Risoluzione dei problemi <ol><li> Se espianti non riescono a fissare, aumentare il tempo a disposizione per il fissaggio. Nella nostra esperienza, circa la metà degli espianti non attaccare e grandi espianti aderire in modo più efficiente. </li><li> Se espianti attribuiscono alla periferia del pozzo che sarà difficile immagine. Assicurarsi di posizionare espianti nel centro del pozzo. </li><li> Idealmente espianti saranno all&#39;incirca le stesse dimensioni. Tuttavia, differenze nelle dimensioni espianto può essere corretto usando il diametro degli espianti come fattore di correzione quando quanitating migrazioni di cellule da espianti. </li><li> In caso di contaminazione assicurarsi sterili condizioni di lavoro sono in uso. Tutti gli strumenti e le superfici di lavoro devono essere sterilizzati con etanolo 70%. Pipette e scatole di Petri devono essere nuovi e sterile. </li><li> Se espianti sono sempre persi durante la dissezione, periodicamente rimuovere i detriti per evitare di perdere espianto. </li><li> Padroneggiare la dissezione richiede molto tempo e ci vuole pratica. Optimal di ingrandimento, strumenti di dissezione taglienti e guida in aghi. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo applicato qui fornisce un saggio potente per esaminare il comportamento delle cellule mesenchimali del cranio. Oltre alle analisi statiche qui presentate, vivono esperimenti di imaging in campo chiaro o in combinazione con l&#39;espressione di proteine ​​marcate con GFP può essere impiegato per esaminare i comportamenti delle cellule in tempo reale mentre migrano dal espianto. Per gli esperimenti di imaging dal vivo, espianti possono essere etichettati con DiI o per differenziare migrazione di cresta neurale dal mesoderma parassiale, ROSA-YFP; Mesp1-creazione o ROSA-YFP; Wnt1-cre o altre linee transgeniche potrebbero essere utilizzati. Craniche mesenchima-ECM interazioni possono essere esaminati anche utilizzando questo test espianto. Qui si espianti piastra su substrati diversi ECM che sono presenti nel mesenchima cranica per mostrare che le cellule migrano su queste per diversi gradi e che la ECM influenza la morfologia delle cellule. Inoltre, espianti possono essere incorporati in una matrice tridimensionale di accedere i comportamenti di cells in questo contesto. Questo saggio espianto è modificabile per l&#39;analisi degli effetti di manipolazioni genetiche e farmacologiche sui comportamenti mesenchima cranici per analizzare segnali intrinseci ed estrinseci che possono regolare e modificare la migrazione. Per esempio, abbiamo utilizzato questo test nei nostri studi di discernere il ruolo di un eccesso di secrezione di Hsp90 nei comportamenti anomali cellulari in Hectd1 mesenchima mutante cranica 15. In questi esperimenti, si espianti trattati con anticorpo anti-Hsp90, Hsp90, proteine ​​geldanamicina e DMA (amelioride dimetil) per bloccare la secrezione di Hsp90 per dimostrare che il comportamento anomalo di Hectd1 cellule mutanti è dovuta all&#39;eccesso extracellulare Hsp90 15. Approcci simili potrebbe essere utilizzato per analizzare farmacologicamente percorsi aggiuntivi sottostanti morfogenesi normale o anormale del mesenchima cranica. Una volta che l&#39;analisi è stata completata, espianti e cellule migranti possono essere analizzati da una serie di metodi. Per esempio, c analisi immunoistochimicaun essere impiegato per esaminare localizzazione di proteine ​​critiche per i movimenti cellulari. Analisi trascrittomo potrebbe anche essere impiegato per determinare come trattamenti influenzare l&#39;espressione genica. Una significativa limitazione di questa tecnica è che non comportamenti modello in tre dimensioni come sarebbero verificano in vivo. Modifica del protocollo in cui sono incorporati in un espianti matrice tridimensionale (ad esempio matrigel) insieme con l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti compartimenti cellulari marcati potrebbe essere impiegato necessaria per affrontare questo problema. Anche se queste sono state eseguite, ulteriori esperimenti per correlare i comportamenti osservati in questo saggio ex vivo con quelli in vivo sarebbe necessario. Altre limitazioni includono il numero di embrioni necessari per generare numeri sufficienti per generare dati staticamente significativi. La cosa più importante, la dissezione è relativamente semplice, richiede pratica per padroneggiare.

