Vorremmo riconoscere che questa tecnica è stata originariamente descritta da Sparta et al., 2012 ed è stato facilmente adattato per l&#39;uso nel nostro laboratorio.

* Tutti i materiali insieme a rispettivi produttori e / o fornitori sono elencati di seguito il protocollo. 1. Assemblaggio di impianto <ol><li> Preparare una miscela di calore epossidica induribile fibra ottica aggiungendo 100 mg di catalizzatore a 1 g di resina. </li><li> Misurare e tagliare circa 35 mm di 125 micron in fibra ottica da 100 micron nucleo segnando con un cuneo scriba punta in metallo duro. Posizionare la perpendicolare scriba alla fibra ottica e punteggio in un unico movimento unidirezionale. Tagliare la fibra completamente danneggiare il nucleo della fibra. </li><li> Inserire una ceramica LC capocorda con un 127 micron hanno sostenuto nel vizio, parte convessa rivolta verso il basso. </li><li> Inserire la fibra ottica nella ghiera. La fibra ottica deve scorrere agevolmente e marginalmente sporgono oltre l&#39;estremità della ferrula convessa (Figura 1a). </li><li> Applicare una goccia di calore-curable epossidica fibra ottica fino alla fine piatto e calore con pistola termica fino epossidica diventa nero. La resina epossidica dovrebberiempire la ferrula come è riscaldata e prima della polimerizzazione. La resina epossidica dovrebbe curare entro ~ 1 minuto di applicazione di calore costante. </li><li> Eliminare eventuali epossidica lungo i lati della ghiera, come sarà ostruire interfacciamento con l&#39;accoppiatore. </li><li> Lucidare l&#39;estremità convessa della boccola con un disco di lucidatura fibra ottica LC (FOPD) su fogli di ossido di alluminio lucidatura sul cuscinetto di lucidatura (Figura 1b). Crea modelli di rotazione circolari e lucidare su quattro gradi nel seguente ordine: 5, 3, 1 0,3 micron grana. </li><li> Tagliare la fibra ottica al termine piatta alla lunghezza appropriata in modo tale che si rivolge alla regione di interesse. La lunghezza può essere determinata utilizzando l&#39;atlante stereotassico. </li><li> Testare l&#39;impianto collegandolo al laser tramite il cavo accoppiatore descritto di seguito. La fine del lucido impianto viene inserito nel manicotto dell&#39;accoppiatore e deve entrare in contatto diretto con il puntale avversaria. L&#39;impianto dovrebbe essere in grado di mantenere 10 mW di luce emessa, misurato alla punta di the fibra dell&#39;impianto. Un impianto bad avrà un punto debole focale vicino alla punta della fibra ottica. </li><li> Conservare gli impianti finiti (Figura 1c) in schiuma fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Assemblea di cavo di fibra ottica accoppiatore <ol><li> Preparare una miscela di calore epossidica induribile fibra ottica come sopra. </li><li> Misurare e tagliare un congruo spazio di 220 micron in fibra ottica da 200 micron nucleo segnando con un cuneo scriba punta in metallo duro. La lunghezza della fibra dovrebbe consentire il mouse per muoversi liberamente nel contenitore, ma non consentono il mouse per masticare attraverso la fibra. </li><li> Inserire la fibra ottica in un tratto di tubo di sfioccamento leggermente più lungo della lunghezza della fibra ottica. Il tubo deve avere un diametro interno leggermente maggiore rispetto alla fibra ottica. </li><li> Strip ~ 25mm ad una estremità della fibra ottica e inserirlo nell&#39;estremità di un metallo MM Multimode FC Virola Assembly con 230 micron foro fino all&#39;arresto. La fibra ottica deve sporgere attraverso il ferruLe estremità (Figura 2a). </li><li> Fissare il collegamento con cianoacrilato (colla super) alla fine metallo. Coprire il collegamento con un connettore di avvio e lucidare l&#39;estremità con un puntale FOPD FC. Crea modelli di rotazione circolari e lucidare su quattro gradi nel seguente ordine: 5, 3, 1, 0.3 micron grana (Figura 2b). </li><li> Striscia e inserire l&#39;altra estremità della fibra ottica in ceramico LC ghiera (230 um id foro) con l&#39;estremità distale convessa. Applicare una goccia di resina epossidica per l&#39;estremità piatta