Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Drug Abuse (NIDA) Sovvenzione R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative di Grant Seed (DCC), e NIDA borsa di formazione T32 DA017637 (MVB).

1. Virus Conservazione e preparazione <ol><li> L&#39;utilizzo di vettori AAV replicazione incompetente per la consegna di geni opsin al cervello dei roditori è approvato per la Biosicurezza Livello 1 (BSL-1) e richiede un&#39;adeguata protezione e procedure di gestione, come indicato nella pubblicazione governo degli Stati Uniti, biosicurezza in Microbiologia e laboratori biomedici, disponibile all&#39;indirizzo il Centers for Disease Control sito a ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> Al fine di evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo, virus pipetta dal flacone del produttore in aliquote di lavoro più piccoli in un biosicurezza Gabinetto e negozio di classe II in una -80 ° C freezer. </li><li> Prima di iniezione stereotassica, permettono una aliquota di scongelare il ghiaccio e poi girare brevemente verso il basso con una centrifuga da banco. </li><li> Lentamente reinterro una siringa Hamilton vetro e ago con una piccola quantità di silicone o olio minerale.Assicurarsi che non vi siano bolle d&#39;aria visibili nella siringa. Inserire la siringa in una pompa microinjector e collegare la pompa direttamente al braccio stereotassico verticale (cioè manipolatore stereotassico). </li><li> Abbassare il braccio stereotassico finché la punta dell&#39;ago tocca il fondo della provetta aliquota virus. Utilizzare il controller per la pompa microinjector di ritirare il volume desiderato del virus (1,5 microlitri per una iniezione di 1 ml). </li><li> Tutti i materiali e le superfici che vengono a contatto con il virus devono essere decontaminati con un disinfettante, come candeggina (10%). </li></ol> 2. Chirurgia e Virus iniezione <ol><li> Anestetizzare animale con un ketamina (ratto, 125 mg / kg, ip) - xylazina (ratto, 10 mg / kg, ip) cocktail. Per misurare l&#39;efficacia dell&#39;anestesia, verificare la presenza di una risposta riflessa di un pizzico punta e dare dosi supplementari di ketamina, se necessario. Utilizzando metodi chirurgici standard di asepsi, posizionare animale in un apparato stereotassico (David Kopf Instruments). </li><li> Effettuare una incisione mediana attraverso la pelle sulla parte superiore del cranio animale con piccole forbici chirurgiche o bisturi. Separare delicatamente tessuto connettivo e pulire la parte superiore del cranio con un piccolo raschietto osso. </li><li> Verificare che la testa dell&#39;animale è livello tale che l&#39;coordinate z per bregma e lambda sono uguali. Determinare le coordinate stereotassica per l&#39;area del cervello bersaglio da un atlante del cervello come il cervello di ratto in Stereotassica coordinate (George Paxinos e Charles Watson, Academic Press, 2007) o The Brain Mouse in Stereotassica coordinate (Keith BJ Franklin e George Paxinos, Academic Press , 2007). Segnare il sito previsto di iniezione con una penna chirurgico. </li><li> Attenzione sottile il cranio sopra l&#39;area di destinazione utilizzando un trapano a mano e fermarsi quando la punta del trapano raggiunge il fondo del cranio. Usando un paio di pinze extra fine, togliere l&#39;osso assottigliato in modo da esporre la dura. </li><li> Posizionare l&#39;ago della siringa sul bersaglio sonouna e abbassare l&#39;ago finché non tocca la dura Utilizzando questo punto per calcolare la coordinata z. Molto lentamente abbassare l&#39;ago iniezione nel cervello fino al raggiungimento della posizione corretta z. In questo protocollo, la regione prelimbic della corteccia prefrontale mediale (2,7 millimetri anteriore al bregma, ± 0,5 mm lateralmente alla linea mediana, e -2.2 mm dalla dura) o il subiculum dorsale (-6.0 mm anteriore al bregma, ± 3,0 millimetri laterale alla linea mediana, e -2.0 mm dalla dura) si rivolge in un Sprague Dawley ratto maschio (ca. 275 g) per adulti. </li><li> Iniettare virus ad una velocità di 0,1 ml / min. Dopo l&#39;iniezione viene completata attendere 10 min prima dell&#39;estrazione dell&#39;ago per evitare il riflusso del virus alla superficie del cervello. </li><li> Utilizzare una