Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Canadian Institutes of Health Research MOP-81158.

1. Estrazione di proteine ​​target da colture di neuroni primari ippocampali <ol><li> Prima raccolta proteina endogena da cellule primarie ippocampali, preparare un tampone di lisi (LB, Tabella 1) con inibitori della proteasi. A 10 ml di tampone di lisi, aggiungere 0,1 ml di soluzione phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) ad una concentrazione finale di 10 mM, e aggiungere 1 inibitore della proteasi cocktail compressa. </li><li> Preparare N-etilmaleimmide (NEM) soluzione (Tabella 1) dalla polvere liofilizzata. Sciogliere delicatamente in EtOH al 100% a temperatura ambiente (RT). Sempre preparare soluzione NEM fresco per il giorno dell&#39;esperimento. </li><li> Successivo combinare il tampone di lisi e NEM. Aggiungere 0,5 ml di soluzione 2M NEM in una nuova tubo da 50 ml. Aggiungere 20 ml di LB più alto, e rapidamente luogo LB + NEM (concentrazione finale di 50 mM) su una piattaforma oscillante a 4 ° C per mescolare completamente per 5 min. Aggiungere sempre NEM / EtOH secondi prima soluzione e LB, così da miscelare correttamente i due. </li><li> Rimuovere neuroni in coltura da incubatore e posto su ghiaccio *. Delicatamente rimuovere i supporti cellulari, e delicatamente lavare due volte con fosfato freddo soluzione salina tamponata (PBS) 1x. Aggiungere 300 ml di LB + NEM 50 mM al primo pozzo di neuroni ippocampali e cellule, raschiare con un sollevatore usa e getta cella. Raccogliere il lisato cellulare, quindi scaricare il lisato nel pozzo successivo di quel gruppo. Raschiare le cellule all&#39;interno del secondo pozzo di azionare il sollevatore cella, raccogliere, e ripetere con un pozzo terzo, se necessario, per concentrare ulteriormente il lisato. </li><li> Raccogliere lisato cellulare in un pre-raffreddata (su ghiaccio), 1,5 ml microprovetta. Ripetere il passaggio 1,4 con 100 ml di LB + NEM 50mM a raccogliere tutte le rimanenti lisato cellulare. Passare lisato totale della cella attraverso una siringa da 26 ½ calibro 5-6 volte per facilitare la lisi meccanica, facendo attenzione a non soffiare bolle nella soluzione. Si può invece ultrasuoni per 15 secondi su ghiaccio, se l&#39;apparecchiatura è disponibile. Nutate lisato cellulare per ≥ 30 min a 4 ° C. </li><li> Chiarire il Lysa cellate per centrifugazione a 16.000 xg / 30 min, in modo da pellet un-cellule lisate e detergente-insolubili materiale. </li><li> Raccogliere azzerato lisato cellulare (surnatante) in una nuova pre-raffreddato 1,5 ml tubetto sul ghiaccio. Ripetere il protocollo di raccolta per tutti i gruppi di cellule. Misura la concentrazione di proteine ​​in tutti i campioni lisati mediante saggio BCA, e normalizzare il volume di tutti i campioni del lisato da gruppi di cellule di avere esattamente uguale proteine ​​totali, con una minima raccomandata di 500 mg. Riempire tutti i campioni con LB + NEM 50 mM a 500 microlitri di volume totale. </li><li> Aggiungere 1-5 pg di anticorpo primario diretto contro la proteina bersaglio per ciascun campione di lisato. Nutate anticorpo-lisato campioni misti notte a 4 ° C. </li></ol> Neuroni ippocampali di ratto primari * devono essere coltivate ad una densità di circa 250.000 cellule / pozzetto in un 6-ben piatto, in un siero mezzi privi contenenti un integratore B27 neuronale, come precedentemente descritto 5, e coltivate per il desideriolunghezza d di tempo, tipicamente 14-16 giorni in vitro (DIV) per raggiungere la maturità. Un minimo di 500 pg di proteina totale è consigliabile successo immunoprecipitare e biotinylate una proteina bersaglio neuronale, che richiede in genere 2-3 pozzetti di una 6-ben piatto. 