e riscaldare fino guarito. </li><li> Lucidare l&#39;estremità della ferrula convessa utilizzando un FOPD FC su fogli di ossido di alluminio lucidatura come descritto sopra. </li><li> Far scorrere un manicotto LC boccola sull&#39;estremità convessa della boccola fino al punto medio del manicotto. </li><li> Inserire una guaina termoretraibile sopra il tubo e il manicotto forcazione e calore per assicurare e proteggere la connessione (Figura 2c). </li><li> Testare l&#39;accoppiatore collegandolo alla sorgente laser e misurando la luce output attraverso l&#39;accoppiatore con uno spettrofotometro. La perdita di luce tra l&#39;uscita e l&#39;uscita laser accoppiatore misurata non deve superare il 30%. </li></ol> 3. Impianto chirurgico * Si tratta di una sola procedura di consigli. Gli strumenti sono sterili, ma i guanti non hanno bisogno di essere a causa della manipolazione costante tra gli strumenti e le attrezzature. <ol><li> Anestetizzare il mouse con una iniezione intraperitoneale ketamina / Xilazina miscela di 100 e 10 mg / kg, rispettivamente usando un ago da 30 gauge. </li><li> Shave il cuoio capelluto con Clippers. Pulire il cuoio capelluto con il 70% di alcool isopropilico seguito da Betasept wipe (soluzione di clorexidina al 4%) per due minuti, ripetendo una volta. </li><li> Posizionare il mouse nella rig sterotaxic e bloccare la testa, in modo che il cranio sia a livello. Applicare pomata oftalmica per gli occhi per prevenire la secchezza e il dolore post-operatorio. Mantenere l&#39;anestesia con isoflurano volatilizzato (1-3% diluito con ossigeno a seconda dello stato fisiologico del mouse, che deve essere continuamente monitorate da risposta ad una presa di coda). </li><li> Praticare un&#39;incisione attraverso la linea mediana del cuoio capelluto, esponendo il cranio dalle orbite oculari per lambda. Spingere da parte del tessuto connettivo, se necessario. </li><li> Utilizzare pinze Serafin per tenere indietro la pelle e mantenere un accesso al cranio (Figura 3a). </li><li> Etch un motivo a scacchi in tutta la superficie del cranio con uno strumento apposito. Lavare via i residui con soluzione salina sterile. Asciugare con cura. </li><li> Applicare il perossido di idrogeno (3%) al cranio esposto con un batuffolo di cotone per ~ 2-3 secondi per creare micropori. Lavare più volte e asciugare accuratamente. In alternativa, possono ancore essere avvitata nel cranio, come descritto in Sparta et al. (2012). </li><li> Anche in questo caso, incidere un motivo a scacchi in tutto il cranio con uno strumento apposito e lavare via i residui con soluzione fisiologica. Asciugare con cura. </li><li> Utilizzando un utensile rotante, fare un piccolo foro bava craniotomia (&lt;1 mm di diametro) con una punta sterile(Autoclave) sopra la regione di interesse, determinato dal atlante stereotassico calibrata bregma e lambda. Fare attenzione a non rompere la dura madre o danneggiare qualsiasi tessuto. Lavare via i residui e asciugare accuratamente. </li><li> Inserire la ghiera fibra ottica (impianto) nel supporto sonda e collegare al braccio stereotassico. </li><li> Posizionare l&#39;impianto in posizione direttamente sopra la regione di interesse utilizzando il braccio stereotassico (Figura 3b). Se si inserisce la fibra ottica nel tessuto cerebrale, la fibra deve essere avanzato lentamente ad una velocità di circa 2 mm / min. La ghiera deve poggiare sul cranio rimanente. </li><li> Preparare una miscela di cemento dentale. La miscela deve avere una viscosità sufficientemente bassa per applicare facilmente attraverso il cranio. Miscela sarà utilizzabile per 2-4 min. </li><li> Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, applicare un sottile strato di cemento dentale attraverso il cranio e sulla parte inferiore dell&#39;impianto. Lo strato di base del cemento dentale dovrebbe coprire superficie tanto sul cranio comepossibile. Non lasciare che il cemento dentale venire a contatto con la pelle del topo. Questo porterà a maggiore difficoltà nel suturare così come irritazione al mouse. Se