sutura cucitura con ago per sigillare la pelle e applicare antibiotici per la ferita. </li><li> La durata di ChR2 e NpHR espressione funzionale da vettori AAV varierà a seconda del disegno sperimentale e titolo virale. Per questo esperimento, in vivo </em&gt; registrazioni sono state effettuate iniezione 18-21 giorni dopo. </li></ol> 3. Consegna luce e in vivo la registrazione di ChR2 o neuroni NpHR esprimono <ol><li> Collegare un elettrodo di tungsteno (~ 1-1,5 mW, micropali) per un tubo capillare di vetro (Fisher Scientific) utilizzando colla super. </li><li> Utilizzare uno strumento in fibra di stripping (Thorlabs) per esporre la fine nudo di una fibra ottica multimodale (200 nucleo micron di diametro, Thorlabs) e punta in fibra pulito con etanolo. Molto leggera segnare punta della fibra con un coltello di diamante a forma di cuneo (Thorlabs) e rimuovere con cautela la fibra in eccesso (ad esempio con una pinza sottile). La fibra deve fendere facilmente il punteggio. </li><li> Collegare l&#39;estremità FC della fibra al connettore PC sulla porta di uscita di un laser 200 mW singolo diodo ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) con la lunghezza d&#39;onda desiderata. Assicurarsi che adeguato occhiali protettivi è indossato in ogni momento quando si lavora con il laser. </li><li> Misurare la lintensità aser sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza ottica ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Per registrazioni in vivo, intensità luminosa soli 20-100 mW / mm 2 può evocare affidabile ChR2-o attivazione o silenziamento NpHR-mediata, rispettivamente, di attività neuronale. </li><li> Inserire la fibra ottica nel tubo capillare. Posizionare la punta della fibra a circa 500 micron sopra la punta di elettrodo di tungsteno e legare un filo di sutura sottile due volte in alcuni punti vicino alla punta in modo che l&#39;elettrodo e la fibra sono dritti. Assicurarsi che la distanza tra la punta dell&#39;elettrodo ed il nodo più vicino è abbastanza lungo per inserimento nella regione bersaglio. </li><li> Preparare l&#39;animale come nei passi 2.1 e 2.2 di cui sopra. Utilizzare la craniotomia iniziale come una guida per fare una nuova piccola finestra pulita nel cranio per il posizionamento della optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Fai una piccola incisione sul dura utilizzando un ago sottile. </li><li> Abbassare con cautela il optrode attraverso la finestra cranio e il cervello alla regione trasdotte con un micromanipolatore (Narishige). Poi avanzare la optrode lentamente in 10-50 micron passi fino alla nascita di una cellula di luce-reattiva. </li><li> L&#39;interfaccia utente del software personalizzato (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) scritto in LabVIEW (National Instruments) viene utilizzato per controllare il laser singolo diodo e di visualizzare e registrare l&#39;attività neurale in corso. Segnali registrati vengono catturati con un passa-banda Examp-20K (Kation scientifico) amplificatore filtrato (0,3-8 kHz), e un analogo National Instruments alla scheda digitale (NI USB-6009). L&#39;interfaccia utente NeuroLux Pro permette la scelta di ingressi analogici (scegliere due canali per l&#39;neuronale e segnale TTL) e l&#39;uscita digitale. L&#39;utente può definire la frequenza di campionamento (20 kHz), il periodo di riferimento (pre-light), e il periodo post-luce. L&#39;utente può definire il laser stimulati TTLsulla larghezza di impulso, frequenza e il periodo di stimolazione (se la frequenza è di 20 Hz e la stimolazione periodo è di 500 msec, 10 impulsi laser con larghezza di impulso definito vengono consegnati). L&#39;utente può anche scegliere la consegna luce continua (ad esempio, la figura 1). Per le registrazioni ripetute, l&#39;utente può anche definire il numero di treni di impulsi e l&#39;intervallo tra i treni. I dati possono essere acquisiti con o senza registrazione su disco. </li><li> A seguito della rilevazione, gli animali sono anestetizzati con il cocktail di ketamina / xilazina e transcardially perfusi con soluzione salina fisiologica e paraformaldeide (4%) per verificare il posizionamento optrode ed espressione opsin. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Una vasta gamma di tecniche sono disponibili per il targeting geneticamente geni microbici opsin di regioni cerebrali distinte nei roditori. Consegna del gene virale fornisce un approccio relativamente poco costoso e veloce per mediare l&#39;espressione ChR2 e NpHR con la cellula di tipo specificità. Sistemi di vettori AAV sono una scelta comune per esperimenti optogenetic a causa di titoli di produzione elevati che rimangano stabili durante la conservazione, la sua mancanza di patogenicità, e la sua capacità di produrre l&#39;espressione genica a lungo termine 10. Molti dei costrutti opsin con specifici promotori cellula-tipo sono disponibili in commercio in una vasta gamma di sierotipi di AAV dal vettore servizi fondamentali come l&#39;Università della Pennsylvania ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) o l&#39;Università of North Carolina a Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Uno svantaggio di tecnologia AAV rappresenta l&#39;capacità limitata imballaggio (~ 4,7 kb), che pone una limitazione alla dimensione cassetto transgene che può essere utilizzato per il targeting cellule specifiche. In alternativa, vettori lentivirali, che hanno una grande capacità di confezionamento, sono in grado di accogliere opsin destinati sotto il controllo di sequenze promotrici grandi. L&#39;uso di un optrode consente il rilevamento affidabile dei segnali elettrofisiologici in combinazione con consegna luce temporalmente preciso. Come descritto sopra, tuttavia, sufficiente attenzione è necessaria nella sua costruzione. Poiché la fibra ottica spaccati è fragile, legare il filo di sutura troppo stretto può causare la rottura della fibra. Anche se il optrode può essere utilizzato per diverse registrazioni, l&#39;elettrodo e fibra ottica devono essere puliti (o manualmente spaccati in caso di fine nuda fibra ottica) prima dell&#39;inserimento perché l&#39;impedenza dell&#39;elettrodo e la qualità della luce erogata degraderà con l&#39;uso ripetuto. Durante eleregistrazioni ctrophysiological è importante che il optrode essere avanzato lentamente. Il optrode qui utilizzato ha circa 350 micron di spessore (elettrodo di tungsteno: 125 micron; nucleo della fibra ottica: 200 pm) e abbassandolo veloce potrebbe portare al movimento del tessuto cerebrale. Manufatti Light-indotte potrebbero anche essere considerate con particolare registrazione e consegna della luce set-up 11-12. Anche se abbiamo trovato nessun artefatto indotto dalla luce nelle nostre condizioni sperimentali, registrazioni di fuori dell&#39;area cervello trasdotte possono potenzialmente essere utilizzati come controllo per manufatti leggeri. Un&#39;altra considerazione durante il processo di registrazione è l&#39;intensità luminosa necessaria per osservare i cambiamenti in ChR2-o NpHR esprimono i neuroni, soprattutto per lunghe registrazioni durata. Forte intensità del laser e lungo illuminazione laser potrebbe causare il danno ai tessuti e / o una diminuzione della risposta successiva luce emesso 12-13. Per la sperimentazione comportamentale è richiesto l&#39;uso di un vettore virale controllo per eliminating alcun effetto a causa del calore emesso dalla fibra. Per molti dei costrutti optogenetic disponibili in commercio esistono costrutti complementari di controllo in cui la sequenza genica opsin è stato rimosso. Va notato che progettato ChR2 varianti con migliorate proprietà cinetiche e sono stati sviluppati insieme ad altri opsins silenziamento che potrebbero essere più adatti per determinate domande sperimentali 14-15. Ad esempio, una nuova variante ChR2 stabilito tramite mutagenesi mirata, definito &quot;Cheta&quot;, può guidare ad alta fedeltà chiodare neuronale a frequenze (almeno fino a 200 Hz), superiore a quello dell&#39;originale ChR2 14. La combinazione di in vivo fornitura di luce e la registrazione simultanea di risposte neuronali è un passaggio fondamentale per stabilire relazioni causali tra l&#39;attività modellato in popolazioni di cellule geneticamente mirati e manifestazioni comportamentali corrispondenti a tempo bloccato. Le procedure e le hardware qui delineato fornire un approccio semplice per optogenetics attuazione per in vivo registrazioni testa-fisso nei roditori.

