Rispetto alla frazione PSD, può essere possibile identificare la proteina sinaptica che agisce sulla sinapsi immatura attorno alla frazione ricca di filopodi dendritici. Abbiamo usato il neurone vivo per indurre la formazione di tappi fagocitici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la proteina attiva nella genesi artificiale potrebbe essere identificata dalla frazione ricca di filopodi dendritici.
Per iniziare, preparare 200x Vitamin Mix sciogliendo 100 mg di vitamina B5, 100 mg di cloruro di colina, 100 mg di acido folico, 180 mg di I-inositolo, 100 mg di vitamina B3, 100 mg di cloridrato di vitamina B6 e 100 mg di cloridrato di tiammina in 500 ml di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico. Mescolare con cura l'aliquota in tubi da 50 ml e conservarla a 20 gradi Celsius. Per preparare la soluzione di riboflavina, sciogliere 100 mg di riboflavina in 500 mg di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico.
Mescolare con cura l'aliquota in tubi da 50 ml e conservare a 20 gradi Celsius. Per preparare un cloruro di calcio molare sciogliere 7,35 grammi di diidrato di cloruro di calcio in 50 ml di acqua ultrapura utilizzando un agitatore magnetico. Per la preparazione minima del mezzo essenziale sciogliere 400 mg di cloruro di potassio 6, 800 mg di cloruro di sodo, 2,200 mg di bicarbonato di sodio, 158 mg di diidrato monobasico di fosfato di sodio, 7.000 mg di D-glucosio e 200 mg di eptaidrato di solfato di magnesio e 950 ml di acqua ultrapura, utilizzando un agitatore magnetico.
Successivamente, utilizzare una pipetta da 1 ml con agitazione costante su un agitatore magnetico per aggiungere 1,8 ml di 1 cloruro di calcio molare al MEM in modo drop by drop. Quindi aggiungere acido cloridrico per regolare il pH del MEM a pH 7,25. Quindi, aggiungere 5 ml di miscela di vitamine 200x e 200 microlitri di soluzione di riboflavina al MEM.
Regolare il volume della soluzione a 1000 ml con acqua ultrapura. Filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtri da 0,22 micron e conservarla a 4 gradi Celsius. Per preparare 10x DNasi-1 soluzione stock sciogliere 100 mg di Dnase-1 in 12,5 ml di HBSS.
Filtrare attraverso un filtro da 0,22 micron, aliquota in tubi da 1,5 ml e conservare i tubi a 20 gradi Celsius. Per la preparazione della soluzione di approvvigionamento Ara-C sciogliere 25 mg di Ara-C in 8,93 ml di acqua ultrapura. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 micron, aliquota in tubi da 1,5 ml e conservare a 20 gradi Celsius.
Per preparare il mezzo di placcatura, mescolare 1 ml di soluzione di amminoacido MEM, 750 microlitri di 1 HEPES molare, 1 ml di B27, 125 microlitri di glutammina millimolare, 250 microlitri di penicillina-streptomicina, 2,5 ml di siero bovino fetale e 44,375 ml di MEM in un tubo da 50 ml. Per preparare il mezzo di arresto, mescolare 1 ml di soluzione amminoacido MEM, 750 microlitri di 1 HEPES molare, 5 ml di FBS e 43,25 ml di MEM in un tubo da 50 ml. Per preparare l'HBSS, integrato con 15 HEPES millimolare, mescolare 49,25 ml di HBSS e 750 microlitri di 1 HEPES molare.
Per la preparazione di piatti rivestiti in poli-l-lisina, rivestire 35 mm di stoviglie di coltura cellulare in plastica con 0,2 mg per ml di poli-l-lisina idrobromide per un giorno a 25 gradi Celsius. Successivamente, lavare i piatti con 2 ml di acqua ultrapura tre volte e incubarli con 1,5 ml di Stop Medium a 25 gradi Celsius fino all'uso. Incubare gli ippocampi sezionati in una miscela contenente 500 microlitri ciascuno del 2,5% di tripside e 10X Dnase-1 in HBSS integrati con HEPES millimolare, pH 7,2, a 37 gradi Celsius per 15 minuti con agitazione ogni 3 minuti.
Quindi, trasferire gli ippocampi a 10 ml del mezzo di arresto e incubare a 4 gradi Celsius per 5 minuti per inattivare la tripside. Successivamente, incubare gli ippocampi sezionati in 10 ml di mezzo di arresto fresco a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Spostare gli ippocampi in 10 ml di mezzo di arresto fresco e incubare a 4 gradi Celsius per altri 5 minuti.