il cemento dentale viene a contatto con la pelle, lasciare asciugare parzialmente tale che l&#39;intero strato di cemento può essere rimosso prima impostazione. </li><li> Lasciare asciugare completamente. </li><li> Applicare anche strati di cemento dentale in modo da formare un piccolo tumulo sul cranio e intorno alla protesi, permettendo ad ogni strato si asciughi completamente (Figura 3c). Lasciare ~ 3-5 mm dell&#39;estremità convessa della ferrula pulita di cemento per consentire un agevole, collegamento senza ostacoli. </li><li> Suturare il cuoio capelluto sopra il tumulo di cemento dentale e intorno all&#39;impianto utilizzando sterili, monouso suture di seta intrecciati (6-0) con un ago C22. Rimuovere dopo 7 giorni. Opzionale: Bond Vet uso per il legame aggiuntivo dopo sutura. Assicurarsi di utilizzare Obbligazioni minima Vet. In eccesso può portare a gravi danni alla pelle a causa di graffi. </li><li> IMMEDIATAMENTEy dopo la chirurgia, mouse dovrebbe essere iniettati sottocute con Ketprophen (5 mg / kg) per ridurre il dolore postoperatorio. Questo dovrebbe essere ripetuta dopo 24 h. Applicare analgesici topici (Bupivicaine) e antibiotici (Neosporin) alla pelle suturata e intorno alla base dell&#39;impianto. </li><li> Posizionare il mouse in una gabbia su una coperta termica per il recupero dall&#39;anestesia. Posizionare il mouse in un contenitore sterile, gabbia di recupero post-operatorio. La gabbia di recupero non deve contenere lettiera per mantenere la temperatura ed evitare asfissia. Il mouse può essere restituito alla gabbia originale o una nuova gabbia una volta sveglio. </li></ol> Corretto montaggio dell&#39;impianto fibra ottica e risultati accoppiatore in minima perdita di fotoni tra la sorgente luminosa e l&#39;estremità della fibra ottica nella regione di interesse. Ben lucidate fibre ottiche deve trasmettere la luce in modo uniforme, cerchi concentrici (figura 2d). Con l&#39;impianto attento e sutura, l&#39;impianto non provoca irritazioni visibili ail mouse e può rimanere in posizione per studi a lungo termine (figura 3D,&gt; 1 mese, osservazioni non pubblicate) senza alcuna degradazione significativa della fibra ottica o la quantità di luce trasmessa. Impiantazione improprio o sutura può causare irritazione e può comportare il mouse graffiare attraverso la cute, esponendo il cemento dentale, o la rottura della ghiera dal cemento dentale a causa della manipolazione persistente. Un diagramma schematico del sistema assemblato può essere visto in Figura 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> Figura 1. Assemblea delle fibre ottiche impiantabili. (A) La fibra ottica è inserito nella boccola, leggermente sporgente oltre l&#39;estremità convessa indicata dalla freccia. (B) L&#39;estremità convessa della boccola viene lucidata con una FOPD sulla qualità progressivamente più sottili fogli di lucidatura. (C) La clausola finito fibra impiantabileic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> Figura 2. Assemblea di fibra ottica accoppiatore utilizzato per legare la fibra ottica giunto rotante all&#39;impianto. (A) incollaggio a fibre ottiche attraverso il gruppo ghiera. (B) Il lato ghiera del gruppo è inserito nei gradi FOPD e lucidati usando progressivamente più sottili di carta lucidatura. (C) Il manicotto ghiera è montato sul puntale e fissato con guaina termorestringente. (D) L&#39;accoppiatore fibra ottica finito dovrebbe produrre una luce concentrica con perdita minima fotone. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> Figura 3. Impianto chirurgico le fibre ottiche. (A) L&#39;intera superficie del cranium è esposta e tessuto connettivo è azzerato. (B) L&#39;impianto fibra ottica viene tenuto in posizione con il braccio stereotassico. (C) il cemento dentale viene applicata la protesi fissa in fibra ottica al cranio. (D)&gt; 1 mese dopo l&#39;impianto, la guarigione della pelle attorno all&#39;impianto e non ci sono segni di irritazione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> Figura 4. Schema del sistema funzionale