2. Precipitazione di anticorpo legato proteina bersaglio <ol><li> Prima di precipitare e immobilizzare una proteina bersaglio, preparare un impasto al 50% di proteina A o proteina G-sefarosio perle rivestite. In particolare, aggiungere ≥ 60 ml di perline sefarosio per campione in provette da 1,5 ml, assicurando che tutti i campioni hanno la stessa quantità di perline. Branelli magnetici sono adatti anche se l&#39;apparecchiatura è disponibile. </li><li> Aggiungere un volume uguale del 50% slurry per ciascun anticorpo-lisato campione, e nutate ≥ per 1 ora a 4 ° C. </li></ol> 3. Acil-Biotina Exchange: Hydroxylamine (HAM) Cleavage <ol><li> Durante l&#39;esecuzione passo 2.2, preparare un certo numero di tubi con tampone di lisi (LB) di dipH fferent. Il pH è molto importante per i passaggi e deve sempre essere regolata usando un pH-metro. Preparare 2 ml di LB pH 7,2 per campione, e 0,5 ml di tampone per campione Stringente (Tabella 1). Anche preparare 0,5 ml di LB + NEM 10mM per campione, come nei passi 1,1-1,3. Aggiungi PMSF e compresse con inibitori della proteasi per tutti i buffer di lisi, come al punto 1.1. </li><li><ol class="lalpha"><li> Idrossilammina (HAM) è un potente agente riducente, quale clivaggio di palmitato di cisteine ​​è richiesto per biotinilazione (Figura 1), e l&#39;omissione del clivaggio HAM serve come controllo negativo. Dividere ogni campione di perline in due campioni, uno omettendo la fase HAM clivaggio (-HAM), e uno comprendente la fase HAM (+ HAM). Per normalizzare per la degradazione delle proteine ​​causata dal trattamento HAM, si dovrebbe dividere ogni campione in terzi, con 1/3 delle sfere usate per il controllo del-HAM, ed i restanti 2/3 utilizzato per il trattamento HAM +. </li><li> Preparare ulteriore 1.Provette da 5 ml su ghiaccio, etichettati come controllo della HAM-per ogni campione. Seguendo passo 2.2, centrifugare delicatamente perle tutti i campioni &quot;a 0.5 xg / 1 min a 4 ° C (centrifuga a questa velocità, la durata e la temperatura per tutti i passaggi rimanenti salvo diversa indicazione), posizionare i tubi in ghiaccio, rimuovere il supernatante e risospendere le sfere in 600 ml di LB + NEM 10mM. </li></ol></li><li> Dopo la ri-sospensione i campioni &quot;perle in tampone di lisi + NEM 10mM, immediatamente raccogliere 200 ml di del campione lisato-tallone liquami, e scarico in quel campione-HAM provetta in ghiaccio. Aggiungere un ulteriore 300 ml di LB + NEM 10mM a campione-HAM, e un ulteriore 100 pl di campione HAM + per un totale di 500 microlitri in ciascun campione. Incubare per 10 min in ghiaccio. </li><li> Risospendere (lavaggio) il-HAM e campioni di prosciutto + delicatamente con 0,5 ml di tampone rigorose, per campione. Eseguire questo passaggio velocemente, come incubazione più SDS comporterà la rimozione di anticorpo legato dalperline. </li><li> Lavare delicatamente tutti i campioni per tre volte in 0,5 ml / campione di pH LB 7.2, e spin down tra un lavaggio e come in 3.2b passo. </li><li> Durante l&#39;esecuzione passo 3.5, preparare un buffer HAM (Tabella 1). Aggiungere volume appropriato di soluzione di idrossilammina in una nuova provetta, per ottenere una concentrazione finale di 1 M in un volume di 0,5 ml LB pH 7,2, per esempio + HAM. Sempre preparare il buffer HAM fresco per il giorno dell&#39;esperimento. Aggiungere 0,5 ml / campione di pH 7,2 a LB-HAM tutti i campioni, e 0,5 ml / campione di tampone a campioni HAM HAM tutti +. </li><li> Nutate tutti i campioni per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Non superare 1 ora. </li></ol> 4. Acil-Biotina Exchange: Biotina-BMCC Etichettatura <ol><li> Durante l&#39;esecuzione di passo 3,6, preparare 2 ml di LB pH 6,2 per campione (Tabella 1), come nel passo 3,1. Posizionare il pH LB 6.2 su ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Anche preparare una soluzione stock di Biotina-BMCC (Tabella 1) immediatamente prima dell&#39;uso. Pesare exacTLY 2,1 mg di biotina-BMCC, raccogliere in una provetta da 1,5 ml, e delicatamente sciogliere in 0,5 ml di dimetil solfossido (DMSO), mettendo su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente, per raggiungere la concentrazione 8mm (non usare una pipetta per rompere la polvere ). </li><li> Una volta che passo 3.6 è terminato, lavare delicatamente le perle una volta in pH 6,2 tampone di lisi, per rimuovere i residui di tampone HAM. Rimuovere il surnatante e mettere i campioni in ghiaccio. </li><li> Biotina-BMCC è una molecola maliemide biotina coniugata che ha una elevata affinità per i gruppi tiolici liberi di cisteine ​​(Figura 1). Durante l&#39;esecuzione di passo 4,2, preparare 0,5 ml di Biotina-BMCC Buffer (Tabella 1) per campione, a concentrazione di lavoro tra 0,5 pM a 5 micron. Concentrazioni superiori a 5 pM probabilmente saturare la proteina bersaglio 6, e in genere non deve essere superato, tuttavia questo può variare a seconda della proteina bersaglio desiderato. Aggiungere 0,5 ml di Biotina-BMCC tampone a ciascun campione, e nutate esattamente per 1 ora a 4 &amp;deg; C. Non superare 1 ora. </li></ol> 5. Eluizione di biotina-coniugato proteina bersaglio e SDS-PAGE <ol><li> Una volta che passo 4.3 è terminato, lavare delicatamente tutti i campioni una volta in LB pH 6.2. Tenere tutti i campioni in ghiaccio tra lavaggi. Rimuovere 2x Sample Buffer SDS senza agenti riducenti (Tabella 1) da -20 ° C di stoccaggio e lentamente sciogliere il ghiaccio. </li><li> Lavare delicatamente i campioni per tre volte di pH 7.5 + LB PMSF / Inibitori, e mantenere i campioni in ghiaccio tra lavaggi. </li><li> Rimuovere il surnatante del terzo risciacquo, lasciando le sferette pellet in un impasto liquido con buffer residuo sul fondo della provetta. Immergere una pipetta con un piccolo diametro di punta (una punta di carico gel o P2 puntale sono sufficienti) nella parte inferiore del tubo attraverso il liquame, e rapidamente raccogliere qualsiasi buffer residuo, facendo attenzione a non prendere le perline. </li><li> Supplemento il 2x soluzione tampone SDS con DL-Dithiothreitol (DTT) per ottenere una concentrazione finale di 5 mM. Aggiungere40-50 ml di soluzione tampone 2x + DTT 5 mM per ogni campione. Se necessario, le perline vortice per mescolare completamente con il tampone del campione, e subito centrifugare ad alta velocità per raccogliere tutti perline in un pellet, immersi in tampone campione. </li><li> Tutti i campioni bollire per 10 minuti a 75-80 ° C. Lasciate raffreddare i campioni a temperatura ambiente per ≥ 10 minuti sul banco, e centrifugare a 16000 xg / 3 min a pellet completamente le perline. </li><li> Aggiungere il volume totale di proteine ​​eluite (supernatante) da ciascun campione di una sola corsia di un gel di poliacrilammide adatto per western blotting, usando SDS-PAGE 7. Organizza tutti i campioni in modo che la HAM-eluente controllo e HAM eluente + per un solo campione vengono eseguiti immediatamente adiacenti l&#39;uno all&#39;altro durante la SDS-PAGE (Fig. 2). Seguendo SDS-PAGE, si trasferiscono in PVDF o membrana di nitrocellulosa. </li></ol> 6. Western Blotting e rilevamento della palmitoilazione della proteina bersaglio <ol><li> Dopo 5,6 passo è completato, lavare la membranadue volte in soluzione salina tamponata Tris (TBS 1x) per 10 min su una piattaforma oscillante a RT. </li><li> Preparare un tampone di bloccaggio per bloccare non specifica etichettatura pesando sieroalbumina bovina (BSA), per raggiungere il 3% in peso di un volume di 1x TBS + Tween-20 0,05% (TBS-T), che è sufficiente per sommergere completamente la membrana . Per streptavidina blotting, bloccare sempre con BSA e non il latte in polvere. Bloccare la membrana per 1 ora a RT su una piattaforma oscillante. </li><li> Preparare una soluzione di anticorpo TBS-T + 0,3% BSA. Aggiungere streptavidina-HRP anticorpo ricostituito a 1 mg / ml in acqua distillata, diluito al 1:5,000-1:10,000. Una volta completata passo 6.2, lavare la membrana volta in TBS-T per 10 minuti, poi incubare la membrana in soluzione di anticorpi Streptavidina su una piattaforma oscillante per entrambi per 1 ora a RT, o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare la membrana per tre volte in TBS-T per 10 min su una piattaforma oscillante. Al fine di rilevare il segnale palmitoilazione, esporre la luminescenza HRP utilizzando un chemsubstrato kit iluminescent. </li><li> Al fine di normalizzare i livelli palmitoilazione alla quantità della proteina di interesse che è stato immunoprecipitato, togliere la membrana utilizzando tampone western blot strippaggio per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante a RT. Ripetere i passaggi 6,1-6,4 usando l&#39;anticorpo primario contro la proteina di interesse che è stato originariamente utilizzato per l&#39;immunoprecipitazione. </li><li> Quantificare palmitoilazione della proteina di interesse utilizzando software di analisi di immagini, e normalizzare i livelli palmitoilazione alla quantità di proteine ​​immunoprecipitato. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;IP-ABE saggio qui presentato è un metodo semplice e molto sensibile per la rilevazione di proteine ​​palmitoylated in una coltura di neuroni primari ippocampali, utilizzando tecniche biochimiche per lo più standard. Questo rende il test facilmente adattabile per i laboratori già equipaggiati con materiali occidentali blotting. L&#39;IP-ABE test combina un protocollo standard per isolare immunoprecipitazione e immobilizzare la propria proteina bersaglio, seguito da precedentemente descritto ABE chimica 2-4 per rilevare rapidamente livelli di palmitato su un substrato proteico. La tecnica ABE ha una vasta gamma di applicazioni per l&#39;esame di proteine ​​palmitoilato in vari tessuti e linee cellulari, inclusi i grandi palmitoil-proteomica screening di profili palmitoilazione globali e rilevamento rapido di palmitoilazione livelli di una proteina bersaglio singolo. Descrizioni precedenti di ABE chimica hanno utilizzato diversi metodi di lisi cellulare ed estrazione detergente di prot neuronaleEins 2, 9, tiolo libero-blocco 10, 11, biotinilazione, e purificazione della proteina bersaglio 4, a seconda dell&#39;applicazione dell&#39;esperimento. L&#39;aggiunta di palmitato di proteine ​​neuronali risultati nel proprio targeting verso membrane cellulari, e la rilevazione della frazione palmitoilato di una proteina bersaglio richiederà la sua estrazione da tali membrane. Precedentemente descritte metodologie ABE hanno utilizzato una varietà di 9 ionici e non-ionici detergenti 8 per estrarre proteine ​​bersaglio desiderate, e l&#39;uso di un particolare detersivo dipende la proteina bersaglio e il suo traffico di membrana nota. Qui, utilizziamo la non denaturante e detergente non ionico IGEPAL CA-630 per estrarre proteine ​​palmitoilato, che abbiamo convalidato per l&#39;estrazione e la rilevazione della proteina neuronale palmitoilato δ-catenina (Figura 2). La struttura di IGEPAL CA-630 comprende un ingombrante e rigido non polare gruppo di testa che nonperturbare conformazione nativa o interazioni proteina, ma che permette la sua associazione con le regioni idrofobiche di proteine ​​associate alla membrana, conferendo in tal modo miscibilità a loro e permettendo loro estrazione. Molte proteine ​​neuronali localizzate alla membrana sinaptica o post-sinaptica densità di sinapsi deve essere estratto usando IGEPAL CA-630, tuttavia alcuni possono non solubilizzare completamente, e può richiedere l&#39;uso di un diverso non denaturante detergente come Triton X-100, che ha stati precedentemente utilizzati per ABE chimica 2, 8. Descrizioni Diversi ABE chimica hanno anche utilizzato un diverso tiolo reattivo reattivo biotinilazione dalla molecola che descriviamo qui, chiamato biotina-HPDP (Thermo Scientific), che richiede anche un modo diverso di purificazione della proteina 4. Biotin-HPDP è un&#39;altra tiolo reattivo, maliemide-coniugato biotina molecola che contiene un legame disolfuro nel braccio linker maliemide, strutturalmente differentiating da biotina-BMCC, che non contiene tale legame disolfuro. Seguendo tiolo-biotinilazione di cisteina libera o palmitoilato una proteina da Biotin-HPDP, il legame disolfuro risultante tra la proteina bersaglio e il gruppo biotina può essere scisso riducendo reagenti per rilasciare il gruppo biotina e rigenerare la proteina nella sua forma originale, rendendo biotinilazione di Biotina-HPDP transitorie e reversibili. Pertanto, l&#39;uso di questo reagente biotinilazione richiede purificazione di una proteina bersaglio con reagenti immobilizzati avidina, streptavidina come perle rivestite. Tuttavia, tiolo-biotinilazione di una proteina bersaglio con biotina-BMCC, come descritto qui, è stabile e relativamente permanente, e richiede la purificazione della proteina bersaglio con un anticorpo diretto contro il bersaglio, e immobilizzato su perline sefarosio. Entrambe le tecniche ABE sono stati precedentemente utilizzati per grandi schermi, e il rilevamento di palmitoilazione di proteine ​​singole 2, 8-10, 12, e laIP-ABE test che descriviamo qui è ottimale per la rilevazione rapida di palmitoilazione di singole proteine ​​bersaglio neuronali. La stragrande maggioranza dei palmitoilazione cellulare comporta l&#39;aggiunta reversibile palmitato al gruppo tiolo di cisteine ​​(chiamato S-palmitoilazione, che generalizziamo come &#39;palmitoilazione&#39; in questo protocollo), ma un gruppo molto limitato di proteine ​​sono soggette a palmitoilazione irreversibile a glicina residui di cisteina e attraverso la formazione di legami ammidici stabili, chiamato N-palmitoilazione 13. Una limitazione di ABE chimica è la sua incapacità di rilevare N-palmitoilazione causa della stabilità del legame ammidico, e così lo screening di una proteina nuovo bersaglio per palmitoilazione dovrebbe essere confermata usando 3H-palmitato marcatura metabolica 1. Come precedentemente accennato, il IP-ABE dosaggio può essere facilmente adattato per l&#39;esame palmitoilazione in estratti proteici da molteplici fonti, comprese transfected linee di cellule eterologhe, il tessuto primario e colture primarie neuronali provenienti dalle regioni cerebrali multiple. L&#39;IP-ABE test è stato utilizzato per l&#39;esame della sufficienza palmitoilazione mutati cisteina-to-serina proteine ​​per identificare la posizione di una cisteina palmitoilato lungo una proteina bersaglio 8, per l&#39;esame fatturato dinamica palmitato sulle proteine ​​sinaptiche in neuroni in coltura in condizioni basali 10, e cambiamenti nei livelli di proteine ​​neuronali palmitoilazione dopo induzione dell&#39;attività neuronale 9. La sensibilità e l&#39;adattabilità della IP-ABE test rendono ideale per l&#39;esame di profili palmitoilazione di proteine ​​neuronali, e ottimale per la rilevazione di cambiamenti dinamici in palmitoilazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Sigma </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasi Inhibitor Cocktail </td><td> Roche Mini completo </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> Sigma </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM soluzione </td><td> Sigma </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Garantire la compatibilità con un detergente scelto </td></tr><tr><td> Proteine ​​G / A-rivestito sefarosio perline </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Biotina-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Ricostituire a 1 mg / ml in acqua </td></tr><tr><td> Western Blot Buffer Spogliarello </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (abe)

Palmitoilazione è una modificazione post-traduzionale di lipidi che coinvolge l&#39;apposizione di 16 atomi di carbonio acido grasso saturo, palmitato, di residui di cisteina delle proteine ​​substrato attraverso un labile legame tioestere [recensione in 1]. Palmitoilazione di una proteina substrato aumenta la sua idrofobicità, e facilita tipicamente suo traffico verso membrane cellulari. Recenti studi hanno dimostrato palmitoilazione essere una delle modifiche lipidici più comuni in neuroni 1, 2, suggerendo che turnover palmitato è un importante meccanismo attraverso cui queste cellule regolano la destinazione e traffico di proteine. L&#39;identificazione e rilevazione di substrati palmitoilato può pertanto migliorare la nostra comprensione della tratta proteina nei neuroni. Rilevamento di proteine ​​palmitoilazione in passato è stata tecnicamente ostacolato a causa della mancanza di una sequenza consenso tra proteine ​​substrato, e la dipendenza metabolica labeling di palmitoil-proteine ​​con 3 H-palmitato, un tempo saggio biochimico con bassa sensibilità. Sviluppo della acil-Biotina Exchange (ABE) test consente di rilevare la sensibilità più rapido ed elevato di proteine ​​palmitoylated 2-4, ed è ottimale per misurare la dinamica del fatturato palmitato sulle proteine ​​neuronali. Il dosaggio ABE comprende tre passi biochimici (figura 1): 1) blocco irreversibile di gruppi non modificati tiolo della cisteina con N-ethylmaliemide (NEM), 2) clivaggio specifico e smascheramento del gruppo tiolo della cisteina palmitoilato da parte idrossilammina (HAM), e 3) l&#39;etichettatura selettiva della cisteina palmitoylated con un tiolo reattivo reattivo biotinilazione, biotina-BMCC. Purificazione delle tiolo-biotinilati proteine ​​secondo le fasi ABE è stato diverso, a seconda l&#39;obiettivo generale di questo esperimento. Qui, si descrive un metodo per purificare una proteina di interesse in palmitoilato ippocampo primarianeuroni AL di una immunoprecipitazione iniziale (IP) utilizzando un anticorpo diretto contro la proteina, seguita dal dosaggio ABE e western blotting per misurare direttamente palmitoilazione livelli di tale proteina, che è definito il IP-ABE saggio. A bassa densità colture