Chiusura del tubo neurale nella regione craniale si verifica tra 8,5 giorno embrionale (E8.5) e 9,5 in embrione di topo. La mancata per chiudere correttamente il tubo neurale nei risultati testa in anencefalia, un difetto comune di nascita strutturale negli esseri umani ed è incompatibile con la vita. Le forze che guidano cefalica chiusura del tubo neurale sono generati sia dal tessuto neurale stessa e l&#39;epidermide circostante e mesenchima 3. In particolare, l&#39;espansione del mesenchima cranica è ritenuta essenziale per la elevazione della neurale cranica 1,2 pieghe. Mesenchima cranica è ricco di proteine ​​ECM in particolare proteine ​​glicosilate come proteoglicani condroitin solfato di eparina, solfati e 4-8 ialuronato. Diversamente l&#39;embrione di pollo in cui cellule della cresta neurale emigrare dal tubo neurale dorsale dopo la chiusura del tubo neurale, la cresta neurale nel topo migra al tempo stesso che le pieghe neurali iniziano a rISE (dopo la fase 5 somite). Così durante neurulazione nel topo, il mesenchima cranica è composto di cellule derivate dalla cresta neurale e il mesoderma parassiale. Cresta neurale e le popolazioni mesoderma parassiale sono indotti in momenti diversi dello sviluppo, localizzati in posizioni diverse l&#39;embrione e si sviluppano in diverse strutture 9,10. Il mesoderma parassiale nasce dalla stria primitiva e migra verso la regione anteriore dell&#39;embrione alla base della piastra neurale presuntiva. La cresta neurale è indotta a livello della giunzione della piastra neurale e ectoderma epidermico, subisce un epitelio di transizione mesenchima e delamina appena prima neurale elevazione volte nell&#39;embrione roditore. Cellule della cresta neurale migrano lungo i percorsi stereotipati del mesoderma parassiale subectodermal al arco branchiale, fronto-nasale e mesenchima perioculare. Il mesoderma parassiale contribuiranno a realizzare alcune delle ossa della volta cranica e dei muscoli della faccia e che thcresta neurale e contribuirà ad altre ossa del cranio e del viso, oltre ai nervi cranici 9-11. Il mesoderma parassiale e lignaggi della cresta neurale può essere differenzialmente segnato dalla Mesp1-cre-cre e Wnt1 linee di topi transgenici, rispettivamente 9. Il ruolo essenziale del mesenchima cranica in chiusura del tubo neurale è stato dedotto da esperimenti in cui il trattamento degli embrioni nei roditori con ECM interrompere agenti come ialuronidasi, condroitinasi ABC, heparitinase o diazo-oxo-norleucina (DON) in fase di chiusura del tubo neurale neurulazione compromessa 7, 12-14. In questi esperimenti, l&#39;analisi istologica di sezioni statiche seguito neurulazione rivelato dysmorphogeneis collegati al cranica mesenchima 7,12-14. Tuttavia, poiché l&#39;agente teratogeno avuto accesso a molteplici tessuti, rimane da determinare se il mesenchima cranica è realmente il tessuto bersaglio. A sostegno della conclusione che questo tessutoè essenziale per neurulazione, il mesenchima cranica appare anomalo su analisi istologiche in alcuni mutanti di topo con exencefalia 15-17. Ancora, nella maggior parte dei casi, l&#39;effetto della mutazione sul comportamento cellulare del mesenchima cranica non è stato affrontato. Abbiamo pensato ad un saggio espianto ex vivo per esaminare direttamente la conseguenza di mutazione genetica o manipolazione farmacologica sul comportamento delle cellule mesenchimali cranici 15. Questo dosaggio è simile a quello pubblicato da Tzahor et al 2003 per vedere il potenziale di differenziazione del mesenchima che sta alla base cranica le rombomeri 18 tranne che hanno modificato la dissezione espianto di studiare le proprietà migratori di popolazioni più anteriori di mesenchima che sono alla base del cranio neurale anteriore piastra. Il nostro metodo è anche una variante di saggi espianti eseguiti in embrione di pollo di analizzare il comportamento migratorio della cresta neurale con key differenze. Preparazioni precedenti hanno espiantato la cresta neurale o il mesoderma parassiale più posteriore 19,20. Inoltre, nel corso neurale elevazione volte nell&#39;embrione di pollo, la cresta neurale non è ancora emigrato dal tubo neurale dorsale e quindi espianti prese il mesoderma parassiale anteriore non contiene cellule della cresta neurale. Nel nostro saggio, espianti mesenchima craniche costituiti mesoderma parassiale, cresta neurale e ectoderma di superficie sono preparati e piastrate su un substrato. Manipolazione sperimentale compreso isolamento di espianti di mutanti genetici, placcatura espianti di ECM diverso o trattamenti farmacologici può essere eseguita. Cellule migrano dal espianto e la distanza, il numero e il comportamento possono essere analizzati e confrontati tra i gruppi di trattamento. Inoltre, questa preparazione è modificabile per analisi di migrazione cellulare mediante tecniche di imaging vivi. Dopo l&#39;esperimento migrazione, espianti può essere fissato e sottoposto ad analisi immunoistochimica per pelliccether chiarire l&#39;effetto dei trattamenti. Nel complesso, il protocollo qui presentato è un semplice test ex vivo per studiare il comportamento del mesenchima cranica. Come un esperimento rappresentativo, utilizziamo questo test per esaminare la migrazione di mesenchima cranica su diversi substrati extracellulari.