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2.">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li><li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li><li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking.">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall.">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li></ol>

Optogenetics è una tecnica nuova e potente che consente il controllo senza precedenti su specifici sottotipi neuronali. Ciò può essere sfruttato per modulare circuiti neurali con precisione anatomica e temporale, evitando il tipo cellulare e indiscriminata effetti invasivi di stimolazione elettrica attraverso un elettrodo. L&#39;impianto di fibre ottiche permette di coerenza, stimolazione cronica dei circuiti neurali più sessioni in sveglio, comportandosi topi con il minimo danno al tessuto. Questo sistema, originar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> LC Ferrule Sleeve </td><td> Prodotti in fibra di precisione (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1,25 millimetri ID </td></tr><tr><td> FC MM pre-assemblato Connettore </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 micron Ferrule </td></tr><tr><td> Miller FOPD LC-Disc </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> Per LC ghiere </td></tr><tr><td> Forcazioni tubo </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 micron od, 250 id pm </td></tr><tr><td> MM LC Stick Virola 1,25 millimetri </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> ID 127 micron Diametro </td></tr><tr><td> MM LC Stick Virola 1,25 millimetri </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 micronID Alesaggio </td></tr><tr><td> Calore epossidica induribile, e resina indurente </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC e SC / PC Disk lucidatura connettore </td><td> Thorlabs </td><td> D50-FC </td><td> Per FC ghiere </td></tr><tr><td> Potenza ottica digitale e contatore di energia </td><td> Thorlabs </td><td> PM100D </td><td> Spettrofotometro </td></tr><tr><td> Lucidatura Pad </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 Durometro </td></tr><tr><td> Ossido di alluminio (Lappatura Lucidatura) Fogli: 0.3, 1, 3, 5 micron graniglie </td><td> Thorlabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> Standard Fiber Rivestimento duro Multimodale </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> Basso OH, 200 core micron, 0,37 NA </td></tr><tr><td> Fibra Stripping Tool </td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> Clad / Coa: 200 micron / 300 micron </td></tr><tr><td> SILICA / SILICA fibra ottica </td><td> Polymicro Technologies </td><td> FVP100110125 </td><td> High-OH, UV avanzata, 0,22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 misto a fibre ottiche Rotary </td><td> lenti doriche </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Mono Cavo adattatore a fibre ottiche </td><td> lenti doriche </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Le guaine termorestringenti, 1/8 di pollice </td><td> Allied Electronics </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> Pistola di calore </td><td> Allied Electronics </td><td> 972-6966 </td><td> 250 W, 750-800 ° F </td></tr><tr><td> Cotone punta applicatori </td><td> Puritan Medical Prodotti </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> Tessuto adesivo VetBond </td><td> Fischer Scientific </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> Flash protesi base acrilica </td><td> Yates Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> BONN Miniature Iris Forbici </td><td> Miltex Integra </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8,9 centimetri), dritte, 15 lame di diametro </td></tr><tr><td> Johns Hopkins Bulldog Morsetto </td><td> Miltex Integra </td><td> 7-290 </td><td> 1-1/2 &quot;(3,8 cm), curvo </td></tr><tr><td> MEGA-Torque elettrico Lab motore </td><td> Vettore </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> Panther Frese-Ball # 1 </td><td> Clarkson Laboratorio </td><td> 77,1006 </td><td></td></tr><tr><td> Violet Blue Laser System </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> Lunghezza d&#39;onda: 473 nm </td></tr><tr><td> Laser Alimentazione </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 2 Pinze per laminectomia </td><td> Fine Scienza Strumenti </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;Hemostat Etero </td><td> EXCELTA </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> Morsa con base appesantita </td><td> Altex Elettronica </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue

Modelli chiarire di connettività neuronale è stata una sfida sia per clinica e di base delle neuroscienze. Elettrofisiologia è stato il gold standard per l&#39;analisi dei modelli di connettività sinaptica, ma accoppiati registrazioni elettrofisiologiche possono essere sia ingombrante e sperimentalmente limitante. Lo sviluppo di optogenetics ha introdotto un metodo elegante per stimolare i neuroni e circuiti, sia in vitro che in vivo 1 e 2,3. Sfruttando cellula-tipo di attività specifica promotore per guidare l&#39;espressione opsin in discrete popolazioni di neuroni, si può stimolare con precisione geneticamente definiti sottotipi neuronali distinti circuiti 4-6. Metodi ben descritti per stimolare neuroni, compresi stimolazione elettrica e / o manipolazioni farmacologiche, sono spesso del tipo cellulare indiscriminata, invasivo, e può danneggiare i tessuti circostanti. Queste limitazioni possono alterare la normale funzione sinaptica e / o di comportamento del circuito. Inoltre, a causaalla natura della manipolazione, i metodi attuali sono spesso acuta e terminale. Optogenetics offre la capacità di stimolare i neuroni in modo relativamente innocuo, e nei neuroni geneticamente mirati. La maggior parte degli studi riguardanti optogenetics in vivo attualmente utilizza una fibra ottica guidato attraverso una cannula impiantata 6,7, tuttavia, le limitazioni di questo metodo includono tessuto cerebrale danneggiato con inserimento ripetuto di una fibra ottica, e una possibile rottura della fibra all&#39;interno della cannula. Dato il campo in rapida crescita della optogenetics, un metodo più affidabile di stimolazione cronica è necessaria per facilitare studi a lungo termine con il minimo danno tissutale collaterali. Qui forniamo il nostro protocollo modificato come video articolo per integrare il metodo efficace ed elegantemente descritto in Sparta et al. 8 per la realizzazione di un impianto in fibra ottica e la sua fissazione permanente sul cranio di topi anestetizzati, così come l&#39;assemblaggio del fibraaccoppiatore ottico collega l&#39;impianto di una fonte di luce. L&#39;impianto, collegato con fibre ottiche ad un laser a stato solido, permette un metodo efficiente per photostimulate cronicamente funzionale circuiteria neuronale con danno tissutale meno 9 utilizzando piccoli, staccabili, cavezze. Fissaggio permanente degli impianti in fibra ottica provvede a mantenere a lungo termine in vivo studi optogenetic di circuiti neuronali in Svegliatevi, topi si comportano 10 con minimo danno tissutale.

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Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Lo sviluppo di optogenetics ora fornisce i mezzi per stimolare i neuroni geneticamente definiti con precisione e circuiti, sia<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt;. Qui si descrive il montaggio e l&#39;impianto di una fibra ottica per fotostimolazione cronica del tessuto cerebrale.

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

44.4K Views.  Baylor College of Medicine (BCM). Lo sviluppo di optogenetics ora fornisce i mezzi per stimolare i neuroni geneticamente definiti con precisione e circuiti, sia In vitro E In vivo. Qui si descrive il montaggio e l'impianto di una fibra ottica per fotostimolazione cronica del tessuto cerebrale.

Video: Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

La combinazione di stimolazione magnetica transcranica e fMRI per esaminare il modo predefinito della rete

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Ricerca

Neuroscienze

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Utilizzo del Theta Burst protocollo Esplora Mechasnism di plasticità in individui con Sindrome X Fragile e autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

Stato-dipendenza Effetti sulla TMS: uno sguardo al comportamento Motive fosfene

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

Il dispositivo TMS NeuroStar: Condurre la FDA ha approvato protocollo per il trattamento della depressione

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Microelettrodo guidata impianto di elettrodi nel subtalamico Nucleo di Ratti per lungo termine stimolazione cerebrale profonda

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...