Quindi, spostare gli ippocampi in 900 microlitri del mezzo di arresto e 100 microlitri di Dnase-1 10X in un tubo da 15 ml. Utilizzare una pipetta da 1 ml per dissociare gli ippocampi in neuroni isolati pipettando 20 volte. Aggiungere 9 ml di mezzo di placcatura e filtrare attraverso un colino a celle da 70 micron in un tubo da 50 ml.
Contare il numero di cellule che usano un emocitometro e una regolazione a 3,5 per 10 fino alle quattro cellule per millilitro nel mezzo di placcatura. Successivamente, aspirare il mezzo di arresto dalle stoviglie rivestite in poli-l-lisina. Piatto 2 ml per piatto delle cellule sui piatti rivestiti e incubare sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 60-64 ore.
Dopo l'incubazione, aggiungere 2 microlitri di soluzione di calcio Ara-C ai neuroni e scuotere lentamente il piatto. Conservare i piatti di coltura in una scatola umidificata senza cambiare il mezzo di coltura sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Purificare la frazione ricca di filopodi dendritici dopo 13 giorni in vitro aggiungendo prima tre milioni di microperline magnetiche in polistirolo per piatto a 20 piatti contenenti i neuroni coltivati.
Dopo un giorno, lavare i neuroni in 1 ml di PBS con agitazione tre volte per rimuovere le microperline medie e non unite. Dopo aver rimosso pbs, lyse i neuroni con 500 microlitri per piatto del tampone dilisi. Successivamente, raccogliere il lisato con un raschietto cellulare e trasferire il lisato in 10 microtubi leganti a basso contenuto proteico.
Impostare i tubi su un separatore di magneti e attendere un minuto. Raccogli il supernatante e usalo come frazione non vincolata per la colorazione dell'argento e l'analisi western blot. Successivamente, trasferire le perline su un nuovo microtubo legante a basso contenuto proteico e impostare su un separatore magnetico per un minuto.
Rimuovere completamente il supernatante e aggiungere 500 microlitri del tampone dilisi. Lavare le perline utilizzando un miscelatore Vortex per 15 secondi. Ripetere il lavaggio delle perline 10 volte e rimuovere il supernatante.
Elute proteine fino alle perline con l'aggiunta di 50 microlitri di 1X SDS tampone campione e far bollire il tubo a 98 gradi Celsius per 5 minuti. Centrifugare il tubo a 860xG 3000 RPM per 10 secondi e impostare il tubo su un separatore magnetico per un minuto. Raccogliere il supernatante e utilizzarlo come frazione associata.
Misurare le concentrazioni delle frazioni proteiche non legate e legate dal saggio proteico BCA. Visualizza le soluzioni di protien con blu bromofile e regola la concentrazione a 5 nanogrammi per microlitro per la pagina SDS. Separare le frazioni associate e non associate per pagina SDS utilizzando un gel gradiente 5-20%..
Macchia d'argento nel gel. Infine, western blot usando anticorpi primari e secondari appropriati secondo il manoscritto. Nei neuroni ippocampali coltivati, il TLCN era abbondantemente localizzato nei filopodi dendritici, nell'albero e nel soma e co-localizzato con F-actin.
Le perline codificate erano principalmente legate a dendriti e inducevano la formazione di tazze fagocitiche per accumulo di TLCN e F-actina su dendriti neuronali. Le immagini di Thorecense mostravano che la formazione di coppe fagocitiche dipendeva in modo cruciale dalla presenza di TLCN nei dendriti. Le tazze fagocitiche si sono formate solo su neuroni ippocampali di tipo selvaggio, ma non su neuroni ippocampali defficienti TLCN.
I risultati della pagina SDS hanno mostrato che i modelli di banda proteica erano quasi gli stessi per le frazioni non legate e legate, ma le intensità a 50 e 70 kilodalton, nella frazione legata erano inferiori a quelle della frazione non legata. Tuttavia, l'intensità della banda non era ovviamente diversa tra le frazioni non legate e legate preparate dai neuroni ippocampali di coltura defficiente TLCN. L'analisi western delle frazioni non legate e legate ha mostrato che TLCN e VN sono stati rilevati principalmente nella frazione associata.
Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 e Spectrin, sono stati rilevati sia nelle frazioni legate che in uscita. Moesin, PSD-95, alfa-actinina e alfa-tubulina sono stati rilevati nella frazione non vincolata. Se la proteina di rivestimento delle microperline cambia, questa procedura può essere applicata per identificare l'interazione del saggio.
Questa tecnica potrebbe identificare la proteina che lavora su sostanze artificiali. Quindi crediamo che il meccanismo della genesi artificiale possa essere quantificato. Crediamo che nuove proteine associate al disturbo mentale possano essere identificate dalla frazione ricca di filopodi dendritici.
E può essere esteso alla terapia.