La possibilità di attivare o tacere un tipo cellulare specifico all&#39;interno di un circuito neurale in modo temporalmente preciso è fondamentale per capire come i circuiti neurali elaborano differenti tipi di informazioni sottostanti emozione e cognizione. Controllo sperimentale sulle attività neurale intatta ha impiegato strumenti loss-/gain-of-function (ad esempio, la stimolazione elettrica, modulazione farmacologica, lesione) che non forniscono la necessaria selettivo per il controllo di specifiche popolazioni di neuroni, sia su scala temporale o spaziale. Affrontando direttamente queste sfide tecnologiche, lo sviluppo e l&#39;applicazione di strumenti sensibili alla luce geneticamente codificabili ha permesso neuroscienziati per controllare l&#39;attività elettrica di selezionare i tipi cellulari durante le manifestazioni comportamentali ben definiti. Molte di queste proteine ​​fotosensibili sono di origine microbica, con il canale di luce-dipendenti catione, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, e la pompa cloruro luce-driven, halorhodopsin (NpHR) 2,3, in uso diffuso. Uno dei principali vantaggi di optogenetics è la capacità di geneticamente bersaglio specifico popolazioni cellulari in regioni cerebrali eterogenei e la tecnica è stata applicata con successo ad un numero di organismi modello (invertebrati a primati non umani) 4-6. Molti animali transgenici optogenetic sono stati generati e sono disponibili commercialmente 7,8, tuttavia istituiscono linee transgeniche può essere laborioso e costi proibitivi. Qui si descrive un protocollo per la consegna viralmente-mediata di ChR2 e NpHR geni sotto il promotore CaMKIIα nel ratto prelimbic corteccia e subiculum dorsale utilizzando un virus adeno-associato ricombinante (AAV). All&#39;interno del prosencefalo, espressione CaMKIIα è esclusiva per i neuroni piramidali glutamatergici 9. AAV è comunemente usato per la ricerca di base a causa della sua relativa facilità di produzione e mancanza di patogenicità, nonché la forte e Persiespressione del transgene stent che è stato raggiunto con questi vettori 10. Inoltre abbiamo delineare i passaggi e hardware per la consegna della luce e registrazione simultanee nei ratti testa fissa anestetizzati.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Metodi optogenetic sono emersi come un potente strumento per la comprensione della attività del circuito neurale alla base una serie diversificata di comportamenti attraverso una vasta gamma di specie. Strumenti optogenetic di origine microbica sono costituiti da proteine ​​di membrana sensibili alla luce che sono in grado di attivare (ad esempio, channelrhodopsin-2, ChR2) o il silenzio (ad esempio, halorhodopsin, NpHR) di attività neurale tipi cellulari ingenetically definiti su scale temporali comportamentale rilevanti. Per prima cosa dimostrare un approccio semplice per la consegna adeno-associato virus-mediata di ChR2 e NpHR transgeni al subiculum dorsale e regione prelimbic della corteccia prefrontale di ratto. Poiché ChR2 e NpHR sono geneticamente targeting, si descrive l&#39;uso di questa tecnologia per controllare l&#39;attività elettrica di specifiche popolazioni di neuroni (ad esempio, i neuroni piramidali) incorporati nel tessuto eterogeneo con alta precisione temporale. Descriviamo qui l&#39;hardware, il software personalizzatodell&#39;interfaccia utente e procedure che consentono erogazione contemporanea luce e registrazione elettrica da neuroni piramidali trasdotte in un anestetizzato in preparazione vivo. Questi strumenti di luce-reattiva offrono l&#39;occasione per individuare i contributi causali di tipi cellulari diversi per l&#39;elaborazione delle informazioni e comportamento.