an explant assay for assessing cellular behavior of the cranial mesenchyme

Il sistema nervoso centrale è derivato dalla piastra neurale che subisce una serie di movimenti morfogenetici complessi causando formazione del tubo neurale in un processo noto come neurulazione. Durante neurulazione, morfogenesi del mesenchima che sta alla base della placca neurale si crede di guidare neurale elevazione volte. Il mesenchima cranica è costituito dal mesoderma parassiale e cellule della cresta neurale. Le cellule del mesenchima forma cranica un reticolo porosa composta di cellule stellate sagomati ed interconnessi matrice extracellulare (ECM) filamenti che supportano le pieghe neurali. Durante neurulazione, il mesenchima cranica subisce riarrangiamenti stereotipati con conseguente sua espansione e questi movimenti si ritiene di fornire una forza trainante per neurale elevazione volte. Tuttavia, i percorsi e comportamenti cellulari che guidano la morfogenesi cranica mesenchima ancora poco studiato. Le interazioni tra l&#39;ECM e le cellule dei cranici thes mesenchima sono alla base deicella E comportamenti. Qui descriviamo un semplice saggio ex vivo espianto ideato per caratterizzare i comportamenti di queste cellule. Questo saggio è modificabile a manipolazioni farmacologiche di sezionare la segnalazione vie di degradazione coinvolte e le analisi di imaging dal vivo per caratterizzare ulteriormente il comportamento di queste cellule. Presentiamo un esperimento rappresentativo dimostrare l&#39;utilità di questo test nel caratterizzare le proprietà migratorie del mesenchima cranica su una varietà di componenti ECM.

La comparsa di cellule migranti da espianti mesenchima craniche è mostrato in Figura 2. Abbiamo testato migrazione su vari substrati ECM che sono presenti nel mesenchima cranica durante neurulazione comprese fibronectina (100 mg / ml, Sigma # F1141), laminina (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (diluizione 1:500 in DMEM ; Sigma # E0282) e acido ialuronico (1 mg / ml, Sigma, # 53.747). Cellule non riescono a migrare dal espianto ECM quando non è presente (dati non mostrati) e tutti i substrati testati migrazione supportato delle cellule. Sia la forma e le dimensioni delle cellule che migrano dagli espianti dipende dal substrato. Questo è previsto da precedenti studi dimostrano che le forze meccaniche generate dall&#39;interazione delle cellule con diversa ECM influenzano sia la forma e le proprietà migratorie delle cellule 21. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Preparazione di espianti. (A) Per preparare espianti, E8.5 embrioni sono sezionati da deciduas e tessuti extraembrionali. (B) teste embrioni vengono sezionati dal corpo anteriore ai rombomeri. Espianti sono preparato rimuovendo il tessuto dalla linea mediana ed i bordi esterni della testa per rimuovere la piastra precordale alla linea mediana e la cresta neurale e premigratory ectoderma di superficie al confine, rispettivamente. (C) espianti sono preparati tagliando via il tessuto dai bordi della linea mediana ed esterna della testa per rimuovere la piastra precordale alla linea mediana e la cresta neurale e premigratory ectoderma di superficie dei bordi. (D) espianti sono posti in un piccolo volume di supporti sui piatti ECM rivestite / coprioggetti e fatte attaccare prima l&#39;aggiunta di più supporti. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> Figura 2. Espianti di migrazione di cellule mesenchimali cranici da espianti placcati su supporti diversi. Sono state piastrate su fibronectina, laminina, MaxGel ECM o acido ialuronico e fotografato dopo 48 ore di cultura. Bar Dimensioni = 200 mm.

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An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Il mesenchima cranica subisce movimenti morfogenetici drammatici che fornisce probabilmente una forza trainante per l&#39;elevazione delle pieghe neurali<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Qui descriviamo un semplice<em&gt; Ex vivo</em&gt; Espianto saggio per caratterizzare i comportamenti cellulari del mesenchima cranica durante neurulazione. Questo saggio ha numerose applicazioni tra cui essere suscettibili di manipolazioni farmacologiche e analisi di imaging dal vivo.

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

an-explant-assay-for-assessing-cellular-behavior-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Children's National Medical Center. Il mesenchima cranica subisce movimenti morfogenetici drammatici che fornisce probabilmente una forza trainante per l'elevazione delle pieghe neurali 1,2. Qui descriviamo un semplice Ex vivo Espianto saggio per caratterizzare i comportamenti cellulari del mesenchima cranica durante neurulazione. Questo saggio ha numerose applicazioni tra cui essere suscettibili di manipolazioni farmacologiche e analisi di imaging dal vivo.

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A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Ricerca

Biologia

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Tossicità cellulare di Nanogenomedicine in MCF-7 Linea Cell: saggio MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

Realizzazione e di funzionamento di un Inserto di ossigeno per colture cellulari aderenti

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenica saggio: cellule aderenti

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Valutare la capacità fagocitica specifica per età degli emociti di Drosophila melanogaster adulto utilizzando un in vivo Phagocitosis

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...