di neuroni ippocampali embrionali di ratto sono stati ampiamente utilizzati per studiare la localizzazione, la funzione, e il traffico di proteine ​​neuronali, che li rende la soluzione ideale per lo studio delle proteine ​​palmitoilazione neuronale utilizzando l&#39;IP-ABE saggio. L&#39;IP-ABE test richiede principalmente IP standard e reagenti occidentali blotting, ed è solo limitata dalla disponibilità di anticorpi contro il substrato bersaglio. Questo dosaggio può essere facilmente adattato per la purificazione e la rilevazione di proteine ​​palmitoilato trasfettati in colture cellulari eterologhi, colture neuronali primarie derivate da vari tessuti cerebrali di entrambi topo e ratto, e tessuto cerebrale anche primario stesso.

L&#39;IP-ABE saggio rileva specificamente tiolo-palmitoilazione di residui di cisteina lungo proteine ​​substrato, e può essere utilizzato per rilevare palmitoilazione di immunoprecipitate proteine ​​neuronali in modo rappresentato nella figura 1. Trattamento della proteina neuronale immunoprecipitato con HAM (Figura 1) scinde il legame tioestere tra palmitato e gruppo tiolo una cisteina, permettendo per incorporazione specifica di biotina-BMCC sul gruppo appena disponibile tiolo, che può essere successivamente rilevata tramite western blotting. L&#39;omissione di HAM (meno-HAM) scissione impedisce l&#39;incorporazione di biotina-BMCC e funziona come un controllo negativo per specifici palmitoil-biotinilazione del plus-HAM campione e deve quindi sempre essere eseguito vicino al plus-HAM campione per occidentale blotting mediante SDS-PAGE (Figura 2). In un esperimento ottimizzato (Figura 2A), il palmitoilazionesegnale della proteina neuronale δ-catenina 2 può essere facilmente rilevato da blotting per biotina-BMCC ad una concentrazione di 1 mM, utilizzando streptavidina coniugata con HRP, contro i campioni meno parallele e-plus-HAM. Il segnale palmitoilazione specifico per δ-catenina appare nella sua dimensione prevista di 160kD, solo nel plus-HAM campione. La specificità di questo segnale è stato confermato da reprobing per δ-catenina con l&#39;anticorpo specifico che è stato inizialmente utilizzato per immunoprecipitare esso, risultando in un segnale in entrambi i trattamenti prosciutto al predetto stessa dimensione. Ottimizzazione del IP-ABE test (Figura 2A) si tradurrà in un profilo western blotting di un minus-HAM campione che è facilmente distinguibile dal plus-HAM campione, e mostra una minima di alcun segnale palmitoilazione. La concentrazione di biotina-BMCC utilizzato per etichettare cisteine ​​palmitoilato richiede un&#39;attenta ottimizzazione, e se una super-saturante concentrazione di biOtín-BMCC viene utilizzato durante le fasi chimica Abe (Figura 2B), fondo eccessiva e non specifici segnali sarà visibile. Una curva di risposta lineare per biotinilazione di una proteina palmitoilato neuronale, la α7 recettore nicotinico, utilizzando biotina-BMCC è stata preventivamente fissata 6, e mostra vicino completa saturazione ad una concentrazione di 5-10 uM. Sebbene la concentrazione ottimale di biotina-BMCC sarà deviare leggermente a seconda della proteina bersaglio neuronale, il trattamento con biotina-BMCC ad una concentrazione superiore a 5 pM probabilmente super-saturare la proteina bersaglio, e il risultato in un profilo western blot con sfondo visibile e non specifici segnali. Una concentrazione di 0,5 pM di biotina-BMCC è stato precedentemente utilizzato per rilevare palmitoilazione di altre proteine ​​neuronali compresi SNAP-25, huntingtina, subunità dei recettori AMPA GluA1 e GluA2, paralemmin e 8, e la determinazione della concentrazione ottimale per un romanzoproteina bersaglio può essere effettuata per tentativi in ​​modo lineare, partendo nell&#39;intervallo di 0,5-5 pM che descriviamo qui. I risultanti streptavidina profili western blot tra i campioni meno-e plus-HAM per δ-catenina palmitoilazione essere simile se trattati con 4 mM biotina-BMCC (Figura 2B), con segnali di fondo aggiuntivi in diverse dimensioni, il che indica che si è verificato biotinilazione inappropriato. Idrossilammina è un potente agente riducente che provoca la degradazione limitata della proteina bersaglio in aggiunta alla sua scissione efficiente di tioestere linkage. Di conseguenza, l&#39;ottimizzazione delle ABE chimica richiede uno per normalizzare la quantità di proteine ​​immunoprecipitato utilizzato per campioni e meno-più-HAM (passi 3,2-3,3). Normalizzazione richiede l&#39;uso del doppio della quantità di proteina bersaglio immobilizzata nel plus-vs-minus HAM campione, che si traduce in realtà in Wester indistinguibilin blotting profili per la proteina bersaglio, come mostrato per δ-catenina (Figura 2A, B). Tuttavia, se la quantità di proteina bersaglio immobilizzato non viene normalizzato tra campioni e meno-più-HAM, il segnale risultante western blot per la proteina bersaglio in plus-HAM campione può essere perso, come mostrato per δ-catenina quando la stessa quantità di proteina sono stati utilizzati in entrambi i trattamenti HAM (Figura 2C). La specificità di ABE chimica per l&#39;etichettatura di proteine ​​palmitoylated è molto sensibile e richiede l&#39;ottimizzazione. Gli errori più comuni riscontrati durante il PI-ABE test includono i risultati non ottimali illustrati nelle figure 2B e 2C, e la degradazione della proteina bersaglio, indipendentemente dal trattamento HAM, che sono generalmente causati da vecchi reagenti e tamponi, e il pH corretto. Per evitare questi inconvenienti e per correggere sub-ottimale chimica ABE, la freschezza e la concentrazione dei reagenti necessari per l&#39;buffer di cui alla tabella 1 deve sempre essere esaminato, e le regolazioni del pH di tutti i buffer deve essere sempre controllato prima di eseguire l&#39;esperimento. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Buffer </td><td> Concentrazione di lavoro </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Lysis Buffer (LB) </td><td> In distillata H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl 150 mM pH7.5 Glycerol NaCl 10% </td><td> N / A </td><td> Preparare prima di sperimentare e conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> NEM Soluzione </td><td> In% EtOH 100: NEM polvere liofilizzata </td><td> 2 M </td><td> Preparare fresco, immediatamente prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Buffer stringente </td><td> In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS </td><td> N / A </td><td> Preparare poco prima dell&#39;uso, tenerla in ghiaccio. </td></tr><tr><td> LB pH 7.2 </td><td> In LB: Portare il pH esattamente a 7,2 </td><td> N / A </td><td> Utilizzare un misuratore di pH per regolare il pH immediatamente prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> HAM Buffer </td><td> In LB pH 7.2: soluzione HAM Fotografico </td><td> 1 M (concentrazione finale HAM) </td><td> Preparare al momento dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> LB pH 6,2 </td><td> In LB: Regolare il pH esattamente a 6,2 </td><td> N / A </td><td> Come per pH 7,2 LB </td></tr><tr><td> Foto biotina-BMCC Solution </td><td> In DMSO: 2,1 mg Biotina-BMCC soluzione </td><td> 8 mM </td><td> Preparare al momento dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Biotina-BMCC Buffer </td><td> In LB pH 6.2: Aggiungi biotina-BMCC soluzione </td><td> 1-5 mM (finali biotina-BMCC concentrazione) </td><td> Preparare al momento dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> 2x SDS Sample Buffer, non agenti riducenti </td><td> In distillata H 2 O: 5% SDS 5% glicerolo 125mm Tris-HCl pH 6,8 0,01% blu di bromofenolo </td><td> N / A </td><td> Preparare prima dell&#39;esperimento, e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Supplemento con 5 mM DTT prima dell&#39;uso. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tamponi e reagenti necessari per l&#39;IP-ABE dosaggio. Molti dei buffer di lisi può essere preparato prima di iniziare l&#39;esperimento, tuttavia il pH deve essere controllato e regolato immediatamente prima dell&#39;uso con un misuratore di pH, per assicurare il successo della chimica ABE. La maggior parte delle soluzioni madre deve essere preparato per ogni esperimento, immediatamente prima dell&#39;uso. Molti dei buffer richiede reagenti comuni alla maggior parte dei laboratori attrezzati per biochimica, e reagenti speciali con informazioni venditore sono elencati nella tabella dei reagenti e apparecchiature. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Figura 1. Schematica della immunoprecipitazione e acil-Biotin Exchange (IP-ABE) saggio per purificare e rilevare palmitoilazione di proteine ​​neuronali. Colture di neuroni ippocampali vengono lisate, (1) una proteina bersaglio viene quindi purificato utilizzando un anticorpo specifico bersaglio e immobilizzato su sefarosio perline rivestite con proteina G o A. La proteina purificata è poi destinazione (2) trattata con N-ethylmaliemide (NEM) di legarsi irreversibilmente e bloccare liberi tiolo (-SH) gruppi lungo cisteine ​​non modificati (C). La proteina bersaglio viene poi (3) sottoposti a trattamento con idrossilammina (HAM), con conseguente scissione specifico di legami tioestere in cisteine ​​palmitoylated e lo smascheramento di un libero gruppo palmitoylated tiolo (-SH). Successivamente, la proteina bersaglio è (4) treated con un tiolo reattivo molecola di biotina, biotina-BMCC, con conseguente biotinilazione specifico della cisteina palmitoilato. Infine, (5) la proteina bersaglio biotinilato viene eluito e rimosso dal anticorpo e tallone. La proteina bersaglio con la sua cisteina palmitoylated (s) codificata con biotina ora è adatto per SDS poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) e western blotting con streptavidina per rilevare per palmitoilazione della proteina purificata neuronale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Figura 2. Rilevamento palmitoilazione della proteina neuronale δ-catenina utilizzando l&#39;IP-ABE saggio. Neuroni dell&#39;ippocampo di ratto primarie sono state coltivate come preprecedentemente descritto 5, ad una densità di 130 cellule / mm 2 fino a maturità 14DIV, sono state poi lisate, e sottoposto al IP-ABE test di rilevare palmitoilazione di un substrato recentemente identificato palmitoilato neuronale, δ-catenina 2. Purificato immunoprecipitati (IP) di δ-catenina (proteina bersaglio) sono stati isolati con 5 mg di δ-catenina anticorpo per campione (Transduction Laboratories BD), e sono stati sottoposti a SDS-PAGE in parallelo meno-e plus-idrossilammina (HAM) campioni. Palmitoilazione stato rilevato mediante western blotting (WB) con streptavidina-HRP (palmitoilazione), e la membrana è stata spogliato e sottoposto ad un WB reprobe per δ-catenina. (A) Un rappresentante ottimizzata IP-ABE risultato palmitoylated δ-catenina (punta di freccia) trattati con 1 pM biotina-BMCC, illustrando la specificità di ABE chimica per rilevare tiolo palmitoylated proteine ​​da campioni IP. (B) Un sub-ottimale rappresensentante IP-ABE risultato δ-catenina, in cui è stato utilizzato un eccessiva concentrazione di 4 mM biotina-BMCC, con conseguente non specifici segnali e priorità bassa in entrambi i campioni meno-e plus-HAM (frecce). (C) Un altro sub-ottimale rappresentante IP ABE-WB per δ-catenina, dove è stata utilizzata una eccessiva concentrazione 4 pM di biotina-BMCC, e la quantità di proteina utilizzata per il plus-HAM campione IP non è stata normalizzata per HAM-mediata degradazione delle proteine, con un conseguente segnale perso nel WB reprobe per δ-catenina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

L&#39;aggiunta di palmitato reversibile alle proteine ​​è un importante regolatore del traffico intracellulare delle proteine. Questo è di particolare interesse in neuroni dove sono palmitoilato molte proteine ​​sinaptiche. Utilizziamo un metodo semplice biochimico per rilevare le proteine ​​palmitoilato in neuroni in coltura, che possono essere adattati per più tipi di cellule e tessuti.

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

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Neuroscience

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

35.2K Views.  University of British Columbia. L'aggiunta di palmitato reversibile alle proteine ​​è un importante regolatore del traffico intracellulare delle proteine. Questo è di particolare interesse in neuroni dove sono palmitoilato molte proteine ​​sinaptiche. Utilizziamo un metodo semplice biochimico per rilevare le proteine ​​palmitoilato in neuroni in coltura, che possono essere adattati per più tipi di cellule e tessuti.

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

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Neuroscienze

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato di calcio trasfezione di primaria neuroni dell&#39;ippocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.