La figura 1 illustra uno screenshot del software personalizzato (NeuroLux Pro) sviluppato in ambiente LabVIEW (National Instruments) utilizzato per la registrazione simultanea di attività neuronale e controllo dei parametri di impulsi di luce (ossia la frequenza degli impulsi, larghezza di impulso, periodo di stimolazione). Il programma software invia un segnale di comando per un dispositivo di acquisizione digitale che genera impulsi TTL per il controllo del laser singolo diodo. Inoltre i software visualizza programma e memorizza l&#39;attività neuronale registrata e segnali TTL consegnati. Questi segnali vengono digitalizzati attraverso il dispositivo di acquisizione ad una frequenza di campionamento definito (ad esempio, 20 kHz). Segnali registrati vengono salvati come una matrice a doppia precisione bidimensionale in un file binario. La Figura 2 mostra la optrode personalizzato costituito da un elettrodo di tungsteno collegato ad una fibra ottica. Una fibra ottica è fissato all&#39;elettrodo usando filo di sutura sottile a trepunti. Se necessario, colla super può essere usato per far aderire loro. Tuttavia, evitare fissa permanentemente la fibra ottica all&#39;elettrodo perché anche se l&#39;elettrodo può essere riutilizzato più volte, la trasmissione della luce attraverso la fibra si degrada con l&#39;uso ripetuto e devono essere spaccati e puliti o sostituiti ad ogni inserimento nel cervello. Pannelli sinistra della Figura 3 mostra le immagini fluorescenti di proteina fluorescente giallo rafforzata, con l&#39;indicazione reale ChR2 e di espressione NpHR. Queste fotografie mostrano espressione NpHR rappresentante nel ratto subiculum dorsale (Figura 3A) e l&#39;espressione ChR2 nella corteccia prelimbic (Figura 3B). Espressione virale è stata limitata principalmente al subiculum dorsale e corteccia prelimbic (ad esempio alcuni fluorescenza è stata osservata nel giro dentato (Figura 3A, sinistra)). Sono stati osservati anche i brani del elettrodo (traccia sottile, testa di freccia) e fibra ottica (traccia spesso, freccia). Figura 4 mostra che ChR2 indotta spiking temporalmente preciso nel ratto corteccia prelimbic. Figura 4A è una traccia esempio di potenziali di azione ChR2-attivati ​​in risposta a 20 Hz consegna di 10 msec impulsi di luce blu di ratto prelimbic corteccia. Raster plot (Figura 4B) mostra l&#39;attivazione ChR2 indotta in sei neuroni rappresentativi. Tutti i neuroni registrati ha mostrato chiodare luce evocata con perfetta fedeltà. In contrasto ChR2, NpHR rapidamente e reversibilmente tacere attività spontanea in vivo nel ratto prelimbic corteccia (pannello destro della Figura 4). Figura 4C è una traccia esempio mostra che continua illuminazione 532 nm (10 s) della corteccia prelimbic esprimere NpHR sotto l&#39; promotore CaMKllα elimina spontanea attività singola unità in vivo. Si noti che il silenziamento completa dell&#39;attività delle cellule piramidali prelimbic sono bloccati temporalmente al 10 sec consegna luce continua. Bassoer raster plot (Figura 4D) mostra silenziamento NpHR indotta in sei neuroni rappresentativi. Entrambe le registrazioni in vivo sono tipici di quelli ottenuti da adulti Sprague-Dawley in cui la consegna AAV-mediata di geni microbici opsin verificato 18-21 giorni prima. La Figura 5 mostra il risultato di ripetute ChR2 stimolazione di un ratto prelimbic neuroni piramidali. Impulso di luce blu (10 msec) è stato consegnato a 20 Hz per 5 secondi (totale 100 impulsi). Tracce di tensione del spiking luce evocato furono ripetutamente acquisiti ogni 2 minuti durante una sessione di registrazione di 2 ore (totale 61 ripetizioni). Anche quando si utilizza questo protocollo di stimolazione ripetitiva, ChR2 indotta spiking stabile e robusto in risposta alla consegna luce. Figure 6 e 7 mostrano i risultati di fotoinibizione NpHR indotta e fotoattivazione ChR2-driven di ratto subicular attività dei neuroni. Come è il caso in corteccia prelimbic, NpHR e ChR2 potevanomediare il tempo-locked inibizione indotta da luce e l&#39;attivazione dei neuroni subicular opsin trasdotte con elevata riproducibilità. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Figura 1. Screenshot dell&#39;interfaccia software Pro NeuroLux per la consegna della luce simultanea e registrazione elettrofisiologica. Traccia nella foto mostra il silenziamento NpHR indotto di attività spontanea del ratto cellula piramidale prelimbic in risposta a 10 sec di continuo 532 consegna luce nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine ad alta potenza di optrode personalizzata. Una fibra ottica viene inserito nel tubo capillare di vetro collegato ad un elettrodo di tungsteno e fissato l&#39;elettrodo con filo di sutura. La distanza da centro a centro betwEEN la punta dell&#39;elettrodo e la punta della fibra è di circa 500 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Figura 3. Espressione virale e il posizionamento optrode. (Sinistra) Le fotografie mostrano espressione NpHR rappresentante in subiculum dorsale (A) e l&#39;espressione ChR2 nella corteccia prelimbic (B). (Destra) Schema che rappresenta la posizione in cui è stata scattata ogni fotografia. La freccia e freccia in ogni fotografia indicano la posizione dell&#39;elettrodo di tungsteno e fibra ottica, rispettivamente. SUB: subiculum, DG: giro dentato, PL:. Corteccia prelimbic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Figura 4. Nel vivo registrazioni elettrofisiologiche da ChR2 o NpHR-trasdotte prelimb ratic corteccia. (A) Esempio traccia dei potenziali d&#39;azione ChR2-attivati ​​in risposta a 20 Hz consegna di blu (473 nm) impulsi di luce (10 msec, blu bar). (B) plot Raster mostrando chiodare ChR2 indotta in sei neuroni rappresentativi. Ogni unità di attività è un grafico in un punto. (C) Esempio traccia di soppressione NpHR indotta dell&#39;attività spontanea durante verde continua (532 nm) luce di illuminazione (10 sec, verde bar). (D) plot Raster mostrando silenziamento NpHR indotta in sei neuroni rappresentativi. Ogni attività unità è tracciata come un puntino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Figura 5. Chiodare ripetitivo 20 Hz ChR2-driven di un ratto prelimbic piramidale neuroni in vivo. (A) Tensione tracce del spiking luce evocatoacquisita al momento del dato 0, 30, 60, 90, 120 minuti dopo l&#39;inizio delle registrazioni. (B) trama raster che mostra tutte le 61 ripetizioni (2 min intervallo inter-trial, 120 min totali) l&#39;attivazione indotta dalla luce. Ogni attività unità è tracciata come un puntino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Figura 6. Nel vivo registrazioni elettrofisiologiche da NpHR-trasdotte subiculum dorsale di ratto. (A) trace Esempio che mostra che il 10 sec continuo illuminazione 532 nm (barra verde), della subiculum dorsale esprimere NpHR elimina attività spontanea. (B) forme d&#39;onda media delle due unità registrate dalla traccia precedente. La soglia di ampiezza è stato usato per identificare due neuroni distinti. (C) trama raster che mostra cinque ripetizionis di silenziamento NpHR indotta di queste unità. Ogni unità di attività è un grafico in un punto. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Figura 7. Repetitive 20 Hz CR2-driven incurvamento di un ratto dorsale subicular neuroni in vivo. (A) Tensione tracce della luce evocata chiodare acquisite presso i punti di tempo 0, 30, 60, 90, 120 min dopo l&#39;inizio delle registrazioni. Inserto: attività tipica scoppio di questa cella. (B) trama raster che mostra tutte le 61 ripetizioni (2 min intervallo inter-trial, 120 min totali) l&#39;attivazione indotta dalla luce. Ogni attività unità è tracciata come un puntino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito &quot;optogenetics&quot;, consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l&#39;integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

18.9K Views.  University of Colorado Boulder.  Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular. 

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Ricerca

Neuroscienze

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

In Misure Vivo elettrofisiologici sui nervi mouse sciatico

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti