La cattura assistita acil-resina o Acyl-RAC è un metodo sensibile e affidabile che può essere utilizzato per rilevare la proteina S-acilazione in una varietà di campioni biologici. Questo protocollo ignora alcune delle limitazioni dell'etichettatura metabolica e dell'etichettatura radio, e consente il rilevamento simultaneo della S-acilazione di più proteine. Non solo cellule vive, ma anche tessuti primari e campioni congelati.
La s-acilazione può regolare una varietà di processi cellulari come il traffico proteico, il targeting della membrana plasmatica, la trasduzione del segnale, il trasporto del ferro e le interazioni proteina-proteina. È importante utilizzare una soluzione di idrossilammina preparata al momento con pH accuratamente regolato per ogni esperimento per garantire una scissione efficiente e specifica del legame tioestere. Con una dimostrazione di questo metodo è fondamentale per passi come il cloroformio, la precipitazione del metanolo.
Il pellet a forma di pancake ottenuto durante questo passaggio deve essere maneggiato con molta attenzione. Può essere fragile e la perdita parziale del campione durante il passaggio può portare a un recupero irregolare del campione. A dimostrare la procedura sarà Savannah West, una studentessa laureata del nostro laboratorio.
Per ottenere lisati cellulari, raccogliere le cellule di interesse in un tubo di centrifuga conico. E rimuovere eventuali detriti cellulari per centrifugazione. Lavare il pellet in 5 millilitri di PBS.
E ha immediatamente rimescolato le cellule in 600 microlitri di tampone di lysis appena preparato. Agitare il campione a 1.500 giri al minuto in un termo agitatore per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Prima di sgombrare il coperchio, il detersivo a pellet e il materiale solubile mediante centrifugazione.
Al termine della centrifugazione, raccogliere il lisato sgombrato in un tubo di microcentrifugo pre-raffreddato da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Ed eseguire un test dell'acido bradford o bicinchoninico per stimare la concentrazione proteica secondo protocolli standard. Aggiungere metanolo e cloroformio per il lysato con un rapporto 2:1.
Agitare rigorosamente per creare una sospensione omogenea e centrifugare il campione per raccogliere un pellet proteico all'interfaccia tra le fasi acquose e organiche. Inclinando il tubo, utilizzare un ago o una punta di caricamento del gel per aspirare il più solvente possibile. Asciugare all'aria il pellet proteico per alcuni minuti.
Prima di mescolare delicatamente il contenuto del tubo con 600 microlitri di metanolo, facendo attenzione a non rompere il pellet. Dopo aver rimosso con cura il lavaggio del metanolo, asciugare il pellet proteico su un piano di banco per circa cinque minuti. Successivamente, resuspend il pellet proteico in 200 microlitri di tampone 2SHB.
E vortice a 42 gradi Celsius e 1.500 giri al minuto in un termo agitatore. Quando il pellet viene sciolto, aggiungere al campione 200 microlitri dello 0,2%MMTS in 2SHB. E incubare la proteina per 15 minuti a 42 gradi Celsius e 1.500 giri al minuto in un termo shaker.
Alla fine dell'incubazione, eseguire precipitazioni di cloroformio-metanolo 3:4 come dimostrato. Per rimuovere l'MMTS, sciogliere il pellet in 100 microlitri di tampone 2SHB fresco con vortice. E diluire il campione con 300 microlitri di tampone A dopo ogni precipitazione.
Dopo la precipitazione finale, sciogliere i campioni in 200 microlitri di tampone 2SHB e diluire con 240 microlitri del tampone A.Misurare nuovamente la concentrazione proteica e mettere da parte 40 microlitri per ciascun campione come controlli di input. Dividere i campioni in due volumi uguali di 200 microlitri. E contrassegnare i tubi come più idrossilammina e meno idrossilammina.
Aggiungere 50 microlitri di idrossilammina molare neutra appena preparata a una concentrazione finale di 400 millimolare al tubo più idrossilammina. E 50 microlitri di cloruro di sodio molare neutro al controllo negativo, un tubo meno idrossilammina. Quindi aggiungere 30 microlitri di liquami di perline TS a ciascun tubo.
E ruotare i tubi per una o due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione lavare le perline quattro volte con 1%SDS nel tampone A per rimuovere eventuali idrossilammine residue. Dopo l'ultimo lavaggio, lavare tutti i campioni di perline con tre delicati microcentrifugazioni di un minuto.
Aspirando con cura i supernaganti e rimospendendo le perline in 500 microlitri di 1%SDS nel tampone A ad ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, girare delicatamente lungo le perline come dimostrato. E aspirare il più supernatante possibile senza disturbare le perline.
Per recuperare le proteine dalle perline, aggiungere 50 microlitri di tampone campione 4%SDS a ciascun tubo e incubare i campioni a 80 gradi Celsius e 1.500 giri al minuto per 15 minuti in un termo agitatore. Al termine dell'incubazione, lasciare raffreddare i campioni prima di centrifugare per pelletare completamente le perline. Quindi utilizzare una punta di caricamento del gel per trasferire le proteine eluite in nuovi tubi da 1,5 millilitri.
Ed eseguire i campioni su un gel SDS-PAGE per analizzare la S-acilazione delle proteine di interesse mediante gonfiore occidentale. La tirosina chinasi Lck può essere rilevata nei lisati trattati con idrossilammina molare neutra. per spezzare il legame tioestere tra i residui di cisteina e la moietà degli acidi grassi.
Lo stripping e il riprobing con anticorpi contro le proteine Fyn e LAT dimostrano che il saggio di cattura assistita da resina acile può essere utilizzato per analizzare la S-acilazione di più proteine contemporaneamente. Inoltre, la S-acilazione di Lck, Fyn e LAT può essere facilmente rilevata negli splenociti primari del topo. Indicando che questa modifica è conservata tra due specie.
Oltre all'identificazione di nuove proteine S-acilate, questo metodo può anche essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella S-acilazione proteica in diverse condizioni biologiche. Il numero di proteine S-acilate appena identificate è aumentato enormemente dopo che il doppio up ha significato una tecnica veloce e affidabile come Acyl-RAC. Oltre all'identificazione di nuove proteine S-acilate, questo metodo può anche essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella S-acilazione proteica in diverse condizioni biologiche.
