Questo test consente allo studente di esaminare molecole specifiche in molti processi di sviluppo, come la differenziazione cellulare e la morfogenesi impiantando le perline in regioni embrionali distinte. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi modello animale sperimentale, coltura cellulare, modello organotipico, compresi gli organoidi. Inoltre, è un utile strumento educativo per insegnare la biologia dello sviluppo di base agli studenti.
A dimostrare la procedura sarà Alexandra Gonzales-Gonzales, una studentessa universitaria del laboratorio. Per iniziare, incubare verticalmente le uova di gallina Livorno bianche fecondate con il lato appuntito verso il basso in un incubatore umidificato a 38 gradi Celsius e 70% di umidità relativa. Una volta raggiunto il 28 ° stadio, secondo Hamburger e Hamilton, rimuovere le uova dall'incubatrice, scambiarle con il 70% di etanolo e lasciarle asciugare all'aria.
Quindi disinfettare l'area di lavoro, i microscopi e gli strumenti con il 70% di etanolo. Quindi, candela le uova per identificare i vasi sanguigni e localizzare l'embrione. Scartare le uova che non hanno un embrione.
Usando l'estremità della pinza non dentata, apri una finestra toccando l'estremità smussata di un uovo e rimuovi una sezione di conchiglia di un centimetro quadrato. Quindi, trasferire l'uovo in un cartone o in un supporto di plastica e posizionarlo sotto lo stereomicroscopio. Usando una pinza chirurgica fine, rimuovere qualsiasi piccolo pezzo di guscio d'uovo che potrebbe contattare l'embrione e rimuovere la membrana dell'aria perforandola ed estraendola.
Successivamente, usando una pinza chirurgica fine, strappare leggermente il sacco amniotico, facendo attenzione a non danneggiare la vascolarizzazione della membrana corioallantoica. Mettere in scena gli embrioni in-ovo per determinare se sono nella fase desiderata. Per la preparazione del perla di eparina Affi-gel, tagliare una sezione di parafilm di forma quadrata per adattarla a una capsula di Petri da 45 millimetri.
Dopo aver posizionato il parafilm sul fondo della capsula di Petri, usando l'estremità della pinza non dentata, spingere ogni vertice e fissarlo sul fondo del piatto. Successivamente, utilizzando una pipetta o una spatola, trasferire le perline in un tubo di micro centrifuga e lavarle due volte con PBS consentendo loro di depositare e pipettare il surnatante. Quindi, utilizzando una micro pipetta, trasferire da 40 a 50 perline al centro della capsula di Petri coperta di parafilm.
Al microscopio, selezionare 30 perle di Affi-gel o eparina che hanno un diametro di 100 micrometri. Dimensionare le perline usando una terza interdigit di un embrione in 28 stadi come riferimento. Il tallone deve essere più piccolo dell'interdigit.
Dopo aver accuratamente rimosso il PBS in eccesso che circonda le perline selezionate, immergerle in due o cinque microlitri della soluzione di trattamento. Incubare le perline nella soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, per evitare che le perline si secchino, pipettare qualche goccia di PBS o acqua intorno alle perline per umidificare l'atmosfera locale e coprire il piatto con parafilm per rallentare l'evaporazione.
Versare la preparazione del tallone AG1X2. Utilizzare la spatola per trasferire le perline in un tubo di micro centrifuga e aggiungere 50 microlitri della soluzione di trattamento alla concentrazione finale desiderata. Dopo aver avvolto i tubi con un foglio per proteggerli dalla luce, incubare le perline per 20 minuti a lento scuotimento.
Dopo l'incubazione, utilizzando una pipetta, rimuovere il più possibile la soluzione di trattamento in macchia con lo 0,2% di rosso fenolo sciolto in acqua per due minuti con lieve agitazione in un vortice. Dopo la colorazione, rimuovere il colorante, quindi lavare le perline due volte in PBS per rimuovere qualsiasi colorante residuo. Successivamente, utilizzando una punta di micro pipetta, trasferire da 40 a 50 perline AG1X2 al centro della paraforma coperta di piastra di Petri e immergere le perline in cinque microlitri di PBS.
Quindi, al microscopio, selezionare circa 30 perline di 100 micrometri di diametro. Immergere le perle selezionate nella soluzione sperimentale con alcune gocce di PBS o acqua intorno alle perline per umidificare l'atmosfera locale. Coprire il piatto con parafilm per rallentare l'evaporazione.
Prima di manipolare gli embrioni, disporre due stereomicroscopi uno accanto all'altro su un banco. Quindi, usando una pinza non dentata, crea una finestra nelle uova rimanenti. Successivamente, al microscopio strappare la membrana amniotica vicino all'arto posteriore destro con una pinza chirurgica fine.
Usando una pinza fine, tenere l'embrione per la membrana amniotica per esporre l'arto posteriore destro. Quindi, usando un ago di tungsteno sottile, fai un buco centrato nel più distale della terza interdigit dell'arto posteriore. Senza rilasciare l'embrione e l'arto posteriore esposto, prendi una perla trattata dall'altro microscopio usando una delle punte della pinza.
La pinza deve essere aperta affinché una perla aderisca alla sua punta. Trasferire la perla nell'embrione di pulcino vicino all'arto posteriore, posizionandolo sopra il foro interdigit. esercitare pressione sul tallone chiudendo la pinza fino a quando non entra nel foro.
Quindi rilasciare l'embrione, sigillare la finestra del guscio d'uovo con del nastro adesivo e riportare le uova all'incubatrice fino a quando non hanno raggiunto lo stadio richiesto. Per garantire l'efficacia del test, il tallone deve essere posizionato in modo coerente e preciso nella posizione corretta. In questo studio, il tallone imbevuto è stato posto nel più distale del terzo interdigit sotto la cresta ectodermica apicale.
Gli embrioni possono essere colorati con blu oceano e rosso alizarina per evidenziare la formazione di elementi scheletrici e valutare gli effetti sulla differenziazione cellulare. Questo test è anche adatto per valutare la morte cellulare con il rosso neutro e la regolazione genica, acquistando l'ibridazione C2. Il vantaggio principale di questo strumento sperimentale è quello di controllare il tempo e la posizione delle perle imbevute.
La combinazione del posizionamento del nucleo con tempi di sviluppo precisi offre enormi possibilità per studiare i processi di differenziazione cellulare.
